柴胡皂苷a,对肝郁脾虚型抑郁症大鼠海马Notch信号通路的神经保护作用研究

王 君，薛 哲 ，刘玥芸，李同同，于 雪， 陈家旭

(北京中医药大学 中医学院，北京 102446)

抑郁症是目前常见的心理疾病之一，临床特征表现为情绪低落、思维迟缓、活动减少、兴趣丧失为主，多数还伴有体质量减轻、食欲下降等躯体症状[1]。据不完全统计，目前全球抑郁症患者约有3.5 亿[2]，WHO 预测抑郁症将会成为仅次于缺血性心脏病的世界第二大慢性疾病[3]。抑郁症具有较高的发病率，对患者带来严重的影响。柴胡皂苷a是从中药柴胡中提取出来的一种生物活性成分[4]。近年来，有关柴胡皂苷a 的抗抑郁作用及药理作用机制的研究成为热点。有研究表明柴胡皂苷a 可以通过上调海马区 5-HT 、NE、DA 等单胺类神经递质的含量来改善抑郁样行为[5-6]，还可以通过促进脑内神经营养因子的表达水平缓解脑缺血抑郁症状[7]。与抑郁症发病关系密切相关的信号传导通路——Notch 信号通路，对神经细胞的增殖、再生及分化有着重要的调控作用。因此，本研究从 Notch 信号通路切入，研究探讨柴胡皂苷a 对肝郁脾虚型抑郁症大鼠模型的影响变化及内在的调节机制。

1.1 实验动物

SPF 级48 只健康雄性SD 大鼠，体质量为 220 ～250 g ，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXK（京）2016-0011 。所有大鼠均饲养于北京中医药大学动物房。日常常规喂养大鼠饲料，自由饮用纯净水，室温为（22±2）℃，光照正常昼夜节律，保持动物室安静。

1.2 实验试剂与仪器

盐酸氟西汀胶囊（批号：B20146，礼来苏州制药有限公司）；
柴胡皂苷 a（批号：B20146，纯度≥98%，规格：100 mg，上海源叶生物科技有限公司）；

大鼠束缚架（自制）；

苏木精-伊红染色液（北京雷根生物技术有限公司）；
樱花冷冻切片包埋剂（Sakura）；

TRIzol®Reagent（Invitrogen）；
MMLV Reverse Transcriptase RNaseH（TOYOBO）；
dNTPs（Genview）；
Agarose 琼脂糖（Genview）；
NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus（NOVOPROTIN）；

超 敏ECL 化学发光试剂盒、 彩色凝胶快速试剂盒（新赛美）；

蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒（凯基）；
Beta Tubulin Antibod（批号：10068- 1-AP）、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG（批号：SA00001-2）、HRP-Goat Anti-Mouse IgG（批 号：SA00001-1）、Rabbit anti Notch 1 Polyclonal antibody （批号：10062-2-AP）、蛋白预染marker（10-180kda）（批 号：PL00001-250μL×2）均购于美国Proteintech 公司；
Jagged 1 抗体（Santa，批号：sc-390177）；
Anti-Hes1 抗体（abcam，批号：ab 108937）；
Etho vision 3.0 分 析 软 件（Noldus）；
Tanon-5200 型分析系统 （美国Bio-rad 公司）；
PRISM 7500 型荧光定量 PCR 仪（美国ABI）；
WD-9413 型凝胶成像分析仪（北京六一）；
EG1150H 型石蜡包埋机、RM2245 型石蜡切片机均购于德国Lecia；
BIORAD 型电泳仪（美国 Bio-rad 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 SPF 级动物房适应性饲养1 周后，按照体质量随机数字标法将大鼠分为4 组，分别为正常组、模型组、柴胡皂苷a 组、氟西汀组，每组12 只，各分组中每3 只大鼠喂养于同一个鼠笼内。

1.3.2 造模与给药 造模方法是对除正常组外的各分组大鼠进行21 d 的慢性束缚应激。根据课题组已建立的具体方法[8-9]，将大鼠呈俯卧位束缚于特制的T 型束缚架上，用可调的软带分别固定在大鼠的腋下部、大腿根部以限制其自由活动，每日3 h ，束缚时间随机进行，连续21 d。正常组不作任何处理，自由常规饲养。从造模第1 天开始, 按人体用药量换算成大鼠等效剂量作为大鼠用药量。灌胃容积为10 mL/kg。参考文献[10]用量，柴胡皂苷a 组灌服柴胡皂苷a 溶液，给药量为50 mg/kg；
氟西汀组灌服氟西汀溶液，给药量为2 mg/kg。灌胃于每次束缚后0.5 h 进行。正常组及模型组灌服等体积的纯净水。

1.3.3 模型评价 （1） 一般宏观体征 每次灌胃及束缚刺激前观察各组大鼠的精神状况、毛发色泽、大便排泄、活动灵敏及反应度、灌胃和束缚时的反抗挣扎情况等。（2） 体质量 造模开始后于第 0 、7、14、21 天的固定时间称量各组大鼠体质量，进行统计学分析。（3） 进食量 分别在第7、14、21 天的前一天同一时间给予一定量的饲料放置于大鼠笼中，24 h 后称量每只鼠笼中所剩余的饲料。计算两日称量后的差值，然后除以每笼中大鼠只数，即为每只大鼠的每日进食量。（4） 糖水偏好实验 造模第19 天时，每只大鼠给予2 瓶1%糖水，训练时间为24 h。造模第20 天时，每只大鼠给予1 瓶1%糖水，1 瓶纯净水，持续时间为24 h。造模第21 天时，每只大鼠均禁食禁水24 h。实验第22 天时，给予每只大鼠1 瓶1%糖水，1 瓶纯净水。3 h 后称重计算每只大鼠的纯净水、1%糖水的消耗量，得出各只大鼠的糖水消耗率。糖水消耗率 （%） = 糖水消耗量 （mL） /[糖水消耗量 （mL） +纯净水消耗量 （mL）]×100%。（5） 旷场实验 木质旷场箱长100 cm 、宽100 cm 、高40 cm，底面为黑色，内侧壁为蓝色。正上方安置有摄像头。保证实验室周围环境安静、隔离干扰，在四周有全封闭的遮光帘，杜绝任何参照物的条件下进行实验。实验前先将大鼠在测试实验室内适应0.5 h。每次观察结束取出大鼠后，及时清理排泄物，用低浓度乙醇喷洒避免残留味造成干扰。计算大鼠5 min内的站立、修饰、进入中央区次数及运动总距离。

1.3.4 取材 造模结束，行为学实验（糖水偏好和旷场实验）完成后，立即取材。取材当天采用现配的 10%水合氯醛（0.4 mL/ 100 g） 腹腔注射麻醉大鼠，然后将大鼠呈仰卧位固定，给予0.9%NaCl 溶液和4%多聚甲醛固定液进行心脏灌注。迅速断头大鼠，冰上取脑。每组6 只取全脑用于HE 染色，6 只分离出海马组织用于Western Blotting 和RT-PCR 检测蛋白基因表达情况。全脑组织置于4%多聚甲醛溶液中固定。取出的海马组织放入冻存管后立即置于液氮中，待全部取材结束后放入-80℃冰箱保存备用。

1.3.5 HE 染色 大鼠脑组织在4%多聚甲醛溶液中充分固定48 h 后进行乙醇逐级脱水。冰上操作滴加石蜡液，包埋脑组织。将包埋好的蜡块固定于切片机，厚度为4 ～ 5μm。石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、乙醇中梯度脱蜡、水化。切片浸入苏木素染液，自来水清洗再浸入1%盐酸乙醇进行分化，自来水再次清洗，返蓝液进行返蓝，自来水流水冲洗。然后将切片浸入伊红染液中染色，再把切片依次放入乙醇、二甲苯Ⅰ 、二甲苯Ⅱ进行透明，最后中性树胶封片。显微镜下观察染色结果。

1.3.6 蛋白免疫印迹 根据试剂盒说明书操作提取和测定蛋白含量。依据目标蛋白分子量大小进行制胶。上样样本体积为10 μL。在上样孔两边加入5 μL marker 作参考。多余的孔加1×loading buffer。电泳、电转后5%脱脂牛奶封闭。4℃过夜孵育一抗，室温孵育二抗。滴加显色液，使用 Tanon-5200 分析系统进行曝光并保存好图像。采用Image J 分析所得到的蛋白条带，比较目标蛋白灰度值/内参灰度值得出各蛋白表达含量。

1.3.7 实时荧光定量PCR 首先根据实验步骤对海马组织中的总RNA 进行提取及浓度测定。以总RNA为模板，根据invitrogen 反转录试剂盒说明书操作进行cDNA 的合成。从GenBank 获得目的基因 mRNA的全长序列，利用引物和探针设计软件 Primer 5.0 设计引物序列。然后进行实时荧光定量 PCR 反应。用2-ΔΔCT相对定量法计算CT 值得出各基因表达含量。引物信息见表1。

表1 引物信息Tab. 1 Primer information

1.4 统计学方法

用 SPSS 20.0 软件进行数据分析。计量资料用均数±标准差 （±s） 表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.1 一般宏观体征

整个造模束缚开始前，观察发现各组大鼠均精神状态良好、动作灵敏、活泼好动，毛发润滑有光泽，接近无明显抵触性行为，大小便排泄正常。束缚前期 （束缚7 d） 造模各组大鼠挣扎比较剧烈，反抗动作幅度大，情绪较为亢奋易激惹，甚至有撕咬束缚架而挣脱逃跑的现象，灌胃操作比较困难，束缚中期（束缚14 d） 模型组对束缚刺激及灌胃操作反抗力度减弱。与其余造模组比较，模型组体质量明显降低，精神状态更为欠佳。柴胡皂苷 a 组、氟西汀组一般状态要优于模型组，大鼠动作较为灵活，但较正常组仍有区别；
束缚后期 （束缚21 d） 模型组大鼠精神颓废萎靡，对束缚刺激及灌胃反抗度更小，毛发表现为大片的粗糙、凌乱、暗淡无光泽，甚至有部分脱毛现象。成团蜷缩于笼子角落，动作行为明显缓慢。大便质地稀软，甚至偶有排泄水样便。柴胡皂苷a 组、氟西汀组状态好于模型组，仅有少量毛发暗淡，双目仍较为有神，大便成形，灌胃操作仍有较为明显的抵抗倾向。

2.2 体质量变化

第7、14、21 天，与正常组相比，模型组大鼠体质量均明显降低 （P＜0.01），与模型组相比，柴胡皂苷a 组、氟西汀组体质量均明显上升（P＜0.01），见表2。

表2 各组大鼠体质量变化情况 （g，±s ，n = 12）Tab. 2 Weight change of rats in each group（g，±s ，n = 12）

表2 各组大鼠体质量变化情况 （g，±s ，n = 12）Tab. 2 Weight change of rats in each group（g，±s ，n = 12）

注：模型组与正常组比较，ΔΔP ＜0.01；
给药组与模型组比较，**P ＜0.01。

组别 第0 天 第7 天 第14 天 第21 天正常组 263.25±5.69 302.83±4.06 342.83±5.92 381.42±3.75模型组 265.33±6.34 292.33±4.94ΔΔ 316.42±4.19ΔΔ 345.58±6.47ΔΔ柴胡皂苷a 组 264.92±6. 14 299.75±3.49** 338.75±5.24** 377.42±6.69**氟西汀组 263.92±5.40 300.17±4.02** 339.25±5.19** 377.08±5.12**F 0.308 14.051 65.332 104.660 P 0.819 0.000 0.000 0.000

2.3 进食量变化

第14 天，模型组大鼠进食量明显低于正常组（P＜0.01），氟西汀组进食量较模型组增加（P＜0.05） 。第21 天，与正常组相比，模型组大鼠进食量明显降低（P＜0.01），与模型组相比，柴胡皂苷a 组、氟西汀组进食量增加（P＜0.01），见表3。

表3 各组大鼠进食量变化情况（g，±s ，n = 12）Tab. 3 Changes of rats in each group（g，±s ，n = 12）

表3 各组大鼠进食量变化情况（g，±s ，n = 12）Tab. 3 Changes of rats in each group（g，±s ，n = 12）

注：模型组与正常组比较，ΔΔP ＜0.01；
给药组与模型组比较，**P ＜0.01。

组别 第 7 天 第 14 天 第 21 天正常组 20.04±0.32 19.68±0.31 20.35±0.51模型组 19.30±0.33 18.79±0.32ΔΔ 18.58±0.50ΔΔ柴胡皂苷a 组 19.53±0.17 19.23±0.45 19.67±0.40**氟西汀组 19.67±0.49 19.41±0.39** 19.81±0.49**F 3.284 4.079 9.506 P 0.058 0.033 0.002

2.4 糖水偏好实验

通过比较正常组、药物干预组大鼠与模型组大鼠糖水总消耗量、糖水偏好率的差异以判断其快感缺失和行为绝望程度。抑郁症的诊断中，心境低落和愉快感缺失的持续存在是相当重要的判断指标[11]。结果表明：与正常组相比，模型组大鼠糖水偏好率明显降低（P＜0.01）；
与模型组相比，柴胡皂苷a 组、氟西汀组糖水偏好率明显升高（P＜0.01）。说明模型组大鼠出现了快感缺失等抑郁样情绪，而柴胡皂苷a、氟西汀均可改善其抑郁情绪，见表4。

表4 各组大鼠糖水偏好情况 （±s ，n = 12）Tab. 4 Sugar water preference of rats in each group（±s ，n = 12）

表4 各组大鼠糖水偏好情况 （±s ，n = 12）Tab. 4 Sugar water preference of rats in each group（±s ，n = 12）

注：模型组与正常组比较，ΔΔP ＜0.01；
给药组与模型组比较，**P ＜0.01。

组别 糖水偏好率/%正常组 71.66±4.47模型组 57.05±5.59ΔΔ柴胡皂苷 a 组 69.28±4.92**氟西汀组 70.85±3.84**F 24.982 P 0.000

2.5 旷场实验

旷场实验通过观察动物探究行为可以很好的发现动物的情绪变化及状态，同时也是检验抗抑郁药物疗效的常用行为学指标[12]。结果表明：与正常组相比，模型组大鼠站立、修饰、进入中央区次数及运动总距离均明显减少 （P＜0.01） ；
柴胡皂苷a 组、氟西汀组与模型组相比，各项指标均有所提高 （P＜0.05或P＜0.01） 。说明模型组大鼠出现了探究行为和活动量减少、好奇心降低、对周围关注度下降等抑郁样症状，柴胡皂苷a 组、氟西汀均可逆转上述症状变化，见表5。

表5 各组大鼠旷场实验情况（n = 12）Tab. 5 The absenteeism experiment of rats in each group（n = 12）

2.6 HE 染色

正常组大鼠海马区神经细胞数量较多，排列整齐，染色均匀，结构正常，边界清晰。模型组大鼠海马区神经细胞数量明显减少，结构不清晰，细胞核变小、深染，分布凌乱，边界模糊。柴胡皂苷a 组、氟西汀组较模型组神经细胞数量较多，分布相对整齐，细胞结构基本正常，少部分细胞核变小，见图1。

2.7 蛋白免疫印迹

与正常组相比，模型组大鼠 Notch 1 、Jagged 1、Hes 1 蛋白表达均降低 （P＜0.01）。在 Hes1 蛋白表达中，柴胡皂苷a 组与模型组相比，明显增高（P＜0.01）。在Jagged 1 蛋白表达中，柴胡皂苷a 组、 氟西汀组与模型组相比，明显增高（P＜0.01）；
给药组与正常组相比，差异仍具有统计学意义（P＜0.01），提示柴胡皂苷a调节作用可能比较局限，见图2、图3。

图2 Western Blotting 条带图Fig. 2 Western Blotting strip plot

图3 各组大鼠蛋白表达情况 （n = 6）Fig. 3 Protein expression in each group （n = 6）

2.8 实时荧光定量PCR

与正常组相比，模型组大鼠Notch 1、Jagged 1、Hes1基因表达均降低（P＜0.01）。在Notch 1、Hes1基因表达中，柴胡皂苷a 组、氟西汀组与模型组相比，明显增高（P＜0.01），见表6。

表6 各组大鼠 Notch 1 、Jagged 1 、Hes 1 基因表达情况（ ±s ，n = 6）Tab. 6 Gene expression of Notch 1, Jagged 1 and Hes 1 in each group（ ±s ，n = 6）

表6 各组大鼠 Notch 1 、Jagged 1 、Hes 1 基因表达情况（ ±s ，n = 6）Tab. 6 Gene expression of Notch 1, Jagged 1 and Hes 1 in each group（ ±s ，n = 6）

注：模型组与正常组比较，ΔΔP ＜0.01；
给药组与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

组别 Notch 1 Jagged 1 Hes 1正常组 1.02±0.20 1.08±0.44 1.02±0.26模型组 0.64±0.13ΔΔ 0.57±0.12ΔΔ 0.59±0.06ΔΔ柴胡皂苷a 组 0.88±0.03** 0.84±0.06 0.89±0.12**氟西汀组 0.90±0.03** 0.86±0.12* 0.90±0.13**F 10.467 4.625 8.225 P 0.000 0.013 0.001

本研究采用慢性束缚应激方法复制肝郁脾虚型抑郁大鼠模型，发现 21 d 造模结束后，慢性束缚应激模型组大鼠体质量、进食量、糖水偏好率、站立次数、修饰次数、进入中央区次数及运动总距离均明显减少（P＜0.01），与此前相关文献报道一致[13]。有研究表明柴胡皂苷a 可以提高慢性应激抑郁模型大鼠的体质量、糖水偏好性，减少旷场实验中中央区运动时间[10]，本研究中也出现了类似结果。柴胡皂苷a进行干预处理后，上述抑郁样症状变化均有不同程度的逆转，提示柴胡皂苷a 可能确实具有一定的抗抑郁调节作用。

海马在获取和消退记忆过程中具有重要作用，其功能、结构的异常会直接导致学习与认知方面的功能障碍以及焦虑抑郁等不良情绪的发生[14]。有研究发现慢性应激时会导致海马体积缩小、海马神经元受损，可具体体现为海马CA1 区、CA3 区神经元的萎缩和数目减少[15]。观察HE 染色结果，可以发现慢性束缚应激模型大鼠海马区出现了神经细胞稀疏、排列松散等病理变化。已有研究证明，慢性应激会导致抑郁模型大鼠海马神经元细胞体积减少、萎缩等，本研究结果与之吻合[16]。

Notch 信号通路在包括哺乳动物在内的多个物种中表达，对器官、组织的发育过程起调控作用，可调控细胞的发育、增殖、分化及凋亡等过程[17]。有研究表明Notch 信号通路上的重要配体Jagged 1 与受体 Notch 1 结合后，会经由一系列的信号传导而最终激活下游效应靶基因如Hes1、Hes5，从而调控整个细胞的增殖与分化能力[18]。柴胡皂苷a 是中药柴胡中的有效活性成分之一，具有一定的抗抑郁作用。研究发现柴胡皂苷a 可以通过抑制慢性应激方法制备的抑郁症模型大鼠海马区神经细胞的凋亡来发挥抗抑郁作用[19]。但涉及到柴胡皂苷a 调节神经细胞的相关具体信号通路尚不明确，其中Notch 信号通路是否在参与其中的研究报道也较少。

本研究发现模型组大鼠Notch 1、Jagged 1、Hes1基因及蛋白表达水平均明显下降（P＜0.01），说明慢性应激状态下，Notch 信号通路传导受抑制。柴胡皂苷a 灌胃干预后，Notch 信号通路分子表达增加，提示柴胡皂苷a 可能通过上调 Notch 信号通路上信号分子蛋白基因的表达，从而保护海马神经细胞，改善肝郁脾虚抑郁症状。Notch 信号通路可能是柴胡皂苷a发挥神经细胞保护作用从而抗抑郁的作用靶点之一。

慢性束缚应激会导致抑郁样行为的改变，可以成功模拟出肝郁脾虚型抑郁症动物模型，同时慢性应激状态下会出现大鼠海马区一定程度的神经损伤，Notch信号通路上各分子表达下调，通路传导受抑制。而柴胡皂苷a 干预处理后，可以明显改善肝郁脾虚抑郁样症状，其抗抑郁治疗作用的发挥可能与激活Notch 信号通路调节各分子表达水平来保护海马神经细胞有关。本研究可为柴胡皂苷a 的抗抑郁作用提供新的证明，丰富相关的实验数据。

猜你喜欢 柴胡皂苷氟西汀糖水 柴胡总皂苷的大鼠体内代谢特征谱研究遵义医科大学学报(2023年1期)2023-02-06趣说“糖水不等式”初中生学习指导·中考版(2021年2期)2021-09-10下火秘方 荔枝核糖水今日农业(2020年13期)2020-12-15在广东，有糖水的夏天才算真正的夏天时代邮刊(2019年16期)2019-07-30泽兰多糖水提工艺的优化中成药(2018年12期)2018-12-29HPLC-CAD法测定不同产地柴胡药材中柴胡皂苷中成药(2018年4期)2018-04-26一测多评法同时测定消癥微丸中4种柴胡皂苷中成药(2017年8期)2017-11-22氟西汀通过增加阿尔茨海默病APP/PS1转基因小鼠脑内乙酰胆碱的含量改善其空间学习能力中国组织化学与细胞化学杂志(2017年1期)2017-06-15UPLC-QTof-MS 测定不同提取条件下柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的转化规律天然产物研究与开发(2014年5期)2014-01-09酸枣仁汤加失笑散联合盐酸氟西汀胶囊治疗心脏神经官能症37例中医研究(2013年9期)2013-03-11