补骨脂素对2型糖尿病大鼠种植体骨结合的影响机制
时间：2023-03-23 21:50:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
胡鹏鲲，杨 鹏，冯亚梅
(邯郸市口腔医院 1.修复科；
2.种植科，河北 邯郸 056001)
随着外科技术和种植体设计的不断发展，使用种植体进行牙齿修复已成为牙列缺损患者的首选。然而，糖尿病，尤其是2型糖尿病(Type 2 diabetic mellitus,T2DM)作为一种以高血糖为特征的代谢性疾病，可通过影响种植体骨结合导致种植失败[1-2]。注射胰岛素是糖尿病治疗的主流趋势，但其对种植体骨结合的改善效果并不理想[3]。因此，迫切需要探索新的治疗方式以增强T2DM患者种植体骨结合。
Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路作为骨形成和愈合的重要调节剂，在骨骼发育和体内平衡中发挥核心作用，并参与细胞对各种刺激物的反应，包括微环境失衡、氧化应激和植入物表面特性[4]。已经证明，Wnt/β-catenin信号通路的激活可促进种植体表面的生物矿化和种植体/组织界面的组织修复[5-6]。Ma等[7]研究显示，麦冬素D可通过激活Wnt/β-catenin信号通路抑制氧化应激，改善糖尿病条件下体内钛合金植入物的骨结合；
提示Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病引起的种植体骨结合受损中发挥作用。
补骨脂素(Psoralen,PSO)是一种从补骨脂中提取的天然化合物，具有显著的骨骼保护作用[8]。据报道，PSO可减轻牙周炎大/小鼠的牙槽骨丢失[9-10]，促进成骨细胞分化和骨形成[11]。此外，PSO可诱导兔骨内膜间充质干细胞增殖，与聚己内酯三维支架结合形成人工复合骨修复骨不连，可运用于骨组织工程[12]。PSO还被报道可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖[13]。然而，鲜有研究报道PSO是否可以在高血糖条件下促进种植体骨结合。因此，本研究通过建立T2DM大鼠模型并在胫骨植入钛种植体，探究PSO对T2DM种植体骨结合的影响及分子机制。
1.1 动物 SPF级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，7～8周龄，体重(240～280)g，由湖南嘉泰实验动物有限公司提供，许可证号SCXK(湘)2020-0006。所有大鼠饲养在相同的控制条件下，包括光照(12 h光/暗循环)、湿度(50%～60%)和温度(22～24 ℃)，并且可以获得标准食物和水。
1.2 主要试剂与仪器 PSO(纯度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，B-065)；
重组大鼠Dickkopf-1(Dkk1)蛋白(一种Wnt抑制剂，美国R&D Systems公司，4010-DK-010)；
锥形螺旋钛种植体(直径1 mm，长度10 mm，西安中邦钛生物材料有限公司)；
亚甲基蓝-酸性品红染色液(青岛克斯特生物科技有限公司，RYX021)；
链脲佐菌素(STZ，S8050)、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(G1120)、Masson三色染色试剂盒(G1340)、总RNA提取试剂盒(R1200)(北京Solarbio公司)；
PrimeScriptTMRT逆转录试剂盒(RR037Q)(日本Takara公司)；
兔源一抗Wnt3a(ab219412)、β-catenin(ab68183)、Lamin B1(ab16048)、GAPDH(ab181602)(英国Abcam公司)。金刚石锯(SP1600，德国Leica公司)；
Accu-Chek血糖仪(Roche Diagnostics，加拿大)；
Quantum GX2小动物活体Micro-CT影像系统(Perkin Elmer，日本)；
ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)。
1.3 模型建立及分组 适应实验室条件7 d后，将大鼠随机分为对照组(Control组，n=18)和造模组(n=62)。T2DM大鼠模型通过4周的高脂高糖饮食(53%碳水化合物，31%总脂肪大卡和16%蛋白质；
北京科奥协力饲料有限公司，中国)，然后以30 mg/kg的剂量腹腔注射STZ(溶解在0.1 M柠檬酸盐缓冲液，pH 4.2)诱导[14]。Control组大鼠给予常规饲料和柠檬酸盐缓冲液注射。在STZ注射后第3 天，通过剪尾从尾静脉收集血样，然后用Accu-Chek血糖仪测量空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)；
FBG>16.7 mmol/L表明T2DM模型建立成功[15]。造模过程中，4只大鼠死亡，4只大鼠造模失败。最后，共得到54只大鼠。
将建模成功的54只大鼠分为T2DM组、PSO组、PSO+Dkk1组，每组18只。所有大鼠通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉。然后，用手术刀沿右侧膝关节内侧切开1 cm长的切口，露出胫骨近骺端。随后，用旋转钻进入髓腔制备种植窝，将种植体植入胫骨骨髓腔，直到种植体末端低于关节面。然后，分层缝合手术切口。所有大鼠在术后立即肌肉注射3 d的抗生素以预防感染。PSO组大鼠在手术后给予8 mg/kg的PSO灌胃[9]，每2日1次；
PSO+Dkk1组大鼠在每日给予PSO灌胃的同时在胫骨种植体植入部位附近以25 mg/kg的剂量皮下注射重组Dkk1蛋白[16]，每周2次；
Control组和T2DM组大鼠给予等体积的生理盐水灌胃和皮下注射。12周后，用致死剂量的麻醉剂(戊巴比妥钠150 mg/kg，腹腔注射)对所有大鼠实施安乐死。
1.4 大鼠体重和血糖水平 实验过程中定期(实验前、干预第4、8、12周)监测大鼠体重变化，并在相同的时间点采集尾静脉血测定FBG水平。
1.5 Micro-CT扫描重建检测骨微结构 大鼠安乐死后，收集带种植体胫骨样本，每组选取6只大鼠样本固定在4%多聚甲醛中，使用Micro-CT系统进行扫描。扫描后，从显微断层切片重建三维(3D)图像。为了准确地表示骨小梁结构，感兴趣区域(ROI)需要包含至少三到五个小梁间长度，由于大鼠小梁骨的厚度约为100 μm，因此ROI位于生长板下方1 mm，距种植体表面的环半径为500 μm，厚度为800 μm。计算骨小梁以下参数：骨体积百分比(BV/TV，%)，骨小梁数(Tb.N，mm)和骨整合百分比(OI，%)。BV代表ROI中的骨骼体积，TV代表ROI的总空间体积；
OI(%)是直接接触的骨-种植体界面与总种植体表面的面积比例。
1.6 组织形态学分析 将含有钛种植体的胫骨脱水，嵌入甲基丙烯酸甲酯中而不脱钙，然后用金刚石锯(SP1600，Leica，Germany)切片，获得50 μm厚的未脱钙切片。随后，未脱钙切片用1%亚甲基蓝-酸性品红染色并用光学显微镜观察。使用Image Pro Plus 6.0测量骨-种植体接触率(Bone-implant contact,BIC，%)，BIC在生长板下方1 mm处测量。BIC为骨-种植体表面接触长度与种植体在骨内段表面总长度的比值。取出在4%多聚甲醛中固定48 h的胫骨，用流水冲洗后，用10% EDTA脱钙4～6周，直到可以无阻力地插入针头。然后沿骨轴方向小心取出种植体，然后将组织标本进行梯度乙醇脱水，石蜡包埋，并在种植体周围横向切成5 μm的切片。然后进行HE染色和Masson染色，分别评估新骨形成和新骨成熟度。
1.7 RT-qPCR分析骨组织runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙素(Osteocalcin,OCN)、I型胶原蛋白α1(COL1A1)mRNA表达 使用Trizol试剂从种植体周围骨组织中提取总RNA，并采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，逆转录体系：2 μL第一链cDNA、上游和下游引物(10 pM)各2 μL、4 μL dNTP(2 mM)、5 μL 10×PCR buffer、1 μL Taq酶(2 U/μL)、34 μL ddH2O。然后，在ABI Prism® 7500型荧光定量PCR仪上使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行PCR扩增。扩增体系(20 μL)：1.0 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green Mix、7.4 μL ddH2O、上游和下游引物各0.8 μL，热循环条件如下：95 ℃ 10 min；
然后是95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s的40个循环；
最后72 ℃延伸1 min。采用2-ΔΔCt方法进行目的基因相对表达分析，并将mRNA表达标准化为GAPDH。引物序列见表1。
表1 RT-qPCR引物序列
1.8 Western blot检测骨组织Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达 采用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制剂)在冰上裂解组织以提取总蛋白，并采用核蛋白提取试剂盒提取胞核蛋白(用于检测β-catenin)，使用BCA法测量蛋白质浓度。然后，使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离等量蛋白质，并将其转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5 %脱脂牛奶用于封闭膜1 h。随后，将膜用一抗[GAPDH(1∶2 000)、Wnt3a(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和Lamin B1(1∶1 000)]在4 ℃下孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次(每次5 min)，并与辣根过氧化物酶偶联二抗(1∶5 000)室温孵育1 h。最后，增强的化学发光试剂(ECL)用于显示蛋白质条带，并用Image J软件分析蛋白质条带的灰度值进行量化。GAPDH用作总蛋白内参对照，Lamin B1用作胞核蛋白内参对照。
2.1 各组大鼠体重变化 所有大鼠在整个实验期间均存活，未观察到种植体感染。与Control组相比，T2DM组大鼠体重显著降低(P<0.05)；
与T2DM组相比，PSO组、PSO+Dkk1组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)；
见表2。
表2 各组大鼠体重变化比较
2.2 各组大鼠血糖变化 与Control组相比，T2DM组大鼠FBG水平显著升高(P<0.05)；
与T2DM组相比，PSO组、PSO+Dkk1组大鼠FBG水平差异无统计学意义(P>0.05)；
见表3。
表3 各组大鼠FBG水平比较
2.3 各组大鼠骨微结构比较 与Control组相比，T2DM组大鼠骨组织BV/TV、Tb.N和OI显著降低(P<0.05)；
与T2DM组相比，PSO组大鼠骨组织BV/TV、Tb.N和OI显著升高(P<0.05)；
与PSO组相比，PSO+Dkk1组大鼠骨组织上述指标水平显著降低(P<0.05)；
见图1、表4。
A:Control组；
B：T2DM组；
C:PSO组；
D:PSO+Dkk1组；
箭头表示骨小梁。图1 各组大鼠骨-种植体界面的Micro-CT检查结果
表4 各组大鼠BV/TV、Tb.N和OI水平比较
2.4 各组大鼠骨组织形态学变化 未脱钙切片的亚甲基蓝-酸性品红染色结果显示，与Control组相比，T2DM组种植体周围骨量减少且散在分布，BIC显著降低(P<0.05)；
与T2DM组相比，PSO组大鼠种植体周围的骨量和密度明显增加，BIC显著升高(P<0.05)；
与PSO组相比，PSO+Dkk1组种植体周围的骨量和密度减少，BIC显著降低(P<0.05),见图2、表5。
A：种植体纵切面图像；
B：种植体横截面图像；
黄色箭头表示种植体周围骨组织染色；
亚甲基蓝-酸性品红染色，比例尺=50 μm。图2 各组大鼠种植体骨结合的硬组织切片分析
表5 各组大鼠BIC比较
HE染色结果显示，在Control组和PSO组中可以观察到种植体周围不同数量的骨组织，而T2DM组和PSO+Dkk1组几乎全部被纤维组织占据(见图3)。Masson染色结果显示，Control组和PSO组中种植体周围出现了蓝色索状新骨组织，同时开始出现红色染色的骨组织，表明存在新骨，且成熟骨较多；
而T2DM组和PSO+Dkk1组中种植体周围的新生骨较少(见图3)。
A：HE染色(黑色箭头表示纤维组织)；
B：Masson染色(红色箭头表示新生骨组织，绿色箭头表示成熟骨组织)；
脱钙切片，比例尺=50 μm。图3 各组大鼠种植体骨结合的组织学染色结果
2.5 各组大鼠骨组织RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平比较 与Control组相比，T2DM组RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平显著降低(P<0.05)；
与T2DM组相比，PSO组RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平显著升高(P<0.05)；
与PSO组相比，PSO+Dkk1组RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平显著降低(P<0.05)；
见表6。
表6 各组大鼠骨组织RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平比较
2.6 各组大鼠骨组织Wnt3a、β-catenin蛋白水平比较 与Control组相比，T2DM组Wnt3a、核β-catenin蛋白水平显著降低P<0.05)；
与T2DM组相比，PSO组Wnt3a、核β-catenin蛋白水平显著升高P<0.05)；
与PSO组相比，PSO+Dkk1组Wnt3a、核β-catenin蛋白水平显著降低P<0.05)；
见图4、表7。
图4 各组大鼠骨组织Wnt3a、β-catenin蛋白表达
表7 各组大鼠骨组织Wnt3a、β-catenin蛋白水平比较
T2DM会阻碍牙种植体的骨再生。动物模型的成功建立是深入研究糖尿病发展和并发症的基础。由高脂饮食和低剂量STZ诱导的大鼠T2DM模型体现了人类T2DM的代谢特征，可持久和稳定的维持高血糖，在针对糖尿病骨代谢特征及其可能的新疗法研究中具有广泛应用[17-18]。在本研究中，给予高脂高糖饮食并注射STZ的大鼠血糖水平升高且体重减轻，表明成功构建了T2DM模型。本研究还表明，T2DM大鼠的种植体稳定性受损，组织学评估和Micro-CT扫描证明T2DM组大鼠BIC和OI较低，种植体周围骨微结构受损。BIC用于在二维图中描述直接骨-种植体界面的长度占种植体总直径的百分比，而OI用于在三维图中描述直接骨-种植体界面与总种植体表面的面积比例。此外，T2DM组更容易拔出种植体，这表明生物力学性能不理想；
与该领域的先前研究一致[19-20]。所有这些结果都证实T2DM会对种植体骨结合产生负面影响。
PSO属于植物雌激素，具有防止骨质流失、促进新骨形成的功能，被视为治疗骨质疏松症的替代选择。最近的一项研究显示，PSO在骨组织工程的骨不连修复中具有重要作用，可通过刺激兔骨内膜间充质干细胞增殖，与聚己内酯支架结合形成人工复合骨，促进骨愈合，修复骨不连[12]。本研究探讨PSO对T2DM模型大鼠种植体骨结合的影响。结果显示，PSO对降低T2DM大鼠的血糖浓度和增加体重几乎没有作用，然而，Micro-CT扫描和组织学染色显示PSO减轻T2DM大鼠种植体周围骨微结构受损，增加BIC和OI；
此外，HE和Masson染色评估骨结合过程中新骨的形成和成熟度，显示出一致的结果；
RT-qPCR结果进一步表明，PSO促进RUNX2、OCN、COL1A1基因表达。提示，PSO可改善T2DM大鼠种植体骨结合。
本研究进一步探讨PSO对促进T2DM大鼠种植体骨结合影响的潜在机制。Wnt信号是几乎所有组织(包括骨骼、神经组织、心肌和表皮)的修复或再生所必需的[21]。据报道，Wnt/β-catenin通路为开发新型药物或种植体材料以改善种植体骨结合的有希望的治疗靶点[22]。Wnt/β-catenin信号通路的激活可在糖尿病条件下促进钛种植体在骨缺损修复中的成骨和骨结合[7,15]。β-catenin是Wnt信号通路的下游成分，Wnt信号传导的激活导致β-catenin降解减少，β-catenin可以在细胞质中积累并转移到细胞核，促进靶基因转录。王慧丽等[15]研究显示，在T2DM大鼠中植入钛种植体后，β-catenin表达降低，而LiCl(Wnt/β-catenin信号通路激活剂)可促进种植体周围骨形成，促进种植体骨结合。Wnt3a是一种Wnt蛋白，可以激活经典的β-catenin通路。研究显示，添加外源性脂质体Wnt3a蛋白可为种植体周围骨形成创造成骨环境，有利于种植体的骨结合[23-24]。在本研究中，植入钛种植体后，T2DM大鼠骨组织中Wnt3a和核β-catenin蛋白水平均降低，与以往的研究结果一致，说明Wnt/β-catenin信号通路被抑制。给予PSO干预后，T2DM大鼠骨组织中Wnt3a和核β-catenin蛋白水平增加，表明PSO促进β-catenin的核转位。Dkk-1是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，可通过与靶细胞上的LRP5/6结合来抑制Wnt信号通路[13]。本研究结果显示，Wnt3a和β-catenin的表达被Dkk-1抑制，且Dkk1可部分逆转PSO对T2DM大鼠种植体骨结合的改善作用，这进一步证明PSO通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进种植体骨结合。
综上所述，PSO可促进T2DM大鼠钛种植体周围骨形成，改善种植体骨结合；
其作用机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。本研究初步探讨PSO在T2DM钛种植体骨结合中的作用及潜在机制，表明PSO具有增加种植体骨结合的潜力。然而，PSO对T2DM大鼠的高血糖和体重减少并无改善作用，考虑其与胰岛素等降糖药物联合使用是否对促进T2DM大鼠骨结合产生累加或协同作用。此外，还需要进一步的细胞和分子水平实验，以更加全面验证PSO的作用与机制。
