基于调控核因子E2相关因子2探讨蟾酥对脑缺血再灌注损伤小鼠星形胶质细胞的影响※
时间：2023-03-10 22:15:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
钱 程 高 振 陈 卓
(1.南通大学第二附属医院医务科，江苏 南通 226001；
2. 南通大学第二附属医院放疗科，江苏 南通 226001;3. 南通大学第二附属医院介入科，江苏 南通 226001)
脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中预后不良的重要因素[1]，目前其发生机制尚不十分清楚。已有研究表明，脑缺血再灌注损伤会导致星形胶质细胞体积增大、分支增多，并且胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)阳性细胞增多。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，参与脑缺血再灌注损伤[2-3]。同时有研究报道，核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)活化调控星形胶质细胞，在脊髓缺血耐受中发挥着重要作用[4-5]，但是目前尚不明确Nrf2在脑缺血再灌注损伤中发挥的作用。目前，脑缺血再灌注损伤尚无有效的治疗药物。蟾酥是一味传统中药，能治疗多种疾病[6-7]。有研究证明，蟾酥注射液具有抑制下丘脑环磷酸腺苷(cAMP)、前列腺素E2(PGE2)释放的作用[8-9]。本研究通过对脑缺血再灌注损伤小鼠进行蟾酥预处理干预，观察小鼠脑组织星形胶质细胞特异性标志物GFAP和Nrf2的变化，以期为蟾酥的临床应用提供一定的科学依据。
1.1 动物、试剂及设备
1.1.1 动物 健康雄性C57小鼠60只，平均体质量(23±2.65)g，被安置在12 h的光/暗循环条件下，温度(22±2)℃，湿度(65±5)%，自由摄食和饮水，实验动物和饲料购自南通大学实验动物中心，动物合格证号：NT89202135。本研究所用的实验方案经南通大学动物实验伦理委员会批准。
1.1.2 主要试剂及药物 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)(Sigma公司，货号：T8877)；
GFAP抗体(Abcam公司，货号：ab7260)，Nrf2抗体(Abcam公司，货号：ab62352)；
BCA 蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；
RIPA组织蛋白裂解液(北京索莱宝科技有限公司，货号：R0010)；
TBST 缓冲液(ThermoFisher，货号：37571)；
3.5%水合氯醛(克拉玛尔，上海谱振生物有限公司，货号:150042)；
4",6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司，货号：28718-L)；
4%甲醛溶液(Sigma公司，货号：47083-U)。蟾酥注射液(江苏浦金药业有限公司，国药准字Z32020694)。
1.1.3 设备 红外灯(FHC，Bowdoinham，ME，USA)；
激光多普勒血流仪(PeriFlux 5000，瑞典Perimed AB)；
图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0，Media Cybernetics Co. USA)；
激光共聚焦扫描分析仪(STELLARIS 5，德国Leica)；
凝胶成像仪和分析软件(iBright CL750，ThermoFisher)。
1.2 实验方法 将60只C57小鼠随机分为假手术组、模型组和蟾酥注射液低、中、高剂量组，每组12只。模型组采用线栓法制备脑缺血再灌注模型。术前禁食不禁水12 h，3.5% 水合氯醛 (1 mL/100 g)腹膜内注射麻醉，仰卧位固定。腹中线颈部纵向切口，暴露右颈总动脉(CCA)、右颈外动脉(ECA)和右颈内动脉(ICA)。将右ECA的分支结扎并在距右CCA分叉20 mm处切断，轻轻插入带有圆形尖端的肝素阻尼单丝尼龙缝合线至距右ECA 切口20 mm处，用缝合线结扎以阻塞右侧大脑中动脉(MCA)。闭塞2 h后，拔出尼龙缝合线以恢复血流。用激光多普勒血流仪检测，局部脑血流量减少至20%并恢复到基线的80%以上表明造模成功。手术过程中，用直肠探头连续监测核心体温，并用恒温控制的红外灯使其保持在(38±0.5)℃。假手术组术前准备、麻醉、切口同模型组，血管分离后不插入线栓，结扎消毒后缝合皮下组织及皮肤即可。蟾酥注射液低、中、高剂量组分别于缺血前30 min经腹腔注射蟾酥注射液1.6、3.2、6.4 mL/kg，其余操作同模型组。
1.3 观察指标及方法
1.3.1 小鼠神经功能 在小鼠再灌注后24 h，采用Longa"s评分法评定各组小鼠神经功能。0分：无明显神经功能缺损；
1分：瘫痪侧前爪不能完全伸展；
2分：行走时向瘫痪侧转圈；
3分：行走时向瘫痪侧倾倒；
4分：无法自主行走，意识水平下降[10]。
1.3.2 小鼠脑梗死体积 采用TTC染色法检测。再灌注后72 h立即对各组小鼠实施安乐死并断头。迅速取出大脑并在-20 ℃下冷冻20 min。然后，将大脑冠状面按顺序切取5个切片(2 mm厚度)，置于2% TTC溶液中，在 37 ℃ 下避光孵育30 min，然后用10%甲醛固定、拍照，使用图像分析软件计算脑梗死体积百分比。脑梗死体积百分比(%) =梗死面积×厚度/全脑体积×100%。
1.3.3 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠脑组织 GFAP 和 Nrf2蛋白表达水平 取各组小鼠脑组织，称质量，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，按比例加入RIPA组织蛋白裂解液，裂解、匀浆、离心，取上清，于-80 ℃ 冰箱保存。取部分蛋白提取液，用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白质提取液的浓度。蛋白样品用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，分离总蛋白 (50 μg)并转移到聚偏二氟乙烯膜上，将膜在室温下用 5%脱脂牛奶封闭1 h，然后加入相应一抗 [GFAP抗体(1∶1000 )，Nrf2抗体(1∶1000)],4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗涤 3次，将膜与特定的辣根过氧化物酶偶联的二抗在 37 ℃下孵育1 h。PBST洗涤后,用凝胶成像仪和分析软件扫描免疫印迹并分析每个条带的相对密度。最终结果表示为目标蛋白的光密度与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的光密度之比。
1.3.4 免疫荧光法检测小鼠脑组织 GFAP 和 Nrf2阳性表达 将脑切片用4%甲醛溶液室温固定30 min，1% Triton X-100孵育30 min，5%山羊血清37 ℃封闭1 h。然后分别加入GFAP 和 Nrf2抗体，4 ℃下孵育过夜。磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤 3 次，加入二抗，37 ℃ 下反应 1 h。DAPI(1∶200) 在 37 ℃ 下染色细胞核10 min，次日4%多聚甲醛固定4 h，用含15%蔗糖的PBS共孵育4 h，去离子水清洗玻片，使用激光共聚焦扫描分析切片，对每组12只小鼠中每只小鼠5个不同视野中的阳性细胞进行计数。
2.1 各组小鼠再灌注后24 h Longa"s评分比较 再灌注后24 h，模型组小鼠Longa"s 评分显著高于假手术组(P<0.05)；
蟾酥注射液低、中、高剂量组小鼠Longa"s评分均显著低于模型组(P<0.05)。见表1。
表1 各组小鼠再灌注后24 h Longa"s评分比较 分，
2.2 各组小鼠再灌注后72 h脑梗死体积百分比比较 再灌注后72 h，模型组小鼠脑梗死体积百分比显著高于假手术组(P<0.05)；
蟾酥注射液低、中、高剂量组小鼠脑梗死体积百分比均显著低于模型组(P<0.05)。见表2。
表2 各组小鼠再灌注后72 h脑梗死体积百分比比较
2.3 各组小鼠脑组织GFAP、Nrf2蛋白表达比较 与假手术组比较，模型组小鼠脑组织GFAP蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，Nrf2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；
与模型组比较，蟾酥注射液低、中、高剂量组GFAP蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，Nrf2蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见表3。
表3 各组小鼠脑组织 GFAP、Nrf2蛋白表达比较
2.4 各组小鼠脑组织GFAP、Nrf2阳性细胞数比较 与假手术组比较，模型组小鼠脑组织GFAP阳性细胞数明显升高(P<0.05)，Nrf2阳性细胞数明显降低(P<0.05)；
与模型组比较，蟾酥注射液低、中、高剂量组GFAP阳性细胞数明显降低(P<0.05)，Nrf2阳性细胞数明显升高(P<0.05)。见表4、图1。
表4 各组小鼠脑组织 GFAP、Nrf2阳性细胞数比较 个/高倍镜视野，
图1 各组小鼠脑组织 GFAP、Nrf2阳性表达(免疫荧光染色)
目前，脑缺血再灌注损伤已成为神经内外科研究的热点，有关其发生机制的研究也很多，特别是有关星形胶质细胞与脑缺血再灌注损伤之间的关系，已有多项研究表明其参与脑缺血再灌注损伤发生。星形胶质细胞是中枢神经系统中最主要的胶质细胞，对神经元的生成、发育、再生和分化均有重要作用[11-12]。GFAP是来源于神经细胞的特异性蛋白因子，是胶质细胞特有的骨架蛋白，在维持神经细胞结构及功能完整性方面均发挥着积极作用，是星形胶质细胞活化的标志物。脑损伤发生后，损伤区域的星形胶质细胞增生，形成胶质“瘢痕”，随后GFAP的表达增加[13]。因此，脑组织GFAP升高是中枢神经系统损伤的标志[14]。Nrf2活化在调控星形胶质细胞在脊髓缺血耐受中发挥着重要作用[15]，但是与脑缺血再灌注后星形胶质细胞增生的关系尚不清楚。有研究认为，Nrf2 是一种重要的抗氧化转录因子，作用于抗氧化应激系统，能够通过抗炎、抑制氧化应激和神经细胞凋亡、促进血管生成等作用来减轻脑缺血再灌注损伤[16-17]。此外，Nrf2 已被证明可以负向调节核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体激活，因此在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用。另有研究表明，Nrf2通过调节活性氧水平、硫氧还蛋白系统和谷胱甘肽系统来抑制NLRP3 炎症小体激活，从而降低氧化应激水平[18-19 ]。
蟾酥由蟾蜍表皮腺体的分泌物经干燥而成，味辛、性温、有毒，具有清热解毒、醒脑开窍等功效，其药理活性强。现代药理研究证实，蟾酥具有抗炎、抗氧化应激等作用[20]；
可增强心搏出量，降低心率，增强心肌收缩力[21]；
还具有升压作用，蟾酥的升压作用平缓而迅速，维持时间长，能够使脑、冠状动脉、肾的血流量增加[22]；
蟾酥还具有抗肿瘤作用，对人体免疫系统以及循环系统也有很强的保护作用[23]。现代医学技术通过改变剂型、联合用药等，使蟾酥的临床应用范围不断扩大，被广泛用于恶性肿瘤、心血管系统、呼吸系统、恶性血液病等疾病的治疗。蟾酥对脑缺血再灌注时星形胶质细胞的作用目前尚不清楚。本研究结果显示，蟾酥注射液预处理后，各剂量组脑缺血再灌注小鼠Longa"s 评分降低，脑梗死体积百分比缩小，GFAP蛋白表达及阳性细胞表达均明显降低，Nrf2蛋白表达及阳性细胞表达均明显升高，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。说明蟾酥对脑缺血再灌注小鼠脑功能具有一定的保护作用。
综上，本研究结果初步表明蟾酥对脑缺血再灌注损伤小鼠脑功能具有一定的保护作用，可能是通过抑制GFAP 表达和增加Nrf2表达来实现的。但是蟾酥是如何调控GFAP 和Nrf2来使星形胶质细胞反应减轻的，尚需进一步深入研究。
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