保山猪和杜洛克猪IGF-1基因的SNP筛选及生物信息学分析

李文君，富国文，龚绍荣，赵加鼎，李再磊，吴正明，周戚斌，赵桂英*

（ 1.云南农业大学动物科学技术学院，云南 昆明 650201 ；

2.云南省保山市保山猪研究所，云南 保山 678200 ）

胰岛素样生长因子1（IGF-1）是胰岛素样生长因子中的一员，位于5号染色体上，是由70个氨基酸组成的单链碱性多肽。IGF-1长度为80 kb，包含6个外显子，其中外显子1、2编码多个5"-UTR及信号肽，外显子3、4编码成熟蛋白肽链和E肽链的氨基酸，外显子5、6编码E肽羧基端延伸的16个氨基酸及相邻的3"-UTR[1-2]。由于IGF-1在不同物种间的单核苷酸多态性不同，进而影响该基因与动物不同生产性状间的关联性。肖超能等[3]发现，家兔IGF-1基因的第三外显子T365C位点上存在TT、TC和CC等3种基因型，表明IGF-1基因与家兔生长性能相关。牛志刚等[4]发现，新疆褐牛IGF-1/Sna BI位点上存在3种基因型，IGF-1/Nru I上存在两种基因型，但与新疆褐牛的体重和体型并无相关性。许金根等[5]发现，苏淮猪IGF-1基因的Hha I位点上存在3种基因型，其中AA型个体的育肥期平均日增重最高。李隐侠等[6]研究发现，苏淮猪的IGF-1基因也存在3种基因型，且以AA型个体的20日龄体重最高。由此可知，IGF-1基因会在一定程度上影响猪的日增重。保山猪是云南的优良地方猪种，具有耐粗饲、适应性强、产仔数多、母猪使用年限长、肉品质好等特点，但也存在生长速度慢、平均日增重较低等不足[7]。而杜洛克猪生长速度快、平均日增重较高。本试验选取生长性能明显不同的两个猪种，通过序列比对寻找IGF-1基因的单核苷酸突变位点，以进一步探究IGF-1基因对猪生长性能的影响机制。

1.1 试验材料

试验动物为保山市保山猪研究所提供的保山猪和昆明正邦公司提供的杜洛克猪。

移液枪（Eppendorf公司）、电泳仪（北京六一仪器厂）、微波炉（美的微波炉电器制造有限公司）、离心机（大龙兴创实验仪器有限公司）、应变控制式无侧限压力仪（沧州虹磊公路仪器有限公司）、水浴锅（常州隆和仪器制造有限公司）、梯度PCR仪（Applied BiosyABems公司）、电子分析天平（Sartorius有限公司）、压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、超纯水仪（成都康宁试验专业纯水设备厂）、天能凝胶成像系统（北京澎昆博远科贸发展有限责任公司）。

琼脂糖、TS-GelRed核酸凝胶染料、无水乙醇、DNA Markers、动物组织/细胞总DNA提取试剂盒、T3 Super PCR Mix、ddH2O、1×TAE速溶颗粒、6×Lonading Buffer均由北京擎科生物有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集采集保山猪耳组织80份、杜洛克猪耳组织30份，分别从中随机取保山猪、杜洛克猪各10份（公、母各半）耳组织样品用于本次试验。采集时对猪耳进行酒精消毒，采用耳样钳取小块组织，放入已灭菌的Eppendorf管中，加入75%乙醇，之后将样品放入液氮罐中运回实验室，放入-80 ℃超低温冰箱中保存。

1.2.2 DNA提取

利用北京擎科生物有限公司Trelief Animal Genomic DNA Kit动物基因组DNA提取试剂盒（通用型），参照说明书提取杜洛克猪和保山猪耳组织样品DNA。将已洗脱的DNA液放入-20 ℃，保存至待送样。

1.2.3 DNA纯度和浓度检测

使用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计对DNA样品进行测量，结果发现，所提样品DNA浓度在30~150 μg/L之间，OD260nm/OD280nm纯度值在1.7~1.9之间。

取5 μL DNA样品原液与1 μL上样缓冲液（Loading Buffer）混合均匀，置于1%的琼脂糖凝胶中，并以DNA Marker（分子量为2 000 bp）作参照，在110 V恒定电压中电泳30 min。提取后将凝胶取出，置于成像系统中，观察DNA条带，检测提取成功的DNA条带，并保存图片。

制备浓度为1%的琼脂糖凝胶方法：将1条速溶颗粒，用蒸馏水定容至1 L，制得1×TAE缓冲液；
称取1 g琼脂糖放入锥形烧瓶中，量筒取TAE溶液10 mL，加入90 mL去离子水，混合后倒入锥形瓶中，摇晃均匀；
加热至煮沸，冷却后二次加热至完全溶解，使液体清澈透亮无明显沉渣；
将制胶框放入制胶板中，水平放置，两端卡好，用合适大小的齿梳固定；
待凝胶冷却至可手持时，加入1~2 μL核酸染料，摇晃均匀，静置。将液体缓慢倒入制胶塑料板中，室温静置至完全凝固；
将胶板点样孔放置于靠近负极一端。

1.2.4 引物设计及合成

根据杜洛克猪IGF-1基因序列（GenBank登录号：NC_010447.5），使用Premier3.0软件进行引物设计，利用BLAST进行分析，选取评分最高的引物送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司进行引物合成。由于Exon3、Exon4、Exon6参与编码蛋白，故后续只对上述3个外显子进行分析。具体引物信息见表1。

表1 IGF-1基因各外显子引物设计Tab.1 Segmental amplification primer of IGF-1 gene"s each Exons

1.2.5 目的基因扩增

反应体系（25 μL）：参考北京擎科生物技术有限公司1.1×T3 Super PCR Mix试剂盒说明书，配制PCR反应液。Trans Taq PCR Super Mix溶液2.0 22 μL，forward primer、reverse primer、Template溶液各1 μL。

IGF-1基因的扩增条件：98 ℃预变性2 min；
98 ℃变性10 s，72 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，循环35次；
DNA保存温度为4~10 ℃。整个试验过程中为避免DNA降解，对条目基因扩增的全部操作过程均需要在冰板上完成。PCR扩增体系振荡混匀，快速分装入PCR管，逐个加入样品模板，盖紧管盖、标号，放置PCR扩增仪中进行扩增。

1.2.6 PCR产物测序及DNA序列生物信息学分析

PCR完成后，先取出5 μL产物和1 μL 6×Loading buffer，按5∶1比例混合，吹打均匀后，立即加样并在110 V电流条件下进行试验，在1.0%琼脂糖凝胶中跑胶30 min后，将凝胶置于成像系统中观察DNA条带，选取无拖带情况，单一且清晰的DNA条带，送至北京擎科生物技术有限公司昆明分公司进行测序，剩余部分-20 ℃保存。

DNA序列的生物信息学分析及相应软件见表2。

表2 生物信息学分析及相应软件Tab.2 Bioinformatics analysis and corresponding software

2.1 保山猪、杜洛克猪样本DNA提取结果（见图1、图2）

图1 保山猪DNA提取结果Fig.1 Results of Baoshan pig DNA extraction

图2 杜洛克猪DNA提取结果Fig.2 Results of Duroc pig DNA extraction

由图1、图2可知，DNA的条带无拖带，清晰而有条理，符合PCR扩增试验的要求，与预期的扩增片段相符，可用于后续试验。

2.2 保山猪、杜洛克猪IGF-1基因的PCR扩增结果（见图3~图5）

图3 部分猪IGF-1基因Exon3扩增结果Fig.3 Amplification results in Exon3 of IGF-1 gene in some breeds

图4 部分猪IGF-1基因Exon4扩增结果Fig.4 Amplification results in Exon4 of IGF-1 gene in some breeds

图5 部分猪IGF-1基因Exon6扩增结果Fig.5 Amplification results in Exon6 of IGF-1 gene in some breeds

分别对IGF-1基因所选的3个外显子（Exon3、Exon4、Exon6）进行扩增，各取合格的DNA提取物5~6 μL与1 μL（6×Loading buffer）混匀，经1.0%琼脂多糖凝胶电泳。

由图3~图5可知，Exon3、Exon4、Exon6经PCR扩增后分别为151、182、162 bp，条带清晰明亮，符合测序要求。

2.3 保山猪和杜洛克猪IGF-1基因SNP检测结果（见图6~图10、表3）

NCBI数据库中参考基因（登录号：IGF-1基因NC_010447.5）CDS区所对应的Exon3、Exon4、Exon6编码序列与本检测结果进行序列比对，以此检测SNP位点。

由图6~图10可知，在保山猪和杜洛克猪IGF-1基因的Exon3、Exon6编码序列上均未发现突变位点。在保山猪Exon4的编码序列上发现1个SNP位点，由G突变为A，位于189 bp处，命名为G189A。

图6 IGF-1基因Exon3测序结果比对Fig.6 Comparison of sequencing results in Exon3 of IGF-1 gene

图7 IGF-1基因Exon4测序结果比对Fig.7 Comparison of sequencing results in Exon4 of IGF-1 gene

图8 IGF-1基因Exon4多态位点测序峰Fig.8 Polymorphism sequencing peak in Exon4 of IGF-1 gene

图9 IGF-1基因Exon4氨基酸序列突变前后对比结果Fig.9 Comparison of Exon4 amino acid sequence of IGF-1 gene

图10 IGF-1基因Exon6测序结果比对Fig.10 Comparison of sequencing results in Exon6 of IGF-1 gene

但由于密码子具有简并性，该突变位点未对氨基酸序列造成改变，即为同义突变，突变前后均为编码丙氨酸（Ala）。分析统计结果见表3。

表3 IGF-1基因SNP检测结果Tab.3 SNP test results of IGF-1 gene

2.4 保山猪IGF-1蛋白生物信息学分析

通过对保山猪和杜洛克猪测序结果比对，检测IGF-1基因的核苷酸多态性。

由于只有保山猪在IGF-1基因编码区发生了突变，故只针对保山猪发生的同义突变进行生物信息分析。

保山猪IGF-1基因CDS区长度为495 bp，编码164个氨基酸，与预期的目的条带一致，编码蛋白的分子式为C782H1265N247O239S11，原子总数为2 544，分子量为183 03.82，理论等电点（pI）为9.89，估计半衰期为30 h，不稳定性指数为73.25（大于40），属于不稳定性蛋白，脂肪族指数为45.30，亲水性（重力）平均值为-0.957。

由表4可知，氨基酸残基中负电荷残基（Asp+Glu）总数为14，正电荷残基（Arg+Lys）总数为30。20种常见氨基酸组成中精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）数目最多为15个，各占全部氨基酸组成的9.10%，色氨酸（Trp）数目最少，为0。

表4 IGF-1蛋白组成比例Tab.4 Protein composition ratio of -IGF-1 gene

2.4.1 保山猪IGF-1蛋白疏水性/亲水性的分析与预测（见图11）

由图11可知，利用在线软件对保山猪IGF-1蛋白的疏水性/亲水性进行分析，结果为：第13位丙氨酸（Ala）疏水性最强（最高值2.756）；
第154位赖氨酸（Lys）亲水性最强（最低值-3.556）。其总平均值为-0.954 7，表明保山猪IGF-1基因蛋白的亲水区大于疏水区，该氨酸序列亲水性残基多于疏水性残基，亲水氨基酸所占比例（65.00%），整体表现为亲水性，预测此蛋白为可溶性蛋白。

图11 保山猪IGF-1蛋白疏水性/亲水分析与预测Fig.11 Analysis and prediction of hydrophobicity/hydrophilicity of IGF-1 in Baoshan pigs

2.4.2 保山猪IGF-1蛋白结构分析与预测（见图12）

由图12可知，保山猪IGF-1基因跨过膜外的蛋白数量为0，存在膜内蛋白结构的概率为0.227 15。预测保山猪IGF-1蛋白可能存在膜内蛋白结构，但不存在跨膜结构。

图12 保山猪IGF-1蛋白结构预测Fig.12 Prediction of IGF-1 gene transmembrane protein structure in Baoshan pigs

2.4.3 保山猪IGF-1蛋白信号肽的分析与预测（见图13）由图13可知，利用在线软件对保山猪IGF-1基因蛋白信号肽（signal peptide，SP）进行分析，发现最大C值、Y值和S值分别为0.867、0.850和0.981，D值为：0.883，存在信号肽的概率为0.999。信号肽可能在25~26位点之间，概率为0.760。预测保山猪IGF-1基因蛋白属于分泌蛋白。

图13 保山猪IGF-1蛋白信号肽的分析与预测Fig.13 Prediction of IGF-1 gene signal peptide in Baoshan pigs

2.4.4 保山猪IGF-1蛋白二级结构分析与预测（见图14）由图14可知，保山猪IGF-1蛋白由164个氨基酸组成，二级结构类型占比为：无规则卷曲99个，占60.37%；
α-螺旋65个，占39.63%；
无β-折叠。预测保山猪IGF-1蛋白稳定性低，保山猪IGF-1蛋白为混合型二级结构。

图14 保山猪IGF-1基因蛋白二级结构分析预测Fig.14 Analysis and prediction of secondary structure of IGF-1 gene protein in Bao Shan pigs

2.4.5 保山猪IGF-1蛋白三维结构（见图15）

图15 保山猪IGF-1蛋白三维结构Fig.15 3D map of IGF-1 proteins

蛋白质的三维结构的解析对深入理解蛋白质功能和生理现象起到决定性作用，研究三级结构利于认识蛋白基本机构和预测其性质。

由图15可知，保山猪IGF-1基因预测模型覆盖度为0.43，序列相似度为0.63，全球模型质量估计（GMQE）可信度为0.27，GMQE评分在0~1区间内数字越大，建模可信度越高。评估待测蛋白与模板蛋白的匹配度QMEAN为-1.15，QMEAN评分越接近0，表明模型蛋白结构和相似大小的试验蛋白结构的匹配度越好。预测该模型与保山猪IGF-1基因的蛋白结构模型具有较好的一致性。

IGF-1基因多态性已经在多个不同的物种中得到研究，且覆盖IGF-1基因不同区域的单核苷酸多态性位点。研究表明，IGF-1在动物生长发育中起到重要的调控作用[8]。本研究结果发现，只有保山猪在编码蛋白的外显子上有1个SNP位点（Exon4-G189A），而杜洛克猪没有突变位点。保山猪的突变位点位于编码区，虽发生了碱基突变，但所编码的氨基酸并未发生改变，突变前后的氨基酸均为丙氨酸（Ala），故为同义突变，造成这一结果的原因可能是密码子具有简并性。突变位点仅出现在保山猪上，推测原因可能是杜洛克为外来猪种，与参考序列相似度高。有研究结果表明，IGF-1基因核苷酸序列相对保守，其遗传变异具有种属特异性[9]。Gao等[10]敲除小鼠IGF-1基因，导致小鼠肌肉发育受阻。Han[11]和Mathews等[12]研究表明，IGF-1基因可调控人和小鼠的肌肉发育过程。但IGF-1基因是否对保山猪生长和发育具有调控作用，还有待进一步进行关联性研究。

本研究中，生物信息学分析结果显示保山猪IGF-1基因的编码蛋白半衰期为30 h，不稳定系数为73.25（＞40），属于不稳定性蛋白。贾浩等[13]研究发现，蛋白质半衰期长短与其稳定性存在一定相关性，即蛋白稳定性低则半衰期短。氨基酸总平均分值是影响蛋白质的亲疏水性质的主要因素，总平均分值越低，亲水性越强[14]。在IGF-1基因编码氨基酸肽链蛋白中，亲水区占65%，且氨基酸总平均分值为-0.954 7，故推测其为可溶性蛋白质，二级结构容易亲水。蛋白质的亲水性/疏水性可为蛋白质跨膜区域的鉴定提供参考，氨基酸的疏水性可反映蛋白质的折叠情况，在潜在的跨膜区域会出现疏水区。本试验中未出现跨膜区域，但存在少量的膜内蛋白区域，其无跨膜结构是否与IGF-1基因蛋白质疏水基团少有关还需进一步研究。信号肽是一段能够引导蛋白转移到周质空间的短肽链[15]。保山猪IGF-1基因编码蛋白上有信号肽存在，且最可能出现在25~26位点之间。信号肽的H区以疏水氨基酸为主，疏水性的强弱会影响前体蛋白加工和转运的速率[16]。IGF-1编码蛋白为亲水性蛋白，是否影响前体蛋白加工和转运速率仍需进一步探究。

通过对蛋白二级、三级结构进行分析有助于预测蛋白质的空间结构和功能。保山猪IGF-1基因编码的蛋白质二级结构中只存在α-螺旋和无规则卷曲，故推测该基因编码蛋白的二级结构为混合型，其中α-螺旋占39.63%，无规则卷曲占60.37%。无规则卷曲容易受到侧链的影响，进而改变蛋白质空间构象，导致蛋白质功能改变[17]。无规则卷曲在二级结构中所占比例较大，但是否会影响编码蛋白的功能还需进行研究验证。本试验通过在线软件建立的预测模型与IGF-1基因的蛋白模型具有一致性，但匹配度不太高，可能是由于在线软件中可参考的数据较少，得出的最佳匹配度是与人类IGF-1基因的蛋白结构进行分析，相同基因在不同物种间的蛋白结构存在差异，若能够参考猪IGF-1基因的蛋白结构进行分析，两者之间的匹配度可能会进一步提高。

本研究结果表明，IGF-1基因在物种进化过程中高度保守，使其编码保山猪和杜洛克猪的氨基酸序列相同，蛋白质结构和功能差异很小或不存在差异，能否作为调控保山猪瘦肉少、脂肪多、生长慢的候选基因还需进行关联性的研究加以验证。

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