强舒降压方对L-NAME诱导大鼠高血压的干预作用及其机制
时间：2023-03-11 15:05:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
黄自通，杨伟韬，黄晓霞，王红刚，周敏华，罗兰
（1.清远职业技术学院，广东 清远 511510；
2.广东药科大学中药学院，广东 广州 510006；
3.广东省中西医结合医院，广东 佛山 528200）
高血压属于一种慢性病，临床上可引起脑卒中、心肌梗死、心力衰竭等心血管疾病，同时高血压还会诱导一些并发症如肾病、肝病，是威胁人类健康的重要因素[1]。2017年中国约3.2 亿的中老年人患有高血压，高血压已成为危害中老年人健康的重大公共卫生问题[2-4]。FDA 批准的降压药不良反应涉及血管性水肿、咳嗽、肾功能障碍和高钾血症等[5-6]。近年来，人们开始将研究治疗高血压的目光转向中医药，并筛选出了一批具有降血压作用的单味中药和方剂，如葛根、山绿茶、心肌尔康、平肝潜阳汤、镇肝熄风汤[7-12]等。通过中药给药，不仅可以减缓甚至抑制高血压的发生，而且还可治愈高血压，一定程度上提高患者的生活质量，对于高血压的治疗具有极大的潜力[7-12]。
强舒降压方（QJF）是本题组根据临床用药及文献总结的基础上，在临床中医医生的指导下化裁的一个降压处方，在应用中具有很好的降压作用。该方由川牛膝、山绿茶、仙灵脾、杜仲、葛根5味中药组成。本实验通过研究QJF 对由N-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME）引起的NO 缺乏而诱导的高血压大鼠血压的影响及相关作用机制的探讨，为临床用药提供参考。
1.1 实验动物
SPF级Wistar雄性大鼠60只，体质量200～250 g，购自南方医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（粤）2016-0041。实验动物适应性饲养1周，自由饮食、饮水，饲养于广东药科大学实验动物中心大鼠房，实验内容符合实验动物的伦理要求，实验过程严格遵守中华人民共和国的《实验动物管理条例》。
1.2 药材与试剂
川牛膝、仙灵脾、杜仲、葛根均产于四川，山绿茶产于广西上林，由广东药科大学王红刚高级实验师鉴定为正品。L-NAME（上海源叶生物科技有限公司）；
卡托普利（国药集团汕头金石制药有限公司）；
内皮素-1（ET-1）、血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）等ELISA 分析试剂盒，均购自江苏酶免实业有限公司。
1.3 实验仪器
MD3000生物信号采集处理系统及DB128无创血压测量分析系统（北京智鼠多宝生物科技有限责任公司）；
TC-150B/Q 脱水机（湖北泰维科技实业股份有限公司）；
MPW-352R 台式冷冻离心机（广州华启运精密仪器有限公司）；
BA310-T 生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；
TR-180I自动染色机（湖北泰维科技实业股份有限公司）；
PTX-FA2105L 电子天平[华志（福建）电子科技有限公司]。
2.1 药液的制备
将川牛膝、山绿茶、仙灵脾、杜仲、葛根分别粉碎后过20 目筛，按3.34∶1∶5∶5∶5 的质量比混合，料液比1∶20（g/mL）加蒸馏水浸泡4 h，热回流提取3次，提取液过滤后合并，使用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，待用。
2.2 动物分组及给药
将60 只大鼠随机分成5 组，分别为模型组（LNAME 50 mg/kg）[13]、高剂量组（L-NAME 50 mg/kg+QJF 12 g/kg）、低剂量组（L-NAME 50 mg/kg+QJF 6 g/kg）、阳性组（L-NAME 50 mg/kg+卡托普利10 mg/kg）及空白组，每组12 只。适应性喂养1 周后，配制低剂量组质量浓度为0.27 g/mL 的药液，高剂量组为0.54 g/mL 的药液，L-NAME 浓度为0.005 g/mL，于每天上午10 点灌胃给药，给药剂量为1 mL/100 g，1天1次，连续灌胃4周。
2.3 血压测量
大鼠固定于37 ℃恒温、安静的笼具中，使用无创血压测量分析仪测量大鼠的收缩压（SBP）、舒张压（DBP）和心率（HR），每周测量大鼠血压1 次，每次连续测血压5次，取平均值。
2.4 取材
实验第4 周时，于最后1 次给药1 h 后，10%（φ）水合氯醛0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，取胸主动脉、心脏、肾脏等。
2.5 形态学观察
取胸主动脉并除去周围的结缔组织，置于包埋盒放入10%（φ）甲醛溶液中固定，固定时间为48 h以上。经过脱水后将血管切成小段，修整齐，接着包埋和切片，脱蜡后进行HE染色，用×400的生物显微镜观察组织形态、细胞大小等，并摄片。
2.6 血清中的指标检测
腹主动脉取血4 mL注入普通真空采血管，静止30 min 后，4 000 r/min 冷冻离心15 min，取血清，ELISA 检测其ET-1、vWF、TNF-α、eNOS 的含量，数据均重复测量3次，取平均值，实验严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.7 血浆NO含量的测定
步骤同“2.6”项下，腹主动脉取血3 mL 注入肝素钠真空采血管，静止30 min后，3 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液得到血浆，ELISA 检测血浆NO的含量，均重复测量3 次，取平均值，实验严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.8 组织匀浆指标测定
大鼠取血后，从左心室插入针管并用生理盐水对心脏进行灌流，并摘除心脏、肾脏，迅速放到液氮中冻存。对心脏、肾脏分别匀浆、离心，取上清液，ELISA 检测心脏MMP-9、肾脏TNF-α的含量。以上数据均重复测量3次，取平均值，实验严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.9 统计学方法
实验数据以表示，用GraphPad Prism8 绘图统计分析软件对数据进行方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
3.1 QJF对高血压大鼠血压的影响
由表1可知，第1～4周，与空白组相比，模型组大鼠经L-NAME 诱导后SBP、DBP 均显著升高（P<0.05，P<0.01））；
从第2 周开始，QJF 干预组的SBP、DBP 与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01 或P<0.05）；
卡托普利组与QJF 高剂量组的SBP<140 mmHg，效果显著（P<0.01）。心率1～4 周差异均无统计学意义（P>0.05）。
表1 QJF对L-NAME诱导高血压大鼠SBP、DBP及HR的影响Table 1 Effect of QJF on SBP，DBP and HR in L-NAME-induced hypertensive rats(±s,n=12)
表1 QJF对L-NAME诱导高血压大鼠SBP、DBP及HR的影响Table 1 Effect of QJF on SBP，DBP and HR in L-NAME-induced hypertensive rats(±s,n=12)
与空白组比较：*P<0.05，**P<0.01；
与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。
第4周106.59±5.36 86.61±3.81 356±12.40 158.43±8.31**128.21±6.96**338±11.41 128.55±7.89##99.22±4.37##338±18.91 145.29±10.63#109.99±5.88##328±7.50 137.96±7.95##116.20±8.03##341±4.54组别空白组模型组卡托普利组QJF低剂量组高剂量组指标SBP/mmHg DBP/mmHg HR/（次·min-1）SBP/mmHg DBP/（次·min-1）HR/mmHg SBP/mmHg DBP/（次·min-1）HR/mmHg SBP/mmHg DBP/（次·min-1）HR/mmHg SBP/（次·min-1）DBP/mmHg HR/mmHg第1周101.03±6.32 81.12±3.32 367±13.72 113.36±8.02*84.54±6.99 338±16.53 111.32±9.18 85.32±1.69 354±11.12 114.20±8.41 80.57±3.31 330±6.06 115.45±9.15##90.67±3.16 343±11.69第2周105.42±7.19 78.53±2.87 369±16.34 138.98±15.93**91.37±8.73**353±7.38 117.66±7.46##89.05±4.46 ##354±18.32 120.63±7.53#85.34±3.23##339±10.61 116.49±8.06##89.24±4.30##347±16.55第3周106.42±11.03 80.43±5.71 353±11.20 153.2±18.11**117.46±9.71**346±6.69 120.48±9.77##97.68±4.36##357±16.06 125.37±13.09##98.30±8.72##337±13.87 129.80±12.02##107.7713±6.11##331±14.87
3.2 QJF 对L-NAME 诱导高血压鼠血浆NO 含量的影响
由图1可知，模型组大鼠血浆NO含量较空白组显著降低（P<0.01），QJF 干预的低剂量组及高剂量组血浆NO 含量较模型组显著升高（P<0.01），卡托普利组NO 含量亦高于模型组（P<0.01），QJF 高剂量组NO含量与卡托普利组相当。
图1 QJF对L-NAME诱导高血压鼠血浆中NO含量的影响Figure 1 Effect of QJF on plasma NO content in L-NAMEinduced hypertensive rats(±s,n=12)
3.3 QJF 对L-NAME 诱导高血压大鼠血清中ET-1、vWF、TNF-α、eNOS含量的影响
由图2可知，模型组大鼠血清中ET-1、vWF、TNF-α含量较空白组显著升高（P<0.01），eNOS 较空白组显著降低（P<0.01）。QJF 低剂量组、高剂量组和卡托普利组的ET-1、vWF、TNF-α较模型组显著降低（P<0.01），eNOS较模型组显著升高（P<0.01）。
图2 QJF 对L-NAME 诱导高血压大鼠血清ET-1、vWF、TNF-α、eNOS含量的影响Figure 2 Effect of QJF on the content of serum ET-1，vWF，TNF-α and eNOS in L-NAME-induced hypertensive rats（±s,n=12）
3.4 QJF 对L-NAME 诱导高血压大鼠心脏、肾脏匀浆中TNF-α、MMP-9含量的影响
由图3可知，模型组大鼠肾脏中的TNF-α含量较空白组显著升高（P<0.01），QJF 低剂量组与高剂量组的肾脏TNF-α含量较模型组显著降低（P<0.01），并与卡托普利组效果相当。QJF低剂量组与高剂量组的MMP-9含量较模型组显著降低（P<0.01）。
图3 QJF 对L-NAME 诱导高血压大鼠心脏MMP-9、肾脏TNF-α含量含量的影响Figure 3 Effect of QJF on the content of renal TNF-α and cardiac MMP-9 in L-NAME-induced hypertensive rats（±s,n=12）
3.5 形态学观察
由图4可知，空白组大鼠胸主动脉内膜完整，中膜厚度适中，肌纤维排列有序，未见血管平滑肌细胞增生，细胞核大小相近；
模型组血管内膜连续性差，肌纤维排列紊乱，细胞核大小不均，存在钙化现象；
卡托普利组和低剂量组、高剂量组干预后，内膜的连续性、肌纤维排列紊乱及细胞核大小不均等情况较模型组均有所改善。
图4 QJF对L-NAME诱导高血压大鼠胸主动脉病理学的影响Figure 4 Effect of QJF on pathology of thoracic aorta in LNAME-induced hypertensive rats（HE，400×）
高血压随年龄增高而患病率明显增加，多发于中老年。中医认为，高血压多为本虚标实之证，其病位在肝，根源在肾。肾气亏虚，精髓不足，水不涵木，肝阳亢于上，进而导致五脏功能失调，出现各种变证。临床表现为头晕、头重、头痛、健忘失眠、烦躁、视物昏花、腰膝酸软、耳鸣耳聋、性功能衰退，都反映了高血压病的肾虚的客观存在。故本方选用杜仲、仙灵脾、川牛膝以滋补肝肾，阴阳平补，以顾其本；
辅以葛根升阳通经活络之功，另用山绿茶清热平肝之效，各药相互配合，达到补肝肾、化瘀血、清肝火及降血压的目的。强舒降压方中各味药均具有较好的降压作用[18-22]。
本研究发现，QJF具有很好干预大鼠的收缩压、舒张压及大鼠体内的氧化应激及炎症反应作用。NO 是一种内源性舒张因子，由eNOS 催化合成，对心血管系统各种生理和病理生理过程起着重要作用。由L-NAME 诱导的高血压模型使机体缺乏NO的情况下很容易发生氧化应激和炎症反应。有文献表明[23]，NO 主要是通过扩张血管、抑制平滑肌细胞的增生，从而发挥降低血压的作用，NO 还能阻止血细胞与血细胞及血细胞与内皮细胞之间的黏连，使血流通畅。权赫秀等[24]使用L-NAME 抑制eNOS活性，减少NO 合成时发现血管内皮细胞破碎杂乱，SOD 活性减弱，血压升高等现象。ET-1 是调节心血管功能的重要因子，维持基础的血管张力和心血管系统的稳定性，当体内血管内皮功能发生障碍时，由血管内皮细胞合成ET-1增加，导致血管张力调节功能紊乱，血管重构。谢祥红[25]研究原发性高血压患者血浆中ET-1变化发现，ET-1含量与24 h血压呈正相关，比健康人群体内含量高，其可能是血压升高的另一个主要因素。vWF 由血管内皮细胞分泌，被作为高特异性和高敏感性血管内皮损伤标记物，是血栓形成与止血过程中的主要糖蛋白之一，且具有血管内皮细胞特异源性，故被认为是内皮损伤的有效标志物。本研究中卡托普利组与QJF治疗组较模型组差异有统计学意义，说明L-NAME 诱导的高血压对血管的影响较大，会造成血管壁增厚、血管损伤、甚至血管重构，QJF 对血管具有保护作用。QJF 可显著升高大鼠体内eNOS 的含量，降低血清中ET-1、vWF 的含量。MMP-9 与高血压病程中的心脏重构密切相关，主要表现在心肌肥大和心肌纤维化两方面[26]。骆露媛[27]通过两肾两夹模型，研究MMP-9在肾血管性高血压中的发病机制发现，特异性抑制MMP-9 的表达可有效降低肾血管性高血压大鼠的血压，在血管重构方面亦有关联，推断MMP-9是高血压发生的重要原因。因此，本研究中强舒降压方的降压机制可能与抑制心脏MMP-9的表达有关。
高血压肾病是高血压并发症之一，通过肾脏的氧化应激，诱导产生多种因子，如NF-kB，形成肾脏炎症状态[28]。TNF-α是炎症反应的重要指标之一，刘振岳等[29]研究结果表明，炎症损伤这一现象贯穿了高血压病发生发展的整个过程，是高血压病发生发展中一个重要的环节，而TNF-α为炎症因子家族中的促炎因子。本研究中，模型组肾脏匀浆的TNF-α较QJF治疗组显著升高，提示肾脏存在炎症，炎症过程与高血压的发生相关，因此检测TNF-α含量有利于探讨高血压病中的炎症损伤程度。
同时，由于L-NAME 通过抑制eNOS 活性来阻断NO 形成，进而导致持续性系统高血压，造成血管内皮功能障碍及心脏重构[30]。胸主动脉病理切片结果表明，QJF干预组在内膜连续性、肌纤维排列、细胞核大小等方面均有改善。与检测的ET-1、vWF、NO指标相对应，主要通过改变血管形态而达到降压的作用。
综上，QJF 能降低L-NAME 诱导的高血压大鼠的血压，其机制可能是通过提高NO、eNOS 含量，抑制脂质过氧化损伤和血管损伤，降低ET-1、vWF、TNF-α、MMP-9 含量。本实验通过药物的配伍使用，为降血压药物的开发提供了新的途径，同时也为临床用药提供参考。
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