抗生素对硝化污泥系统的影响及其去除特性

刘梦梦，郭 宁,*，刘雨昊，朱兆亮

(1.山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南 250101；
2.中建八局第一建设有限公司，山东济南 250101)

抗生素作为一种常用的药物活性物质被广泛用于人类及动植物的疾病预防和治疗中。研究[1]表明，30%～90%的抗生素通过人或动物排泄物的形式释放到环境中。抗生素的长期存在及不断积累，会给生态系统及人类健康带来严重的潜在威胁。而传统的活性污泥工艺对抗生素的去除效果并不佳[2-3]。

近期的研究[4-5]表明硝化污泥系统可以有效地促进多种抗生素的去除。例如，Batt等[6]通过研究发现甲氧苄啶在硝化活性污泥中去除率可高达50%，而在传统活性污泥中去除率仅为1%左右。另外，抗生素的存在不可避免地会对微生物施加选择性压力，导致微生物群落变化，进而影响反应器的性能。例如，Li等[7]通过考察发现，序批式反应器中不同浓度的诺氟沙星对CODCr和氨氮存在不同程度的抑制作用，并且不同浓度的诺氟沙星对微生物的多样性和丰富度均有影响。Deng等[8]在研究序批式反应器中的抗生素链霉素[(3 955±1 910)μg/L]对微生物群落结构影响时总结，污水处理系统可以通过调节细菌、古细菌和真核生物的组成以应对高浓度抗生素的压力，从而维持反应器的正常运行。因此，探究抗生素选择压力下系统运行性能和微生物群落结构的变化，对提高污水处理工艺的稳定性和整体性能具有重要的理论和实际意义。目前，抗生素对硝化污泥系统运行性能和微生物群落结构的影响仍不明确。

本研究选取广泛应用的磺胺甲恶唑(SMX)为研究对象，考察硝化污泥系统对抗生素的去除效果，分析抗生素对硝化污泥系统运行性能的影响，并重点探讨不同浓度抗生素对微生物量及微生物群落结构分布的影响，以期为提高污水处理系统的运行性能及抗生素的有效去除提供合理的理论依据。

1.1 污泥来源及主要试剂

原始污泥取自济南光大水务公司二沉池的回流污泥。SMX(CAS:723-46-6，C10H11N3O3S)标准品购于上海麦克林公司，甲醇、乙酸均为高效液相色谱级，其他普通化学试剂等均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 污泥驯化

本试验采用好氧曝气，逐步提高氨氮负荷的方式进行污泥驯化。驯化污泥的装置如图1所示。整个驯化过程均由时控开关控制，有效体积为12 L，排水比为1∶1，反应周期为6 h，每天运行4个周期，包括好氧进水(30 min)、曝气(270 min)、沉淀(30 min)、出水(10 min)、静置(20 min)。驯化过程中定期排泥，保持污泥质量浓度在4 000 mg/L左右。反应过程控制DO质量浓度为2.5～3.0 mg/L，pH值为7.5～8.5。定期测定进出水的CODCr浓度、氨氮浓度、亚硝态氮浓度、硝态氮浓度。污泥驯化过程中详细的进出水参数如图2～图3所示。驯化过程中系统出水稳定，CODCr去除率达90%以上，氨氮基本被完全去除且没有亚硝态氮的积累，表明硝化污泥驯化完成。其中模拟废水组分及质量浓度分别为：CH3COONa为320、480、640 mg/L；
NH4Cl为190、290、380 mg/L；
K2HPO4为58 mg/L；
KH2PO4为24 mg/L；
CaCl2·H2O为67 mg/L；
MgSO4·7H2O为42 mg/L；
EDTA-2Na为42 mg/L；
NaHCO3为1 000 mg/L；
FeCl3·6H2O为30 mg/L；
H3BO3为3 mg/L；
CuSO4·5H2O为0.6 mg/L；
KI为0.6 mg/L；
NaMoO4·2H2O为1.2 mg/L；
MnCl·4H2O为2.4 mg/L；
ZnSO4·7H2O为2.4 mg/L；
CoCl2·6H2O为3 mg/L。

图1 污泥驯化装置示意图Fig.1 Schematic Diagram of Sludge Acclimation Unit

图2 污泥驯化过程中反应器CODCr的去除性能变化Fig.2 Changes of CODCr Removal Performance of the Reactor during Sludge Acclimation

图3 污泥驯化过程中反应器的脱氮性能变化Fig.3 Change of Denitrification Performance of the Reactor during Sludge Acclimation

1.2.2 硝化污泥系统性能研究

本试验在3个完全相同的SBR反应器中进行，SBR反应器有效体积为4 L。接种污泥来自上述驯化过的硝化污泥，污泥质量浓度在4 000 mg/L左右，污泥体积指数(SVI)为65%，具有良好的硝化活性和沉降性能。反应器采用与污泥驯化阶段一样的工况参数，进水CODCr质量浓度控制在500 mg/L左右，氨氮质量浓度控制在100 mg/L左右。3个反应器投加不同质量浓度的抗生素，分别为0.1、1.0、10.0 mg/L，保证其他的操作条件和进水水质不变。系统投加SMX运行30 d后，在反应周期内的不同时间点(0、1、2、3、4、5 h)测定出水中SMX浓度，以考察系统中SMX的去除效能，同时为了考察污泥对SMX的吸附，对反应5 h时污泥中SMX浓度进行检测，并计算其污泥吸附率[9]。通过SMX的质量守恒，计算SMX的污泥吸附率Q、生物降解率R，计算如式(1)～式(2)，并测定出水中的CODCr及氨氮浓度，用于考察不同浓度的SMX对硝化污泥系统中CODCr去除及氨氧化进程的影响。

Q=C污泥/C进水×100%

(1)

R=[1-(C污泥+C出水)/C进水]×100%

(2)

其中：C污泥——污泥中SMX的质量浓度，mg/L；

C进水——进水中SMX的质量浓度，mg/L；

C出水——出水中SMX的质量浓度，mg/L。

1.2.3 微生物群落结构分析

系统运行30 d后，分别取3个反应器的污泥样本800 μL，用DNA提取试剂盒(TIANamp soil DNA Kit，天根)提取总DNA，利用Illumina NovaSeq平台(诺禾致源基因公司)，进行16S rRNA高通量测序，以分析硝化污泥系统中不同SMX浓度条件下的微生物量及微生物群落结构。为了测定微生物群落结构，选择16S rRNA 基因的V4～V5可变区作为测序区域，对其进行扩增，相应的引物序列如表1所示。其中，16S rRNA 基因是基于RDP 分类软件(http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)，利用GreenGene数据库(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)进行注释。

1.3 分析方法

CODCr采用重铬酸钾滴定法测定；
氨氮、亚硝态氮、硝态氮分别采用国标法中的钠氏试剂分光光度法、紫外分光光度、分光光度法进行测定；
抗生素样品经0.22 μmol/L滤膜过滤后利用高效液相色谱仪(日本，岛津)进行分析，流动相比例为甲醇∶1‰乙酸=9∶1，流速为0.8 mL/min，进样量为20 μL，检测结束后根据其峰值计算样品中的SMX浓度。

利用qPCR对16S rRNA进行定量，在Applied biosystem Q1系统上进行，qPCR的反应条件为：94 ℃ 预变性 5 min、94 ℃变性 30 s、60 ℃ 退火 30 s、72 ℃ 延伸 1 min，39 个循环，72 ℃延伸10 min。

图4 不同浓度SMX下系统对SMX的去除Fig.4 Removal of SMX in the System under Different Concentrations of SMX

2.1 SMX的去除

如图4所示，本研究探究了批次试验中，硝化污泥系统对不同质量浓度的SMX(0.1、1.0、10.0 mg/L)的去除。质量浓度为0.1、1.0、10.0 mg/L下，SMX的去除速率分别为0.019、0.193、1.927 mg/(L·h),5 h后的去除率分别为93.60%、91.54%、89.22%。结果表明，SMX在3个反应器的去除率均能达到90%左右，这说明硝化污泥系统能够有效去除SMX，并且去除速率随SMX浓度的升高而升高，这可能是因为污泥对较高浓度的SMX吸附速率较快。

如图5所示，3个反应器中反应5 h后SMX的污泥吸附率分别为33.3%、31.2%、30.1%，生物降解率为60.3%、60.3%、59.1%。该结果表明SMX的去除主要依靠生物降解，这与文献[10-11]中的结果一致。硝化污泥系统中的氨氧化细菌和功能细菌共同促进了SMX的去除，具体分析见2.3.4小节。

图5 系统对SMX的吸附率和生物降解率Fig.5 Adsorption Rate and Biodegradation Rate of SMX in the System

2.2 SMX对硝化污泥系统性能的影响

2.2.1 SMX对CODCr去除的影响

如图6所示，探究了批次试验中不同浓度SMX对CODCr去除的影响。在0、0.1、1.0、10.0 mg/L SMX质量浓度条件下，CODCr的去除速率和5 h后的去除率分别为100.80、95.39、95.93、91.27 mg/(L·h)和95.76%、92.98%、94.90%、92.50%。值得注意的是，系统经过30 d的运行，即使在10.0 mg/L的SMX质量浓度下，CODCr的去除率仍高达92%。同样，吴伟民[13]在研究SMX驯化的不同污泥系统对CODCr去除情况时发现，在10 mg/L SMX硝化污泥系统中，CODCr的去除率能高达90.20%。可见，硝化污泥系统能够较好适应SMX的压力冲击。

2.2.2 SMX对氨氧化进程的影响

不同浓度SMX下系统的氨氧化进程如图7所示。0、0.1、1.0、10.0 mg/L SMX质量浓度下氨氮的去除速率分别为20.78、20.56、20.50、19.67 mg/(L·h),5 h后的去除率分别为99.99%、99.53%、98.02%、95.11%。与未加SMX系统相比，0.1、1.0 mg/L SMX下系统的氨氮去除速率和去除率没有明显变化，而10.0 mg/L SMX对氨氮去除的影响较大。这主要是因为较高浓度的SMX会对系统中硝化细菌产生抑制作用，这与杨腾飞等[14]的研究结果一致。虽然不同浓度SMX对氨氧化进程有一定程度的影响，但SMX浓度的增加并未显著影响氨氮的去除率，氨氮去除率均高于95%。这说明硝化污泥系统抗SMX冲击负荷能力较强，与CODCr去除的结论一致。

图7 不同浓度SMX下系统对氨氧化进程的影响Fig.7 Effect of the System on the Process of Ammonia Oxidation under Different Concentrations of SMX

2.3 SMX对硝化污泥系统中微生物群落的影响

2.3.1 微生物量的变化

研究[12]表明，16S rRNA可代表总微生物量。本研究对硝化污泥系统中不同SMX压力下的16S rRNA基因拷贝数进行了测定。如图8所示，随着SMX浓度的增多，硝化污泥系统中微生物量呈现逐渐减少的趋势，未投加SMX的硝化污泥系统中16S rRNA的基因浓度最高达到2.47×109copies/μL。这说明抗生素SMX抑制了系统中微生物的活性，从而导致微生物量的减少，并且抗生素SMX的浓度越高，对硝化污泥系统中微生物的毒性越大。

图8 不同浓度SMX下系统中16S rRNA浓度的变化Fig.8 Changes of 16S rRNA Concentration in the System under Different Concentrations of SMX

2.3.2 Alpha多样性指数分析

利用高通量测序技术对硝化污泥样本进行了Alpha多样性分析，分析结果如表2所示。Alpha多样性包括OTUs、Shannon、Simpson、Chao1、ACE等多种指数，可以多角度反映样品中微生物群落多样性的差异情况[15]。由表2可知，OTUs、Shannon、Simpson指数均呈现随着抗生素SMX浓度增大而减小的趋势，抗生素SMX直接影响了硝化污泥中微生物群落的多样性和均匀度。这时SMX持续产生选择性压力，无法耐受SMX的微生物逐渐死亡，导致多样性的减少。由Chao1指数和ACE指数可知，0.1、1.0 mg/L SMX系统中的微生物群落相对丰度要高于其他系统，并且1.0 mg/L SMX系统中微生物群落相对丰度最高，10.0 mg/L SMX系统中最低。这是因为经过一段时间的驯化，适宜浓度的SMX可以提高系统中微生物群落的丰富度。而SMX浓度过高，导致一些微生物无法适应而死亡，造成微生物丰富度的降低。

表2 Alpha多样性指数Tab.2 Alpha Diversity Indices

2.3.3 门水平上的菌群变化

系统中微生物在门水平上的种类和相对丰度如图9所示。在各硝化污泥样本中变形菌门(Proteobacteria)是相对丰度最高的菌门，占50%以上。该结果说明SMX的投加及其浓度变化并未对Proteobacteria的相对丰度产生显著影响。研究[16-17]表明，Proteobacteria含有能够降解芳香族污染物的细菌，在活性污泥中具有极为重要的作用，是常见的优势菌。拟杆菌门(Bacteroidota)是不同SMX浓度的污泥样本中另外一种优势菌门，其丰度随着抗生素浓度的升高而不断升高。产生这种现象的原因是由于Bacteroidota中大多数细菌为化能自养型，它们能够降解复杂的有机物，SMX浓度的提高为它们提供了足够的碳源和能源。综上，在不同抗生素SMX压力下，硝化污泥系统中微生物的群落结构发生了显著的变化。

图9 不同SMX浓度样本中门水平上菌群的相对丰度Fig.9 Relative Abundance of Microorganisms in Samples with Different SMX Concentration at Phylum Level

2.3.4 属水平上的菌群变化

微生物菌群在属水平上相对丰度的变化如图10所示。由图10可知，抗生素SMX浓度越高，其对微生物群落的影响越大。亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、unidentified_Nitrospiraceae、球衣菌属(Sphaerotilus)、动胶菌属(Zoogloea)、噬氢菌属(Hydrogenophaga)的相对丰度在0.1、1.0 mg/L的SMX的硝化污泥样本中较高，Nitrosomonas、Nitrospiraceae是常见的氨氧化细菌，其分泌的氨单加氧酶可以共代谢降解多种抗生素[5,18-19]，Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga均有降解有毒物质和有机物的能力[20-21]。因此，氨氧化细菌(Nitrosomonas、Nitrospiraceae)和优势菌(Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga)共同促进了0.1、1.0 mg/L SMX的去除。而在10.0 mg/L SMX的污泥样本中，氨氧化细菌丰度较低，这与上述10.0 mg/L的SMX影响氨氧化进程结果一致(图7)。另外，优势菌属[陶厄氏菌属(Thauera)、固氮弧菌属(Azoarcus)、黄杆菌属(Flavobacterium)]随着SMX浓度的增大，其相对丰度呈现逐渐升高的趋势。研究[22]发现Thauera能够降解芳香族污染物，Azoarcus可以代谢苯系污染物，而SMX是一种含有芳香结构的抗生素，推测Thauera和Azoarcus是一种SMX降解菌。Flavobacterium可以降解多种抗菌药物，其可能对磺胺类抗生素也存在一定的降解能力。因此，Thauera、Azoarcus、Flavobacterium的富集使10.0 mg/L的SMX得到高效去除。

图10 不同SMX浓度样本中属水平上菌群的相对丰度Fig.10 Relative Abundance of Microorganisms in Samples with Different SMX Concentration at Phylum Level

(1)硝化污泥系统能够有效去除SMX，不同浓度SMX(0.1、1.0、10.0 mg/L)的去除率均能达到90%左右。其中，SMX主要是通过生物降解去除的。

(2)不同浓度SMX系统中CODCr和氨氮的去除率均高于90%，硝化污泥系统抗SMX冲击负荷能力较强。

(3)不同SMX压力会显著地影响硝化污泥系统中微生物群落结构。Proteobacteria和Bacteroidota是不同污泥样本中的优势菌门，氨氧化细菌(Nitrosomonas、unidentified_Nitrospiraceae)和优势菌(Sphaerotilus、Zoogloea、Hydrogenophaga)共同促进了0.1、1.0 mg/L SMX的去除，而Thauera、Azoarcus、Flavobacterium的富集使10.0 mg/L的SMX得到高效去除。

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