核糖体蛋白调控病毒生命周期的研究进展

郭宏元，朱 杰，缪秋红，汤傲星，戚睿斌，唐井玉，杨洪早,2，刘光清

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；
2.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070）

核糖体是所有细胞中不可或缺的细胞器，在生物体中负责细胞内蛋白质的生物合成过程，其生物学功能主要是将mRNA翻译成蛋白质，同时进行遗传密码的传递，在细胞中充当蛋白质的翻译工厂[1]。核糖体由4种rRNA和80种不同类型核糖体蛋白（ribosomal protein, RPs）组成[2]。真核生物的核糖体又称为80S核糖体，由40S小亚基和60S大亚基组成，合成蛋白质时，大小亚基处于不断解聚和聚合的动态平衡中。核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关。小亚基核糖体蛋白分别命名为S1-S31，大亚基核糖体蛋白命名为L1-L44[3]。作为核糖体主要组成成分的RPs，除了在核糖体进行生物合成阶段发挥重要的调节作用外，还参与调节细胞的多种生命活动过程，例如细胞增殖和凋亡、肿瘤发生、基因组完整性和发育等[4-5]。越来越多的研究发现，核糖体蛋白的功能除组成核糖体参与蛋白质合成外，还有可能被病毒劫持，参与调控病毒的蛋白翻译和复制等生命过程[6]。

众所周知，病毒是依靠活细胞内的物质进行增殖的专性寄生生物，作为最小的病原体，其基因资源有限。在病毒感染过程中，病毒必须利用多种宿主细胞因子才能生存并产生新的病毒颗粒。最重要的是，随着人们对病毒认识的不断加深，发现RPs在一些病毒的生命周期中发挥着关键作用。病毒在感染细胞后，通过“劫持”宿主细胞的内源性翻译途径，从而进行自身蛋白质的翻译和合成，促进病毒的复制和增殖[5]。宿主细胞的翻译系统则因此而受到抑制，导致宿主细胞mRNA的翻译水平受到影响，而病毒的复制和蛋白质的合成水平能够持续上升；
病毒利用宿主细胞的翻译系统合成RPs以维持自身繁殖，这是病毒与宿主相互博弈的结果。在RPs的众多功能中，一方面主要是依赖核糖体参与病毒蛋白的生物合成，另一方面则是独立于核糖体调控病毒感染宿主细胞。本文就近年来有关RPs参与病毒生命活动的研究进展进行综述，尤其是在对RPs调控病毒蛋白翻译和复制过程的机制进行重点探讨。

1.1 核糖体蛋白与病毒内核糖体进入位点（internal ribosome entry site, IRES）结合调控病毒蛋白翻译真核细胞mRNA的主要翻译起始途径是cap依赖性的，即通过mRNA 5"cap与翻译起始因子4E（eIF4E）结合，进而招募eIF4G和eIF4A形成cap结合复合物（eIF4F），并将40S亚单位招募到mRNA的5"末端。然而，许多病毒mRNA没有5"cap结构，它们利用宿主mRNA中的cap充当自身RNA合成起始引物[7]，同时，也有一些RNA病毒利用cap无关的方式募集核糖体，由病毒内部IRES介导[8]。

IRES是病毒mRNA 5"UTR的一段较短的特征结构元件，结构与起始tRNA相似，它能招募核糖体蛋白从而启动病毒蛋白的生物合成[9]。根据IRES的二级结构不同可以将其分为四类（IRES Ⅰ-Ⅳ）（表1）[10-11]。IRES-Ⅰ是IRES结构中最简单的一种类型，因为它不需要任何eIFs辅助，可直接与核糖体蛋白结合并招募40S和60S亚基，从而形成功能性80S核糖体。小珀椿象肠道病毒（Plautia stali intestine virus, PSIV）、蟋蟀麻痹病毒（Cricket paralysis virus,CrPV）和陶拉综合征病毒（Taura syndrome virus,TSV）是该类型的典型成员[10]。与IRES-Ⅰ不同的是，IRES-Ⅱ招募40S亚基则需要在eIF2、eIF3和MettRNA的参与下才能完成[10]。该类主要来自以猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）为代表的黄病毒科[12]。对于IRES-Ⅲ，这类IRES在兔网织红细胞裂解物（Rabbit reticulocyte lysate, RRL）中起作用，它的翻译始于3"端，以口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdisease virus, FMDV）和泰勒氏小鼠脑脊髓炎病毒（Theiler"s Murine Encephalomyelitis virus, TMEV）为典型。IRES-Ⅳ以脊髓灰质炎病毒（Poliovirus, PV）和人鼻病毒（Rhinovirus）等为典型成员。IRES-Ⅲ和IRES-Ⅳ这两类除了需要典型的eIFs和Met-tRNA外，还需要一种称为IRES反式激活因子（IRES transactivating factors, ITAFs）的蛋白质共同参与来结合核糖体[10]。虽然IRES-Ⅰ和IRES-Ⅱ在与核糖体结合时均使其构象发生了改变[13-14]，但它们与40S亚基的结合位点不同。IRES-Ⅰ与40S亚基占据的P、E位点亚基间表面结合[14]，IRES-Ⅱ则是与40S亚基结合并占据E位点[15]。IRES-Ⅱ与40S亚基的结合由RPS5（具有β发夹结构）调节，而不依靠RPS25[16-18]；
IRES-Ⅰ则依赖于RPS25与40S亚基结合[18]，其中RPS5的功能是保证真核生物翻译的准确性。由此看出，RPS25在病毒帽依赖性翻译中不是必需的，但它在所有IRES介导的病毒翻译中起着关键作用。利用IRES方式的病毒（如脊髓灰质炎病毒和HCV）在缺乏RPS25的细胞中的增殖受到损害，这是因为，在招募40S亚基后，四种IRES都依赖于RPS25进行有效翻译[18-19]。同时，RPS25可能在下游反应中发挥作用，例如将病毒mRNA加载到40S亚基、起始密码子的识别或60S亚基的连接。当cap依赖性翻译启动受阻时，人类免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus type 1,HIV-1）基因组RNA的5"端可折叠成IRES以招募40S亚基并驱动病毒Gag蛋白的翻译启动，其中IRES的活性也依赖于RPS25[20]。RACK1作为核糖体支架蛋白，也是病毒IRES-Ⅱ介导的翻译所必需的，RACK1与eIF3结合以组装翻译前起始复合物[21]。此外，研究还表明，细胞内40S亚基的水平在促进HCV翻译中起着关键作用，HCV IRES和宿主mRNA的翻译起始对40S亚基的减少具有不同的敏感性[22]。据研究报道，RPS2（p40）、RPS3a、RPS14和RPS16可与丙型肝炎病毒的IRES相互作用[23-24]，这可能是HCV-IRES对40S亚基水平更敏感的原因之一，这些RPs在病毒RNA翻译起始中的作用还需要进一步探索。因此，无论是通过最简单的系统还是复杂的反应网络来调节病毒的翻译起始，RPs在整个过程中均起着不可替代的作用[25]。

表1 4类IRES的结构特征Table 1 Structural features of 4 types of IRES

1.2 核糖体分流与程序化-1核糖体移码调控病毒蛋白翻译核糖体分流是细胞内的病毒开启自身翻译的一种替代机制（图1）[26]，在其翻译过程中，病毒通过cap依赖的方式将40S亚基招募到RNA的5"末端。随后，40S亚基通过扫描5"UTR或翻译一个短的开放阅读框（open reading frame, ORF）的方式，从原来的分流供体区（茎环结构上游）绕过转录物的中间二级结构区转到下游受体区（茎环结构下游），在下游受体区识别一个新的AUG从而启动病毒蛋白的生物合成过程[27]。核糖体分流机制在病毒蛋白质的翻译中较为常见，其中包括水稻苔藓杆菌型病毒（Rice tungro bacilliform virus, RTBV）、花椰菜花叶病毒（Cauliflower mosaic virus, CaMV）、仙台病毒和腺病毒等[27-30]，但其具体的调节机制尚不清楚。据报道，40S亚基固定在mRNA上主要是通过与18S rRNA的碱基配对（mRNA与18S rRNA互补配对可以反映出核糖体分流机制可能与特定的RNA结构特征或mRNA和rRNA的相互作用有关）或与eIF3结合这两种方式进行的[31-32]。此外，腺病毒通过核糖体分流机制进行自身翻译，但有报道称在RPS25缺陷的细胞中，腺病毒的这种翻译机制受损抑制了病毒蛋白的翻译，这表明RPS25也是核糖体分流所必需的[18]。综上，RPS25可能在IRES和核糖体分流介导的翻译启始中发挥相同作用。

图1 核糖体分流机制Fig.1 The mechanism of ribosomal shutting

程序化-1核糖体移码（programmed -1 ribosomal frameshifting, -1PRF）也是病毒中常见的一种在翻译水平上对蛋白质合成进行调节的病毒翻译机制，在蛋白质生物合成阶段，核糖体在mRNA的特定序列处从一个核苷酸位点滑向另一个核苷酸位点，使翻译从一个ORF至下一个新的ORF不断连续进行的过程[32]。病毒通过此种机制进行蛋白翻译，可以从一个mRNA模板翻译得到两种不同的蛋白质，从而使病毒有限的遗传信息得以广泛利用。其中，HIV-1通过-1PRF机制从Gag编码mRNA表达Gag-Pol多蛋白就是一个典型例子。当HIV-1 Gag被翻译到ORF末端时，一部分核糖体通过识别-1PRF信号将阅读框移到-1位点，从而产生Gag Pol（图2）[33-34]。Gag与Gag-Pol的比例被严格地保持，以便有效地组装病毒[35-36]。近年来，HIV-1的-1PRF调节机制得到了很好的阐明。宿主因子无移位被鉴定为-1PRF的抑制剂，它与HIV-1 mRNA的-1PRF信号相互作用并翻译核糖体，导致移码位点的翻译提前终止[37]。在此过程中，需要翻译释放因子eRF1和eRF3，以及与无移位交互的eS31（RPS27A）和uL5（RPL11），通过构象重排和亚单位间旋转的方式，与分别来自40S和60S亚基的两个RPs联合起来，从而维持无移位与核糖体和病毒RNA的结合[37]。

图2 -1核糖体移码机制[33-34]Fig.2 The mechanism of -1 ribosomal frameshifting (-1PRF)

1.3 核糖体蛋白通过与病毒蛋白相互作用促进病毒的复制迄今为止，有大量研究报道病毒蛋白（结构蛋白或者非结构蛋白）与多种RPs存在一定的相互作用，例如牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）和CSFV的N末端蛋白酶（Npro），就有26种RPs与之相互作用[38]，烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus, TEV）的P1与烟草中的17种RPs相互作用[39]。当然，核糖体蛋白和病毒蛋白相互作用的意义还有待进一步确认。总体来说，其功能可分为三类：（1）核糖体蛋白促进病毒的翻译。Sin-nombre汉坦病毒（Sin-nombre hantavirus, SNV）中核衣壳蛋白（Nucleocapsid protein, N）与RPS19相互作用，其调控翻译机制的核心组成部分是由N介导的，具体过程是N蛋白通过RPS19与40S核糖体亚基结合，从而调节病毒的翻译[40]。SNV-N可以通过与RPS19相互作用，与40S亚基、mRNA cap和未磷酸化的eIF2结合形成43S预起始复合物，取代eIF4F复合物直接介导病毒mRNA翻译起始[41-42]。RPL18也是细胞内参与病毒翻译过程的一个关键核糖体蛋白，它可以与许多病毒蛋白相互作用。在CaMV生命周期中，病毒P6蛋白与来自宿主拟南芥健康叶片和感染叶片中的多个核糖体蛋白相互作用，表明这些核糖体蛋白参与了病毒的翻译过程[43]。Leh等[45]进一步研究发现拟南芥的RPL18与CaMV的P6相互作用是在多个RPs和eIF3组成的复合物中完成的，并且这种相互作用是CaMV翻译激活所必需的[43-44]。水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）核衣壳蛋白（N）是RSV核糖核蛋白颗粒（RNPs）的主要成分，在RSV感染期间，RPL18的表达虽然没有改变，但N蛋白与RPL18相互作用结果表明，敲除RPL18基因，病毒RNA和蛋白水平显著降低，其中病毒蛋白表达下降更明显，这表明RPL18能够促进RSV的翻译和复制。该发现与Cervante-Salazar等[46]的研究结果，即登革热病毒（Dengue virus，DENV）NS1与人肝细胞RPL18的相互作用具有相似的意义。综上所述，RPL18能够上调病毒蛋白的翻译水平，进而促进病毒的感染过程。（2）核糖体蛋白参与病毒组装和复制。RPL7作为HIV-1 Gag辅助因子，具有强大的DNA/RNA伴侣活性，Gag NC与RPL7的相互作用证明了RPL7有助于Gag介导的病毒颗粒的组装[47]。RPL9也是Gag蛋白的伴侣分子，它作为核糖体大亚基的一种重要成分，RPL9与小鼠乳腺肿瘤病毒（Mouse mammary tumor virus, MMTV）Gag蛋白在核仁中进行相互作用，这种相互作用对病毒粒子的组装起到调节作用[48]。在许多情况下，RPs要行使一些功能主要是通过核糖体外的特定定位来开展，如RPL22由核仁向核质转运进入细胞核后，与HSV-1 ICP4相互作用，这种相互作用对病毒DNA的合成和晚期基因表达有调控作用[49]。（3）作为病毒受体。例如RPS2（RPSA）是一种具有层粘连蛋白受体功能的核糖体蛋白，它可以与DENV和黄热病病毒（Yellow fever virus, YFV）的包膜蛋白E结合[50]。

截至目前，对RPs正向调节病毒感染的报道多于RPs对病毒复制的负调节。Cardinali等[51]早期发现脊髓灰质炎病毒感染细胞后会使大多数宿主蛋白的合成受到抑制，而细胞则可以用翻译RP mRNA和RPS6磷酸化的方式来抵抗病毒对细胞的侵害。RPs发挥抗病毒机制的方式主要有以下两种。第一种是RPs通过与病毒蛋白相互作用，从而直接使病毒蛋白的转录或翻译受到抑制。例如，RPL9与狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）的磷蛋白（phosphoprotein,P）相互作用，P作为病毒RNA聚合酶的一个重要辅助因子，在相互作用的过程中RPL9从细胞核转移到细胞质。过表达RPL9、RABV的复制受到抑制；
敲低RPL9，RABV的复制水平升高。这说明RPL9与RABV P蛋白相互作用抑制了RABV转录的初始阶段[52]。第二种是RPs（作为免疫因子）通过激活抗病毒防御信号通路抑制病毒的复制。例如， CSFV的Npro蛋白与核糖体蛋白S20（uS10）相互作用，过表达uS10，CSFV的复制受到抑制；
敲低uS10，则CSFV的复制水平升高。其中，uS10主要通过调节Toll样受体3（Toll-like receptors 3, TLR3）来抑制细胞中CSFV的复制，TLR3通过激活免疫应答途径，从而调节CSFV感染过程中先天性抗病毒免疫反应[53]。在双子病毒（Geminivirus）核穿梭蛋白（NSP）相互作用激酶（NIK）介导的植物抗病毒防御途径中，RRL10充当抗病毒信号的直接下游效应器，其中RRL10-NIK的特异性相互作用和底物磷酸化，并重定向到细胞核以调节病毒感染[54-55]。这是一种新的植物细胞防御病毒的策略。

RPs具有抗病毒作用，可以将其应用到治疗病毒性疾病上，将其作为靶点具有一定的应用潜力。核糖体失活蛋白（ribosome inactivating protein, RIPs）是RNA N-糖苷酶，它通过选择性修饰大的rRNA分子和失活核糖体以抑制蛋白质的合成，从而达到抗病毒活性的效果[56]。由于核糖体的非特异性失活，许多RIPs对真核细胞具有很强的毒性[57]，这也限制了RIPs在抗病毒治疗中的应用。

在各种病毒的生命周期中，有许多RPs在其中发挥了很重要的调控作用，为设计小分子抗病毒药物提供了潜在靶点，尤其像RPS25、RPS27、RPLP1、RPLP2、RPL3和RPL18值得多加关注，它们在核糖体维持细胞周期的功能中并非必需RPs。在这些非必需的RPs中，RPS27调控病毒范围广，因为它对致命的IV-A、DENV、HCV和Sindbis病毒的感染具有调控作用，因此可选作潜在靶点[58]。目前，以这些RPs为靶点的抗病毒治疗的发展还不够，但吡啶酸（PA）和镰刀菌酸（fusaric acid, FU）是抗肿瘤药物成功的例子，它们通过破坏RPS27的ZFP结构并使其失活，从而对一系列DNA和RNA病毒表现出有效的抗病毒和预防作用[58]。此外，许多病毒编码含有病毒复制蛋白的ZFP，如HIV-1np7、HSV-1icpo、IVA-M1和HCV-NS2等，而PA和FU能够破坏病毒必需的ZFP，致使病毒失活[58]，增强了PA和FU的抗病毒作用。RPS25通过控制病毒IRES和核糖体分流介导的翻译，RPL18具有多种病毒调节作用，这些调控作用为这两种RPs在抗病毒应用方面提供了很大的可能。RNAi和CRISPR/Cas9策略是靶向RP基因的有效途径，对于潜在的RPs靶点，尽管在实验中通过缺失的方式对核糖体的基本功能影响不大，但在应用中，最好选择敲低和抑制这些RPs而不是敲除或突变，这是由RPs在细胞中的多样性决定的，任何RP的缺失和突变都可能导致细胞对生理和非病毒性病理刺激的异常反应。目前RPs相关研究仍处于早期阶段。

综上所述，细胞内RPs在病毒生命周期中发挥重要的调控作用（图3）。了解核糖体蛋白调节病毒复制过程与机制，对于深入理解病毒的生命过程及规律有很大帮助。虽然这方面的研究成果还不是很多，但是其在病毒感染和复制过程中的作用越来越受到人们的关注。此外，随着人们对RPs调控病毒生命周期的新机制不断被发现，也为研发针对一些以RPs为靶标的新型抗病毒药物提供了新的线索。

图3 核糖体蛋白在病毒生命周期中的作用Fig.3 The role of ribosomal proteins in the life cycle of viruses

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