血清学结合基因检测对1例Bx亚型的鉴定
时间：2023-03-23 19:25:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
孙 岩，王晓宁，刘 冰*，钟 靖
(1.吉林大学第一医院 输血科，吉林 长春130021；
2.邵阳市中心医院 输血科)
截至目前，共有376个人类红细胞血型抗原被国际输血协会(ISBT)认定，其中有345个抗原属于总数为43种的红细胞血型系统(www.isbtweb.org)。每个血型系统表现为一个单基因或相关区域两个至三个紧密连锁基因构成的基因簇，在它们之间很少或几乎没有可识别的重组，因此每个血型系统都具有基因独立性[1]。其中ABO血型系统在临床输血中具有重要的意义，在输血前常规检测中会发现某些ABO亚型表现为正反定型不一致[2]。大部分的ABO亚型都是由于ABO基因不同的突变位点造成A、B转移酶的活性变化，导致了H抗原转化为A/B抗原的数量不同，形成了不同类型的ABO亚型，其中B血型亚型主要包括B3、Bx、Bm、Bel等，其B抗原表达逐渐减弱[3]。本实验室在常规血型检测中发现了1例疑似B亚型，并通过基因方法证实为Bx/Bweak表型，现将结果报道如下。
1.1 临床资料
产妇肖某，女，31岁，孕1产1，无肝炎、传染病史，无输血及献血史，无药物过敏史。2021年10月顺产足月宝宝送吉林大学第一医院检测新生儿溶血3项试验。对该孕妇进行血型鉴定时，使用微柱凝胶卡在室温下进行正反定型，其结果为抗-A呈阴性，抗-B呈阴性，抗-D呈阳性4+凝集，阴性对照孔为阴性，正定型O、RhD+，反定型检测患者血浆与标准试剂A细胞出现4+凝集，与标准试剂B细胞在室温下不凝集，反定型为B型，正反定型不相符为疑难血型，遂利用血清学及基因检测方法鉴定其血型。
1.2 试剂与仪器
血型检测卡(西班牙DIANA，批号21014.02)；
抗人球蛋白检测卡(西班牙DIANA，批号21092.01)；
抗A、抗B试剂(上海血液生物医药，批号20210504)；
单克隆抗-AB、抗-H(Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH)；
ABO血型反定型试剂盒(长春博迅，批号2021080101)；
不规则抗体检测试剂(长春博迅，批号20210903)；
快速PCR扩增高保真DNA聚合酶(北京全式金)；
Axyprep DNA试剂盒(批号21419KC3，康宁生命科学公司)；
QIAquick胶体DNA回收试剂盒(德国Eppendorf)，以上所有试剂均在效期内使用。卡式法离心机、孵育器(DIANA)；
低速离心机(雷勃尔公司)；
高速离心机(Eppendorf)；
梯度PCR仪(Eppendorf)；
凝胶成像系统(Bio-Rad Gel Doc XR+型)；
电泳仪(DYY-8C，北京六一)；
引物合成与基因测序均由上海生工生物工程公司完成。
1.3 方法
1.3.1血清学实验 患者血型鉴定，采用卡式法、试管法分别在不同温度条件下检测，卡法按厂家说明书操作，红细胞吸收放散试验、试管法按文献[3]中方法操作；
患者血浆意外抗体筛查试验采用卡法，按说明书操作。
1.3.2基因检测 DNA提取按照试剂盒说明书提取血液标本基因组。参照美国NCBI GenBank中ABO基因编码区碱基序列设计引物，对ABO血型外显子2-7 PCR引物进行扩增，PCR反应条件为95℃ 3 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，72℃延伸10 min，延伸结束后，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，将目的片段进行胶回收实验，以回收产物为模板继续进行PCR扩增，扩增产物琼脂糖电泳检测条带清晰，进行测序，测序结果以ABO blood group alleles(IBST 001)v1.1 171023突变位点比对，DNAStar软件进行序列比对，进行基因型和表型分析[4]。
2.1 ABO 血型鉴定及H 抗原检查
患者样本在常规室温下检测正定型为O型，其红细胞与微柱凝胶卡中单克隆抗-A、抗-B反应均阴性，反定型为B型，但样本红细胞在4℃条件下与抗-B抗体反应呈弱阳性凝集，结果见表1；
患者样本在不同温度条件下试管法血型鉴定及其红细胞与抗-AB反应结果见表2。
表1 患者ABO血型鉴定(微柱凝胶法)
2.2 意外抗体检测及红细胞H物质活性强度测定
样本意外抗体筛检试验结果阴性，说明患者血清中不存在ABO系统以外的意外抗体。将患者红细胞及O、B型红细胞分别与抗-H反应，结果凝集强度分别为3+、弱阳、阴性，与亚型H物质含量测定标准相符[1]。
表2 患者ABO血型鉴定结果(试管法)
2.3 样本红细胞吸收放散实验结果
采用人源抗-B(效价128)进行吸收放散试验，最后一次洗涤液与健康成人O型、B型细胞均不反应；
样本红细胞放散液与O型细胞无凝集，但与健康成人B型细胞反应，凝集强度3+，说明样本红细胞表面存在B抗原。考虑为B亚型，进行基因检测。
2.4 基因检测结果
测序结果显示，外显子 2、3、4、5 无突变位点，外显子 6、7 有突变，突变位点见表3。样本序列与B101(ABO*B.01)基因序列比对，仅在6号外显子278位发生C>T的突变，见图1。经检索[5]，样本序列与ABO*BW.12基因的序列完全一致，c.278C>T碱基突变导致93位脯氨酸变成亮氨酸，经过分析该样本基因型为ABO*BW.12，表型为Bx/Bweak亚型。
表3 样本ABO血型基因突变结果
血型之父Landsteiner于1900年首次描述了ABO血型，其至今仍是输血医学中最重要的血型系统。同RH血型的D抗原一样，A和B抗原具有高度免疫原性，输注ABO不相容的血液可导致严重的免疫反应，这种反应可能导致急性血管内溶血和肾功能衰竭等并发症，并导致患者出现致命的后果[6]。除了常见的ABO表型外，还发现了许多在红细胞上弱表达A或B抗原的ABO亚型，ABO亚型虽然罕见，但却是导致ABO血型正反定型不符合的重要原因之一。抗原弱表达的ABO亚型是由ABO 基因座上罕见的等位基因遗传引起的，通常涉及基因编码区、剪切位点或调控序列中的错义突变、插入或缺失等，有文献报道中国人群弱ABO亚型的检出率约为0.015%左右[7]。
图1 样本ABO血型基因6号外显子的c.278C>T突变
根据与单克隆抗-B/抗-AB/抗-H抗体的凝集程度、人源抗-B抗体吸收放散实验结果、唾液分泌状态以及血清中是否存在抗-B等，可将B亚型分为B3、Bx、Bm、Bel，如果不符合以上四类，则可划分为Bw[8]。另外，如要准确的确定正反定型不相符的患者ABO血型，仍需借助基因检测的方法来分析确定[4]。在本例，患者样本常规条件下检测正定型O型，反定型B型，正反定型不相符。但患者红细胞与抗-H强反应，且在4℃条件下检测其红细胞与抗-B和抗-AB抗体呈弱反应，并使用人源抗-B吸收放散后可验证有B抗原存在，可初步判断为弱B亚型，疑似为Bx。在诸多B亚型中，Bx、Bm的检测确认尤其是重要的，因为这些B亚型红细胞上只有极弱的B抗原，作为献血者其可能会被错误地判断成O型，如果输血给O型受血者，则可能导致溶血性输血反应的发生[4]。另外，当这类B亚型(如Bx)个体由于其血清(血浆)中可能含有弱的抗-B抗体，因而其作为受血者时应该给其输O型红细胞和(或)匹配/兼容的血浆和血小板成分[8]。
目前，ISBT(国际输血协会)确认的涉及弱B的等位基因接近50个，最常见的B基因是ABO*B.01(B表型)，弱B表型的基因突变主要发生在6、7外显子[5]。不同的B等位基因编码翻译出不同的糖基转移酶，Bx型是由于基因的错义突变，造成了编码翻译的酶只具有弱的合成抗原的能力[9]。本例患者样本的直接测序结果显示，在ABO基因第6外显子出现c.278C>T、c.297A>G两个等位基因突变，在第7外显子出现c.526C>G、c.657C>T、c.703G>A、c.796C>A、c.803G>C、c.930G>A共6个等位基因突变。通过比对ISBT的ABO血型抗原等位基因突变资料，分析得出患者样本序列与ABO*BW.12基因的序列完全一致，c.278C>T碱基突变导致93位脯氨酸变成亮氨酸，而这一突变在中国人群中已有多例发现，并推测该突变正是其弱表型Bx/Bweak形成的分子基础[5,10-11]。
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