硫化氢的病理生理功能、检测方法及供体药物研究进展

赵迎汐，佟杰，李达翃，王立辉*（.沈阳药科大学生命科学与制药学院，沈阳 0000；
.沈阳市红十字会医院，沈阳 0000）

硫化氢（H2S）作为内源性气体递质家族成员，是重要的信号分子。体内H2S 水平的变化已被证实能介导包括动脉粥样硬化、帕金森综合征（PD）、阿尔茨海默病（AD）、癌症在内的多种疾病。其调控机制复杂，影响因素多样。近年来，H2S 的供体化合物已成为多种疾病治疗靶点的备选药物。此外，在肿瘤中H2S 低促高抑的“钟形调控”使抑制H2S 生物合成和补充外源性H2S 成为癌症治疗的两种不同方式。然而，已经问世的胱硫醚γ-裂解酶（CSE）抑制剂活性低、选择性差，使得H2S 供体药物异军突起。目前文献报道的不同方法检测内源性H2S 的释放量及浓度有较大差异，各有利弊，尚无统一标准。本文概述了H2S 在疾病中的调控机制，归纳检测H2S 释放方法的优势及局限性，同时总结能够模拟内源性H2S 释放并进入临床研究的化合物，以期为H2S供体药物的临床前研究提供参考。

H2S 是继一氧化碳（CO）与一氧化氮（NO）之后的第三种气体信号递质[1]，自1996年Ade和Kimura 对内源性H2S 进行研究以来[2]，越来越多的研究阐明了内源性H2S 的调控作用以及治疗前景。内源性H2S 的释放主要归因于体内的CSE、胱硫醚-β-合成酶（CBS）与3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）的作用[3]。据报道，CBS主要存在于中枢神经系统与肝脏中[4]，CSE 则更多地出现在心血管系统中[5]，而3-MST 位于肝、肾、心、肺、胸腺、睾丸和脑中[6]，因此H2S 在人体不同组织中广泛表达，主要存在于血液、血浆、肠道和大脑中。H2S 在哺乳动物血液中的浓度为30～100 mmol·L－1，在大脑中为50～160 mmol·L－1[7]。H2S 作为经典气体递质之一，参与调节包括肠道疾病[8]、心血管疾病[9]、神经退行性疾病[10]、炎症[11]、肿瘤[12]等在内的多种病理过程，如表1所示。H2S 在体内的持续、可控释放的研究对临床具有重要的价值。

表1 H2S 在生理病理中的调控作用Tab 1 Regulatory role of H2S in physiological pathology

1.1 H2S 与神经退行性疾病

H2S 作为中枢神经系统中调节功能的关键因子，通过提高环磷酸腺苷（cAMP）生成，增强中枢神经系统神经元中N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDA 受体）对谷氨酸（Thr）的敏感性[13]，诱导海马体的长时程增强[14]，从而实现学习以及记忆突触的可塑性过程。内源性H2S 在PD、AD 等中枢神经退行性疾病中的生成通常被严重抑制。Xie 等[15]在6-羟基多巴胺诱导的PD 大鼠模型中发现内源性H2S 的产生随PD 的发展减少，给予硫氢化钠（NaHS）可以减少该模型大鼠的行为症状和多巴胺能神经元的变性，在AD 患者中也观察到了类似的现象。受其启发，Giuliani 等[16]在脑内注射β-淀粉样蛋白1-40（Aβ）或链脲佐菌素诱导的AD 大鼠与含有人类转基因PS1M146V、tauP301L的AD 小鼠模型中使用硫化钠（Na2S）进行短期或长期治疗后，均发现AD 模型鼠的学习能力增强，记忆障碍降低，这也表明促进H2S释放能够减缓AD 的进展。

1.2 H2S 与炎症

在炎症的调节中，H2S 的促炎和抗炎活性都有相关报道[17-19]。首先以急性肺损伤（ALI）为例，有研究表明，静脉注射NaHS 可显著降低血浆以及肺组织中的促炎性细胞因子（IL-6、IL-8），同时增加抗炎趋化因子（IL-10），由此减轻ALI 程度（如图1A 所示）[17]。而在呼吸道炎症中，Esechie 团队[18]在感染呼吸道合胞病毒的小鼠鼻内注射H2S 供体药物GYY4137（见图2），其持续释放的H2S 通过促进NF-κB 以及激活IRF-3 的方式，抑制病毒复制，减少促炎介质，发挥抗炎作用。还有研究表明，H2S 可通过减少黏附分子抑制白细胞浸润，抑制粒细胞髓过氧化物酶活性以及诱导巨噬细胞对促炎刺激（如细菌内毒素的低反应性）影响炎症细胞的一系列功能[19]。以上结果均表明H2S 供体可成为有效的抗炎剂。H2S 还表现出一定的促炎作用。如高浓度的H2S[20]可以通过扩血管、促进水肿以及触发痛觉的方式在内毒素休克动物模型中产生促炎作用。此外，在类似的几种炎症动物模型中，血浆中H2S浓度、组织中H2S 合成能力以及CSE 表达均增强，表明内源性H2S 可能具有促炎作用[21]。这些矛盾的结论意味着除了已被证实的机制外，还存在一些未知的机制。观察到的结果可能来自多种机制平衡的结果，且H2S 的作用受浓度、反应时间以及疾病类型的影响。因此，H2S 是在炎症中调控的确切机制还需要进一步研究。

图2 H2S 供体药物结构式Fig 2 Structural formula of H2S donor drugs

1.3 H2S 与心血管疾病

H2S 在控制心血管内稳态方面具有生物学意义。H2S 主要通过激活血管KV7 电压门控钾通道，抗纤维化和抗凋亡作用，减少氧化应激和炎症反应，调控microRNA 表达以及促进血管生成，从而实现对心脏的保护作用[9]。一方面，H2S 通过VEGFR2-mTOR 途径[22]，诱导人微血管内皮细胞HMEC-1 与人脐静脉内皮细胞HUVECs 中调节血管生成的关键因子miR-640 的表达降低，进而导致缺氧诱导因子（HIF1α）表达增加，最终促进血管生成；
另一方面，H2S 通过抑制肾上腺素（ADR）、二磷酸腺苷（ADP）、花生四烯酸（ARA）、血栓素模拟物（U46619）以及凝血酶诱导的血小板聚集或黏附从而引起血管平滑肌的松弛效应（如图1B 所示）[23]。CSE 是心血管系统中产生H2S 进而舒张平滑肌最主要的胞质酶[24]，其mRNA 在血管平滑肌中高表达[25]。经证实，小鼠敲除CSE基因后，其血清、心脏以及主动脉中的H2S 水平均显著降低，且表现出内皮功能受损，进一步发展为高血压和动脉粥样硬化[26]。H2S 具有松弛大鼠胸主动脉、门静脉和肠系膜动脉的能力，其扩张血管作用可能与高血压治疗的潜力密切相关[27]。因此，H2S 经常被描述为“有效的血管舒张剂”[28]，为治疗动脉粥样硬化、心肌缺血等心血管疾病药物的研发提供了新的选择。

图1 H2S 在疾病中的调控作用Fig 1 Regulation of H2S in diseases

1.4 H2S 与肿瘤

H2S 在肿瘤领域中扮演着复杂且重要的角色，其在肿瘤治疗中呈现钟形模式。低水平的H2S 通过诱导血管生成、加速细胞周期和抑制细胞凋亡，从而促进肿瘤的发生发展。以在结直肠癌（colorectalcancer，CRC）中的调控为例，目前研究主要集中于合成H2S 的三种关键酶对结直肠癌的影响。Szabo 团队研究显示，CRC 肿瘤组织中CBS 选择性表达升高，CSE 和3-MST 的表达水平保持不变[29]。用shRNA 敲除CBS基因后，PI3K 激活以及结肠癌细胞HCT116 中的氧化磷酸化、糖酵解被抑制从而显著降低结肠癌细胞HCT116 的增殖侵袭能力。也有研究显示，过表达CSE、3-MST 也能促进结肠癌细胞的增殖、侵袭以及迁移[30]。上述研究显示通过靶向抑制H2S合成酶进而抑制H2S 的内源性合成对抗肿瘤有着巨大潜力。

从供体中释放的高浓度外源性H2S 可通过诱导多种通路磷酸化选择性地抑制肿瘤的进展[31]，例如在三阴性乳腺癌（TNBC）中，一方面，H2S供体及其衍生物通过抑制NF-κB、PI3K/AKT/mTOR 和Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路相关蛋白的磷酸化表达以及上调caspase-3/9、PARP 等凋亡标志物水平，有效抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭转移[32]；
另一方面，H2S 供体及其衍生物通过抑制β-catenin 通路的异常激活，抑制基质金属蛋白酶MMP2/9 的表达，从而产生较强的抗肿瘤作用（如图1C 所示）。Chattopadhyay 团队[33]在体内外实验均验证了阿司匹林H2S 供体衍生物HSASA 可通过抑制NF-κB 通路以及硫氧还蛋白还原酶-1（TrxR）活性，上调活性氧（ROS）水平进而有效抑制TNBC 的进展，且无明显不良影响。在胰腺癌中也是如此，Citi 团队[34]报道高浓度的H2S 供体Erucin（30～100 μmol·L－1）可在胞内释放H2S，通过降低ERK1/2 的磷酸化，上调caspase-3 和caspase-7 的表达进而诱导细胞凋亡。目前市场上有200 余种FDA 批准的含硫小分子药物，广泛用于治疗各种疾病。Devimistat（见图2）是H2S 供体lipoate 的类似物，已被欧洲药品管理局（EMA）批准为孤儿药物，通过激活AMPK 信号通路[35]、触发ROS 相关的细胞凋亡、增加自噬、抑制脂质代谢进而治疗转移性胰腺癌。此外Venetoclax、Trabadectin、博来霉素等也已应用于肿瘤治疗[36]。

正是受这种钟形模式调控的启发，内源性H2S 合成酶抑制剂（CBS、CBE 和3-MST 抑制剂）以及H2S 供体为肿瘤治疗开辟了两种截然不同的抗肿瘤策略。但内源性H2S 合成酶抑制剂选择性较差，活性低，而开发H2S 供体在体内选择性释放一定浓度的H2S 更容易实现，在肿瘤治疗领域具有更加广阔的前景。H2S 供体可以作为候选药物与市场上销售的抗肿瘤药物相结合，以达到提高疗效，增加选择性并降低不良反应的功效。但目前缺少对H2S 供体药物的给药剂量、与化疗药物的联合治疗方案以及疗程长短方面的研究。

目前筛选H2S 供体药物主要通过检测其在体内释放H2S 的能力。但文献报道的不同方法检测内源性H2S 的释放量及浓度有较大差异。迅速、实时及准确监测体内及外源性供体释放的H2S 水平仍是富有挑战性的课题。目前，检测H2S 的常规方法包括亚甲蓝法、H2S 离子选择性电极法、色谱法[高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）]和H2S 荧光探针法[37]，其优势以及局限性见图3。

图3 H2S 检测方法的优势及局限性Fig 3 Advantages and limitations of H2S determination method

2.1 亚甲蓝法

亚甲蓝法是最为简便的检测H2S 释放的方法，其原理是H2S 在pH＜7 及三氯化铁（FeCl3）共同存在的条件下与N，N-二甲基对苯二胺溶液反应生成亚甲基蓝，通过检测亚甲基蓝在670 nm附近的吸光度对H2S 进行定量[38]。但由于亚甲蓝法的检测灵敏度低（仅限μmol·L－1范围），并且生理性H2S 是在酸性条件下释放的，储存不稳定，因此H2S 的浓度可能会被错误估计。

2.2 敏感硫电极法

敏感硫电极法具有测量范围广，稳定性与重复性良好等特点。近年来已应用于大鼠心脏、脑、肾脏、肝脏、骨骼肌等组织中H2S 的测定[39]，通常用来测定大鼠及人血浆中内源性H2S 的浓度。其原理是将以化学形式存在的H2S 与抗氧化液反应生成硫离子（S2－），取抗氧化液与血浆（1∶1）组成的混合溶液，将敏感的银/硫电极（pAg/S-1）与参比电极共同浸入样品中，用无机固体电解质（ISE）分析仪检测微量S2－，然后根据S2－溶液标准曲线计算测试样品中的H2S 水平。但其检测H2S 含量精确度不够高。

2.3 气相色谱-硫化学发光联用气相法

气相色谱-硫化学发光联用法检测是利用气相色谱结合硫化学发光检测法分析生物样品中的H2S 水平。该方法测定生物样品中的H2S 含量依赖于密封样品室中液体样品和气相之间的H2S 平衡。样品中的H2S 经气相色谱与其他硫化合物分离后在检测器中燃烧，产生一氧化硫（SO），再与反应池中臭氧（O3）反应后生成能发光的二氧化硫（SO2），使用光电倍增管测量光强，其信号与SO2的浓度成线性[40]。该方法具有检测限低、灵敏度高（在nmol·L－1范围内）等优势，但要确保设备的气密性，且需要较长的平衡时间。因此在内源性H2S 的含量测定中并没有得到广泛应用。

2.4 溴甲烷高效液相色谱分析法

溴甲烷是巯基特异性荧光标记试剂，一分子H2S 同两分子的溴甲烷发生反应生成特异性的标记产物硫化乙硼烷，能与谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）等其他具有疏基结构的物质进行分离，可以采用荧光和质谱联用的方法进行分析定量，该方法灵敏度、选择性更高[41]。但由于需要破碎细胞或组织，所以检测结果并不一定能真实反映实际H2S 水平。

2.5 荧光探针法

近几年相继报道了百余种灵敏的、可实时监测的、结构新颖的荧光探针用于H2S 检测。良好的H2S 荧光探针要求其在高浓度的硫醇或还原剂的存在下仅与H2S 反应，在生理H2S 浓度范围内呈现线性响应，有良好的通透性和细胞内稳定性，便于储存或可商业化等。这些优势使荧光探针法成为检测H2S 含量方法的“后起之秀”。目前已研发的H2S 荧光探针分为三类：① 通过亲核反应与H2S 反应的探针；
② 被H2S 选择性还原的探针；
③ 使用配位金属捕获H2S 的探针[42]。例如SPF1～5，WSP1～5，DSP，MBB，CAY，P3 等，其中WSP1、WSP5、CAY 和P3 是近年来已经实现商业化的探针，均属于基于亲核进攻机制的探针。有团队对它们进行系统的评估，发现CAY 仅在高浓度H2S 下产生荧光信号，P3和WSP1 显示出0～50 μmol·L－1的窄线性范围，相比而言WSP5 的线性范围较宽（0～100 μmol·L－1）。且当存在少量表面活性剂CTAB 时，可增强WSP5 探针溶解度，荧光强度达到峰值的时间从30 min 降为5 min。WSP5 对H2S 具有更宽的灵敏度线性范围，受硫醇和其他活性硫物质的干扰最小，在不同pH 环境中最稳定并且能够在活细胞中对H2S 进行荧光成像。目前WSP5 在国内外已广泛用于测试内源性或外源性H2S 的释放。

随着对H2S 调控作用的深入了解，释放H2S的供体化合物已成为将H2S 用于疾病的治疗的备选药物。增加H2S 生物利用度的策略是可行的治疗方法，但是目前文献中描述的符合该要求的H2S 供体非常少。研究普遍选择用硫化物盐（NaHS、Na2S）充当实验中内源性释放H2S 的工具，尽管这些盐价格便宜、容易获得且使用方便，但NaSH 和Na2S 是简单的盐，H2S 生成依赖于pH 的解离，且产生的H2S 是瞬时短暂的，无法进行持续性研究。其次由于硫化物盐缺乏靶向能力，只能用于全身给药，且由于这些硫酸盐产生的H2S 在几秒钟内就会消散，因此H2S 生物学研究经常需要使用高剂量（＞100 μmol·L－1）才能在细胞或组织中引发生物反应，这会导致血液和组织中H2S 浓度飙升，远超生理水平，然后迅速下降。由于硫化物无机盐H2S 释放的即时性和易氧化性，其使用受到严重限制。这些局限性促使研究工作者不断寻找可控、缓释、靶向释放的H2S 供体。目前具有一定研究基础的模拟内源性H2S 释放的化合物主要包括H2S 供体中的先驱化合物GYY4137，表现出抗炎作用的萘普生H2S供体衍生物ATB-346，可用作结肠镜检查中镇静剂的马来酸曲美布汀盐H2S 供体衍生物GIC-1001以及有心脏保护作用的SG1002（见图2）。

3.1 GYY4137

二硫代磷酸酯GYY4137 是第一个水溶性缓释型H2S 供体[43]，是缓释H2S 供体中的先驱化合物。其H2S 的生成速度更容易模拟从CSE、CBS和3-MST 等酶中内源性合成的H2S，更加准确地模拟内源生成的H2S，而不是将H2S 作为单一的浓缩剂输送。且GYY4137 的高水溶解性使其用于细胞、组织和动物实验更加方便。但由于其与水接触时就会开始产生H2S，且产生效率较低，因此应避免冻融和重复使用储存液，并且应在高浓度或高剂量下使用[44]。

从目前研究情况来看，GYY4137 在高血压、动脉粥样硬化[45]、脑缺血再灌注（I/R）损伤[46]、肺损伤及多种癌症的细胞和动物疾病模型中显示出良好的治疗效果。GYY4137在不同浓度（100～1000 μmol·L－1）可诱导结直肠癌（HCT-116）、肝细胞癌（HepG2）、乳腺癌（MCF-7）、骨肉瘤（U2OS）、急性早幼粒细胞白血病（HL-60）的人癌细胞系发生显著的G2/M 期细胞周期阻滞以及依赖于PARP/Caspase-9 的凋亡细胞死亡，在体内外均显示出显著的抗肿瘤活性。

3.2 SG1002

SG1002 是一种可以缓慢产生H2S 而不产生副产物的H2S 供体药物。SG1002 在心脏病、心力衰竭、动脉粥样硬化等小鼠模型中显示出对心脏、血管的保护作用[47]。SG1002 在健康志愿者以及心力衰竭患者身上已完成了为期21 d 的Ⅰ期临床试验，该结果揭示了SG1002 的心脏保护作用，包括减少心肌纤维化、增加心肌血管供应以及NO 生物利用度等[48]。目前Ⅱ期临床试验正在计划中。

3.3 ATB-346

ATB-346是一种基于萘普生的H2S 供体非甾体抗炎药（H2S-NSAID）[49]。ATB-346 避免了NSAID由于对环氧合酶（COX）-1 或COX-2 的单一抑制，在不同组织器官中表达失衡而产生的不良反应。其在被酶分解时通过释放H2S 达到对胃和心脏等器官的保护作用，在炎症途径的多个潜在方面发挥作用。一项244 名健康志愿者参与的Ⅱ期临床试验中提供了明确证据，ATB-346（250 mg·d－1）对COX-2 的抑制作用与萘普生（550 mg·d－1）的抑制程度相同[50]。与萘普生相比，ATB-346 显示出了更高的镇痛与抗炎作用，而且不影响受试者血细胞比容参数，无严重的不良反应[51]。还有研究显示ATB-346 具有诱导人黑色素瘤细胞凋亡和预防结直肠癌的功效。ATB-346 对骨关节炎相关疼痛的Ⅱ期临床研究已于2016年完成。

3.4 GIC-1001

GIC-1001[49]是一种新的曲美布汀H2S 供体衍生物。马来酸曲美布汀是FDA 批准的一种用于治疗接受非镇静结肠镜检查患者的解痉剂。在一项多中心、双盲、随机、安慰剂对照的Ⅱa 期临床试验中显示出明显优于母体化合物的镇痛效果，能有效减轻内脏疼痛与腔扩张引起的不适，且引起的伤害性刺激反应与母体化合物相比显著减少[52]。因此GIC-1001 有望成为一种新型的全套结肠镜检查期间静脉镇静的替代药物。

H2S 作为内源性递质家族成员，参与心血管疾病、胃肠道疾病、中枢神经系统神经退行性疾病以及多种肿瘤的调控。H2S 在体内的调节较为复杂，在多个病理过程中具有双向调控作用，这可能受其浓度、反应时间、疾病类型以及多种信号转导机制的影响。H2S 在多种疾病的调控中均显示出巨大潜力，特别是在肿瘤中与致癌通路NF-κB、PI3K/AKT/mTOR 和Ras/Raf/MEK/ERK的激活息息相关，且H2S 供体药物在动物模型内无明显不良反应发生。随着分子靶向药物和免疫治疗的深入应用，其与化疗的联合方案在临床上展现出巨大的治疗潜力，但各类药物的耐药现象频发且逆转手段有限，因此将H2S 供体药物作为现有的治疗策略的辅助药物以提高药物敏感性，降低不良反应，为克服肿瘤耐药提供一个新思路。

近年来发展起来的H2S 荧光探针检测法，表现出更高的灵敏度、选择性、光稳定性以及更低的细胞毒性，便于储存，可商业化。基于此，越来越多的研究人员将视线转向对H2S 供体药物的筛选及开发并取得了阶段性的成果。目前ATB-346、GIC-1001、SG1002 已进入临床试验，治疗效果显著且不良反应小。能够模拟内源性H2S 在体内持续缓慢释放的供体药物，未来可能广泛应用于多种疾病的治疗，但针对H2S 供体药物的给药策略及药物联合治疗方案还有待研究。

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