原发性不孕患者行早期补救ICSI和常规ICSI的临床应用分析
时间：2023-03-27 08:15:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
任晶辉，土增荣，高瑞璠，段瑞云
(山西医科大学，太原 030000)
在全球范围内，随着环境恶化、人们工作及生活压力增大，不孕症的发生率不断提升。女性不孕症根据是否有妊娠史可以分为原发性不孕症和继发性不孕症，原发性不孕在不孕症中的比例约为60%[1]。原发性不孕患者不孕原因较为复杂且潜在不孕因素较多，使用传统的体外受精(IVF)技术，其受精失败及受精率低的概率较高[2]。
卵胞浆内单精子注射(ICSI)和早期补救ICSI(r-ICSI)是提高受精率的常用方式。ICSI是绕过透明带、卵膜和细胞器，将选定的单个精子直接注入取出的每个卵母细胞的辅助生殖技术(ART)[3]，其可以避免精子和卵子的融合缺陷所造成的完全受精失败，大大提高了受精率。然而，ICSI为侵入性操作且价格相对较高，因此主要用于严重男性因素不育、不明原因不孕以及IVF反复受精失败的患者。早期r-ICSI与常规ICSI受精原理相同，但在时间上有所差异。早期r-ICSI是指精子与卵子共孵育6 h后用显微镜观察卵母细胞中的第二极体，对未排出第二极体的卵母细胞，进行r-ICSI，使未受精的卵母细胞再次受精[3]，从而提高受精率。
常规ICSI和早期r-ICSI均能提高受精率，然而关于常规ICSI与早期r-ICSI的临床结局尚存在争议[4-6]。且目前关于早期r-ICSI和常规ICSI对于原发性不孕女性临床结局影响的研究较少。因此，本研究通过回顾性分析，探讨早期r-ICSI和常规ICSI对原发性不孕女性临床结局的影响，以期为这些患者寻找最佳的辅助生殖技术提供一定参考。
一、研究对象
收集2017年12月至2021年6月于本院行常规ICSI治疗或因IVF全部/部分受精失败行早期r-ICSI治疗的原发性不孕患者的临床资料。
纳入标准：(1)夫妻双方为从未有过妊娠史的原发性不孕不育患者；
(2)男方精液符合2010年世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)检查标准，可用于ICSI/早期r-ICSI；
(3)女性年龄<35岁；
(4)所有患者均行ICSI或早期r-ICSI授精；
(5)均行新鲜周期卵裂期胚胎移植；
(6)所有ICSI/早期r-ICSI后妊娠的夫妇随访到新生儿出生。
排除标准：(1)着床前行遗传学诊断、卵母细胞体外成熟(IVM)的周期，为冷冻卵母细胞或冷冻精子者，经穿刺取精或为捐赠者卵母细胞或捐赠者精子者；
(2)女性患有高血压、糖尿病、心脏疾病或甲状腺疾病，合并子宫异常及其他可能对ART治疗或妊娠产生不利影响的疾病。
根据纳入与排除标准，研究共纳入479例患者(479个周期)，对所有患者的一般资料、实验室指标和妊娠结局进行回顾性分析。
二、研究方法
2.促排卵方案：控制性促排卵方案根据患者情况的个体差异进行调整。采用常规促排卵方案，主要有激动剂方案、拮抗剂方案、微刺激方案以及高孕激素状态下促排卵方案等。经阴道超声监测不同时期卵泡的生长情况，当至少有1个卵泡直径≥18 mm或2个卵泡直径≥17 mm或3个卵泡直径≥16 mm时，当晚肌肉注射HCG(珠海丽珠医药)6 000～10 000 U，36～38 h后在阴道超声引导下进行穿刺取卵。
3.精液处理：男方禁欲3～5 d，取卵日手淫取精。参照2010年世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)对液化后的精液进行精液常规分析。采用Pureception密度梯度离心法联合上游法处理精液后，置于36.5℃、6%CO2培养箱中待授精。
4.人工授精：(1)ICSI组：取卵后1～2 h给予透明质酸酶剥除卵母细胞周边颗粒细胞，所有MⅡ卵母细胞均行ICSI。(2)r-ICSI组：卵泡穿刺获得卵冠丘复合物，IVF后4～5 h去除卵母细胞周围的颗粒细胞，根据是否存在第二极体判断受精情况，若观察到两个极体的卵母细胞数占成熟卵母细胞数的比例<50%，或成熟卵母细胞均未排出第二极体者，在6 h后对未受精卵母细胞行早期r-ICSI。16～18 h后观察原核(PN)形成情况，见到双原核(2PN)且看到两个极体为正常受精。
5.胚胎移植：参照伊斯坦布尔共识[7]对卵裂期胚胎进行质量评估，正常受精后第3天(D3)卵裂球数目≥4个、碎片<50%者为可利用胚胎；
D3卵裂球数目7～9个、碎片<20%为优质胚胎。取卵后第3天，根据卵裂期胚胎质量由高到低移植1～2枚胚胎，剩余优质胚胎或可利用胚胎于移植当日行玻璃化冷冻保存；
其中r-ICSI组移植胚胎均为经早期r-ICSI受精形成的胚胎(不包含短时IVF受精形成的胚胎)。有卵巢过度刺激综合征(OHSS)风险或存在宫腔积液等不宜移植胚胎的情况时，则取消移植，冷冻所有胚胎。取卵当日开始给予患者常规黄体支持至取卵后第10日，如有特殊情况，根据患者情况调整用药。
6.移植结局随访：所有行胚胎移植的患者均随访至有明确的妊娠结局：未妊娠、生化妊娠、流产或活产。胚胎移植后第14天检测血HCG，HCG阴性(HCG<10 U/L)者为未妊娠；
HCG阳性(HCG>10 U/L)者于移植后第28天行阴道超声检测，未见孕囊者为生化妊娠，见宫内孕囊及原始心管搏动者为临床妊娠。早期流产定义为胚胎移植后28 d超声可检测到孕囊存在，但妊娠12周内胚胎停止发育或自然流产。活产定义为孕周满28周，至少有1个存活的新生儿分娩。
7. 观察指标：收集纳入对象的一般资料，包括女方年龄、男方年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、基础FSH(bFSH)水平等。记录各组患者的实验室指标及妊娠结局，包括MⅡ卵母细胞率、受精率、2PN率、3PN率、卵裂率、可利用胚胎率、优质胚胎率、周期取消率、胚胎种植率及临床妊娠率、生化妊娠率、活产率、早期流产率及异位妊娠率。其中MⅡ卵母细胞率=MⅡ卵母细胞数/获卵数；
受精率=受精数/MⅡ卵母细胞数；
2PN率=2PN数/受精数；
3PN率=3PN数/受精数；
卵裂率=卵裂数/受精数；
优质胚胎率=优质胚胎数/受精数；
胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数；
临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数；
生化妊娠率=生化妊娠周期数/移植周期数；
早期流产率=早期流产周期数/临床妊娠周期数；
活产率=活产周期数/移植周期数。
三、统计学方法
采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计分析。所有计量资料均为非正态分布，以中位数(上下四分位数)[M(P25，P75)]表示，组间比较使用非参数检验；
计数资料以率(%)表示，组间比较采用卡方检验或Kruskal-Wallis检验，Fisher精确概率检验用于期望频数小于5的情况。P<0.05为差异有统计学意义。
2.2对两组患者治疗后不良反应发生情况进行对比,结果显示,观察组不良反应发生率为12.19%,对照组不良反应发生率为36.58%,两组患者组间差异显著,具有差异统计学意义(p<0.05),具体情况如表2所示:
一、各组患者一般资料比较
本研究共纳入479例患者(479个周期)。其中，短时IVF授精后未受精或受精率低而行早期补救ICSI(r-ICSI组)77周期，常规ICSI周期中男方精液参数正常者(ICSI-1组)144周期和男方精液参数异常者(ICSI-2组)258周期。
三组患者间女方年龄、男方年龄、BMI、不孕年限、bFSH比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。
表1 各组患者一般资料比较[M(P25，P75)]
二、各组患者实验室指标比较
1.r-ICSI组和ICSI-1组的实验室指标比较：r-ICSI组的MⅡ卵母细胞率、受精率、2PN率、可利用胚胎率、优质胚胎率显著高于ICSI-1组(P<0.05)。r-ICSI组的周期取消率显著低于ICSI-1组(P<0.001)。两组间3PN率、卵裂率、胚胎种植率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。
2.r-ICSI组和ICSI-2组实验室指标比较：r-ICSI组的MⅡ卵母细胞率、受精率、可利用胚胎率显著高于ICSI-2组(P<0.05)。r-ICSI组的周期取消率、胚胎种植率显著低于ICSI-2组(P<0.05)。两组间2PN率、3PN率、卵裂率、优质胚胎率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。
3.ICSI-1组和ICSI-2组实验室指标比较：ICSI-1组的MⅡ卵母细胞率显著高于ICSI-2组(P<0.001)，受精率、2PN率、可利用胚胎率及优质胚胎率显著低于ICSI-2组(P<0.05)。两组间3PN率、卵裂率、胚胎种植率及周期取消率比较均无显著性差异(P>0.05)(表2)。
三、各组患者妊娠结局比较
r-ICSI组、ICSI-1组及ICSI-2组间的生化妊娠率、临床妊娠率、活产率、早期流产率及异位妊娠率比较均无显著性差异(P>0.05)(表3)。
表2 各组患者实验室指标比较(%)
表3 各组患者妊娠结局比较(%)
近年来，辅助生殖技术不断发展，但仍然避免不了完全受精失败或部分受精失败的发生，IVF发生完全受精失败的概率为5%～20%[8]。对于精子与卵子共孵育6 h后受精失败或受精率低的患者，选择在下个周期直接行ICSI，还是选择当前周期进行短时受精联合r-ICSI，是一个值得思考的问题。考虑到高龄女性卵母细胞质量下降、非整倍体胚胎和自然流产率显著增加[9]，且移植不同类型胚胎(卵裂期胚胎或囊胚)会对妊娠结局带来影响，为了消除年龄及移植胚胎类型所带来的偏倚，本研究只选择年龄<35岁、新鲜周期移植卵裂期胚胎的患者进行研究。
本研究的数据显示，r-ICSI组和ICSI-1组(男方精液参数正常)的患者中，r-ICSI组的MⅡ卵母细胞率、受精率显著高于ICSI-1组(P<0.001)。这与王雪莹等[6]、Zeng等[10]的研究结论相似。王雪莹等[6]认为早期r-ICSI可在不影响胚胎发育潜能的情况下显著提高受精率，获得良好的妊娠结局；
Zeng等[10]认为对于原发性不孕症及不孕症持续时间较长的患者应常规行短时IVF授精联合早期r-ICSI。r-ICSI与ICSI的差异主要体现在以下2点：(1)r-ICSI的单精子注射时间晚于ICSI；
(2)r-ICSI存在精子与卵子共孵育的过程，而ICSI则没有。有研究认为，卵母细胞中细胞质成熟的时间晚于细胞核成熟的时间；
早期r-ICSI的卵母细胞穿刺时间较晚，使得卵母细胞发育的时间更长、卵母细胞更成熟、卵母细胞核质发育更同步[11]。核质共同成熟的卵母细胞具有更好的发育潜能，更有利于受精成功，这可能是早期r-ICSI较ICSI有更高受精率的原因之一。此外，卵丘细胞表达的基因以及为卵母细胞提供的一系列因子，包括糖胺聚糖、类固醇激素和营养物质等，在调控卵母细胞生长、成熟等方面发挥着重要作用[12]。宋明哲等[13]认为，卵母细胞成熟率和受精率呈正相关。在早期r-ICSI操作中，精子与卵子共孵育的过程可以通过卵丘细胞促进卵母细胞的成熟，提高卵母细胞的受精率，这可能是早期r-ICSI受精率较高的另一原因。
r-ICSI组的可利用胚胎率及优质胚胎率均显著高于ICSI-1组(P<0.05)。这与王紫娟等[11]的结果相似，而与王雪莹等[6]的结果相反；
这种差异可能是因为纳入、排除标准不同。王雪莹等[6]的研究中未对年龄及不孕类型进行分组；
而我们的研究集中于年龄<35岁的原发性不孕患者。有研究表明，卵丘细胞对胚胎发育具有双面性，一方面，卵丘细胞可以分泌促进胚胎发育的物质，如生长因子、氨基酸、雌二醇、孕酮等，从而提高优质胚胎率；
另一方面，卵丘细胞也会产生对胚胎发育潜力有不利影响的氧化代谢物。早期r-ICSI通过早期清除卵丘细胞，限制精子与卵子共孵育的时间，减少卵丘细胞产生过多的氧化代谢产物，避免了卵母细胞老化，可能有助于提高胚胎发育的潜能[14-15]。
本研究中，r-ICSI组与ICSI-1组的胚胎种植率、生化妊娠率、临床妊娠率、活产率、早期流产率和异位妊娠率比较均无显著性差异(P>0.05)。Huang等[16]回顾性分析了13 232对接受IVF、ICSI和早期r-ICSI夫妇的临床资料，发现早期r-ICSI组与ICSI组的着床率、临床妊娠率和每移植周期活产率均无显著性差异(P>0.05)，认为早期r-ICSI是一种安全有效的方法。Xiong等[17]也在研究中证实早期r-ICSI是可用于原发性不孕妇女的一种安全、有效的体外授精方式。我们的观点与上述研究相似。
但r-ICSI也有其不足之处，容易出现多精受精。卵母细胞如果在受精前就开始老化，则会影响受精率和胚胎的发育；
若过早进行r-ICSI，可能出现第二极体释放延迟的卵母细胞多精受精。因此寻找r-ICSI的最佳时机非常关键。目前比较公认的短时授精的时间是精子和卵子共孵育6 h[18]。然而，即使是经验丰富的胚胎学家，也无法避免多精受精的情况出现。本研究结果表明，对于精液参数正常的原发性不孕患者，早期r-ICSI的2PN率显著高于ICSI-1组(P<0.05)，3PN率有低于ICSI-1组的趋势，但差异尚无统计学意义(P>0.05)。这与Chen等[19]的研究结果相似，Chen等[19]认为对第二极体释放率<80%的卵母细胞采用r-ICSI授精并未明显增加3PN率；
该结论再次验证了r-ICSI的安全性。
此外，本研究结果中还出现了一个有趣的现象。有数据表明，在世界范围内，精液参数正常的不孕不育夫妇使用ICSI助孕的比率持续上升，在美国，ICSI的使用率从1996年的36.4%上升到2012年的76.2%；
在这17年间，精液参数正常的不孕患者周期中，ICSI的使用率从15.4%上升到66.9%[16]。本研究结果中，ICSI-2组(男方精液参数异常)的受精率、2PN率、可利用胚胎率和优质胚胎率均显著高于ICSI-1组(P<0.05)；
ICSI-2组的胚胎种植率、临床妊娠率和活产率(40.31%)均有高于ICSI-1组的趋势，但尚无显著性差异(P>0.05)。这可能是因为本研究纳入的样本量较少，研究结果存在一定的偏倚，但是仍能说明采用ICSI助孕对精液参数异常的患者，可以实现更好的临床结局。
临床工作中，有一些研究将周期取消作为排除标准[6]，然而，比较组间的周期取消率，对分析ICSI和r-ICSI的临床应用价值有一定的帮助。本研究结果显示，常规ICSI组，包括男方精液参数正常的ICSI-1组和精液参数异常的ICSI-2组，周期取消率均显著高于r-ICSI组(P<0.001)，提示盲目地对精液参数正常的原发性不孕患者采用ICSI助孕可能会造成周期的取消，增加了时间成本；
而早期r-ICSI更能提高周期有效率。
但本研究也存在一些不足：首先，本研究纳入的样本量有限。其次，原发性不孕患者既往没有妊娠史，大多相对年轻；
而原发性不孕的高龄患者样本量较少，此次未纳入研究。最后，本研究为回顾性分析，研究结论可能存在一定的局限性，后续仍需要更大样本量的前瞻性多中心队列研究为早期r-ICSI的有效性提供更多的证据和资料积累。
综上所述，对于<35岁的原发性不孕患者，短时授精联合早期r-ICSI可作为一种安全有效的治疗方式；
虽然其未能显著提高患者的临床妊娠率和活产率，但显著改善了受精率和优质胚胎率，并且能有效避免周期取消，节约了时间成本，有利于缓解患者夫妇的心理压力。
