低温等离子体改性粮油植物蛋白结构的研究进展

李 琦，支 爱，何学明，沈 飞 ，邢常瑞，Firew Tafesse Mamo

(南京财经大学食品科学与工程学院1，南京 210023) (江苏高校现代粮食流通与安全协同创新中心2，南京 210023) (巴赫达尔大学埃塞俄比亚生物技术研究所3，亚的斯亚贝巴 5954)

蛋白质是人体细胞、组织和器官的重要组成成分，是人类饮食中的关键营养物质，在维持人体健康方面起着至关重要的作用[1]。与动物蛋白相比，粮油植物蛋白的功能性相对较低，如水溶性差、对环境胁迫条件如酸度、盐和温度的敏感性及复杂性限制了其在各工业领域的应用发展[2]。但植物蛋白具有低脂、不含胆固醇，富含膳食纤维、活性物质等优势，且摄入高质量的植物蛋白可降低患多种代谢疾病的风险[3]。粮油植物蛋白主要来源于谷物(小麦、玉米、高粱等)、豆类(大豆、豌豆、芸豆等)、油籽(花生、芝麻、油菜籽等)等农作物及其副产品[4]，具有抗氧化性[4]、乳化性[5]、持水性和凝胶性[6]等功能，被广泛应用于食品、药品、化妆品及包装材料等领域。因此，植物蛋白质被认为是经济成本低、环境友好型和可再生性的动物蛋白质的替代品[7]。我国的粮食作物含有较多植物蛋白，其中大豆蛋白占比较高，不仅是我国重要的粮食作物，还是植物中蛋白含量最丰富，氨基酸组成最均衡，最有望成为动物蛋白替代品的农产品。对于蛋白而言，其结构决定功能，故合理有效的蛋白质改性方法可改善其功能特性、营养价值和感官特性，进而拓宽植物蛋白在各领域的应用[8]。目前，蛋白质的改性方法包括物理改性、化学改性、酶法改性和基因工程改性[3]，新兴的几种物理改性介绍如表1所示。

低温等离子体是一种非热、安全、环保的物理改性技术，被广泛应用于污水净化、高分子材料印刷、聚合材料改善等领域，是当下食品非热加工的一个研究热点[15]。低温等离子体是通过自身产生的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)、活性氮(Reactive Nitrogen Species，RNS)、自由基及高速电子打破蛋白质中共价键并引发各种化学反应而对食品表面进行改性的方法[16]，适用于热敏性食品[17]，可在无外源添加剂的条件下对食品进行清洁、杀菌和改性[18]，既能较好保持食品营养价值，也能改善食品功能特性。

表1 几种蛋白质物理改性方法介绍

因此，低温等离子体技术在食品加工领域具有重要的探索意义，国外已广泛将该技术用于植物蛋白改性，但国内研究较少，故本文对该技术在植物蛋白质改性中的应用进行了概述，并对低温等离子体改性蛋白的机理及蛋白质结构与功能之间的关系进行了简要阐述，以期为今后进行该领域的研究提供参考。

低温等离子体(Cold plasma)是指中性气体在室温条件下，通过微波、光脉冲、交流电和直流电等多种激发源产生的带电粒子(电子、离子)和不带电粒子(分子、激发态原子、亚稳态原子、自由基)以及紫外线、γ射线、β射线等，被称为继固态、液态、气态之外的第四态[19,20]。目前，国内在低温等离子体改性蛋白质领域进行了诸多研究，但对蛋白质改性的机制解析鲜见报道。因此，以现有低温等离子体在食品杀菌、农残降解、材料改性等方面的研究为基础，对低温等离子体对蛋白质改性机理进行简要概括，其改性机理见图1。

低温等离子体对蛋白质改性的机理一般包括ROS、RNS及自由基的氧化作用，紫外线的光子蚀刻作用，以及激发态或非激发态原子和分子的蚀刻作用，其具体作用为：

pH作用：经研究，pH降低主要与几个原因有关：1)等离子体中的ROS、RNS及自由基等一些活性成分直接或间接参与蛋白质氧化产生酸性物质[21]；
2)空气气体经电场作用产生氮氧化物与水作用生成亚硝酸(HNO2)和硝酸(HNO3)[22]；
3)高能电子或离子轰击蛋白质溶液产生酸性离子(H3O+)[23]。这些物化反应均会改变处理样品的 pH。蛋白质属于两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。在蛋白质等电点(pI)处，蛋白质溶解度最小，会发生变性沉淀[24,25]。当溶液 pH 偏离蛋白质等电点 0.5 pH单位以上时，蛋白质溶解度增加[24]。因此，蛋白质在不同 pH 条件下会发生不同程度的变性，且环境中的酸性、碱性基团也会在其他因素作用下与蛋白质发生反应，进而对蛋白质改性。但是，等离子体处理样品时，pH 值作用多适用于液体样品，通过水的电离及与CO2间的相互作用使溶液呈酸性进而改性蛋白质；
所以，当样品水分含量低时，样品 pH 几乎不变，作用效果一般。

紫外光作用：等离子体形成过程会伴随着光辐射，其中包括紫外线和可见光[20]。紫外光子的光解作用会打破蛋白质分子间键，破坏其氨基酸的结构，使蛋白质失活[26]。由于紫外线可被色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)等芳香族氨基酸吸收，所以紫外线辐射会诱导蛋白结构变化，产生化学修饰[27]。Kumar 等[28]证实了紫外光会诱导小麦粉中蛋白主链及其构像改变，进而影响小麦粉蛋白的功能性质。有研究证明，正常条件下，紫外线极易被空气和水等介质吸收，所以对蛋白质溶液改性的作用有限[29,30]。紫外线的产生需要低温等离子体在高压条件下激发，较低电压的等离子体处理产生的紫外线极少，部分还被介质吸收，故对蛋白改性的效果极微；
较高电压的等离子体处理可产生较多的紫外线，但较高电压会对蛋白功能特性产生不利影响。因此，紫外光作用对蛋白改性具有局限性。

图1 蛋白质改性机理

活性粒子氧化作用：低温等离子体体系中反应物经电场作用产生大量氧自由基(·O)、羟自由基(·OH)、臭氧(O3)、二氧化氮(NO2)等活性物质，这些活性物质会与蛋白质分子相互作用，对蛋白质氨基酸残基进行修饰，进而改变蛋白质的结构和性质[31,32]。刘志伟等[33]在介质阻挡放电等离子体处理诱导氧化降低 IgG/IgE 的结合能力并提高甘氨酸的功能性研究中表明，甘氨酸的IgG/IgE结合能力下降与氨基酸间肽键的氧化及敏感氨基酸(Trp、Tyr、Phe)的氧化有关，这些氧化修饰会破坏分子间氢键和氨基酸间的其他非共价相互作用，导致蛋白质改性。低温等离子体改性蛋白质的关键物质是活性氧与活性氮，它们可诱导蛋白质发生化学键的变化及氨基酸侧链的氧化等结构变化，进而改变蛋白质功能特性。蛋白质与活性粒子间的相互作用通常发生在蛋白质表面几纳米到几十纳米之间，故活性粒子的氧化作用多作用于蛋白质表面，蛋白改性程度与蛋白质和活性粒子接触的比表面积有关。因此，利用等离子体处理蛋白粉末时，可采用过筛的方法控制蛋白粉末的粒径，进一步扩大蛋白粉的比表面积，从而达到良好的改性目的。

高速粒子蚀刻作用：低温等离子体的产生是一个能量不断传递的过程，即外加电场使电子获得能量撞击周围气体，使气体被激发电离形成大量电子，且系统中部分原子或分子在放电后期也会被激发生成一些高能活性粒子，这些粒子会与未被激发的粒子发生非弹性碰撞，并得到大量活性自由基[34,35]。高能活性粒子在电场作用下会不断轰击蛋白表面产生蚀刻现象，且会将自身能量传递给物质表面，诱导物质表面的共价键破裂或新化学键形成，进而启动一系列化学反应[36]，此现象导致的理化变化包括化学键的断裂、化学降解和低分子质量片段的去除等[37]。但共价键的破裂和新化学键形成等变化只能发生在蛋白质表面，改性程度有所限制。研究表明，由于放电过程中的蚀刻作用影响，低温等离子处理能够增加聚合物表面的粗糙度或使蛋白表面产生空穴，进而对蛋白进行改性[38]。高速粒子蚀刻作用不仅会使蛋白产生空穴现象，还会使蛋白粒径减小，从而加大蛋白与活性粒子的接触面，更有利于蛋白的改性。

蛋白质是由多种氨基酸按一定顺序通过肽键彼此连接形成的具有特定空间结构的生物大分子，是生命的物质基础[39]。大多数蛋白质分子至少存在 3 个水平的构像结构，包括一级结构、二级结构和三级结构，具体结构情况见图2。蛋白质功能特性可分为三类：蛋白质与水相互作用，如溶解性、持水力等；
蛋白质与蛋白质相互作用，凝胶性、沉淀等；
蛋白质界面性质，乳化性、起泡性等[40]。通常，蛋白质的一级结构决定高级结构，高级结构是蛋白质行使功能性质的基础，而蛋白质各种功能性质又是其结构的表现。因此，在研究蛋白质功能改性以拓宽其应用时，应对蛋白结构进行全面探讨。

图2 蛋白质构像结构

2.1 表面微观结构

低温等离子体处理作为一种有效的表面改性技术，能显著改变材料表面的形貌。如低温等离子体产生的高能粒子在电场作用下会不断撞击蛋白质分子表面，以改变蛋白质外观，对其产生一定的物理修饰作用[39]；
存在的活性粒子及自由基会与蛋白质表面的氨基酸残基发生氧化反应，对蛋白质产生化学修饰，进而改变蛋白质形态。通常采用扫描电子显微镜观察低温等离子体处理前后蛋白质表面微观结构的变化。Dong 等[42]分别采用 50、75、100、125 V电压的大气低温等离子体处理玉米蛋白粉，结果表明低温等离子体处理后的蛋白质表面粗糙，未处理样品的表面光滑，随处理电压升高，光滑表面逐渐消失，出现不规则扭曲和破裂，处理电压达到75 V 时，样品表面出现明显的空腔现象，是由低温等离子体处理时产生的高速粒子碰撞造成，且随电压增大，粒子间碰撞越激烈，蛋白表面越粗糙，但功能性在高电压下会变差。Sharafodin 等[43]探究介质阻挡放电低温等离子体在大豆分离蛋白理化性质修饰中的潜在应用时，分别采用不同时间和电压处理样品，结果表明，等离子体处理的样品表面根据处理电压不同出现不同大小的孔穴，主要由高速等离子体流产生的太阳风使蛋白质分子间相互碰撞及等离子体中的高能电子、离子和其他类型活性粒子与蛋白表面相互作用这两种方式造成，并表明不是蛋白表面改性越大，蛋白功能特性越优异，当其电压达到20 kV并处理15 min 时，蛋白功能特性出现显著下降。低温等离子体处理可通过蚀刻作用改变蛋白质分子表面，对蛋白质产生物理修饰作用，但研究者需通过控制蛋白处理量及处理条件来达到相应的改性效果。此外，低温等离子体对蛋白表面的作用程度并不与蛋白的功能特性成正相关，且处理不同蛋白时的作用效果不同，故使用等离子体改性蛋白时应对其处理条件进行探索。

2.2表面疏水性

蛋白质表面疏水性是指蛋白质表面与极性溶液环境接触时的疏水基团数量，主要取决于芳香族和脂肪族氨基酸残基的暴露程度[44]。疏水相互作用被认为是维系蛋白质高级结构的主要作用力，在三级结构的形成和稳定中起着重要的作用[45]。蛋白质表面疏水基团的数量会影响蛋白质分子在水溶液中的胶束大小，进而影响蛋白质的溶解性。因此，蛋白质表面疏水性是研究蛋白质分子结构的重要参数，通常采用 ANS 发射荧光探针测定蛋白质表面的疏水性。Ji 等[46]采用 35 V 介质阻挡放电低温等离子体分别对花生分离蛋白溶液处理 1、2、3、4 min 后发现，花生分离蛋白表面疏水性随处理时间的增加逐渐降低，表明蛋白间疏水相互作用减少，亲水作用增加，蛋白质的溶解度也相应增加，疏水性的降低是由蛋白内部疏水基团暴露引起。经研究证明，蛋白疏水性的变化主要由亲水基团的引入和蛋白内部疏水基团的暴露有关。此外，蛋白质粒径的大小也会因比表面积的变化来影响疏水基团的暴露比，进而影响蛋白质的疏水性。Dong等[41]在接触角分析中也得出相应的结论。有研究认为，低温等离子体处理后亲水性提高可能与样品表面引入的含氧基团有关，可增加了样品表面的润湿性[47-49]。但是，低温等离子体处理蛋白质并不总是降低蛋白表面的疏水性，季慧等[50]在常压低温等离子处理提高花生分离蛋白水合性质的研究中表明处理时间在3 min内时，疏水性逐渐下降，花生分离蛋白对水的结合能力增强，其凝胶持水性(WHC)也相应增强，但3 min后，由于蛋白质分子展开，暴露更多内部疏水基团，使得蛋白质疏水性又有所增强。因此，低温等离子体不同处理条件对蛋白疏水性的影响也不同，且影响疏水性会受蛋白种类、粒径、pH等因素的影响，但低温等离子体可通过高压电场作用产生的活性氧、活性氮等活性粒子对蛋白改性，故采用不同气体包装蛋白粉或在处理器中充斥不同气体成分均会对蛋白质产生不同程度的改性，但尚未发现相关研究，后续研究应针对不同气体成分对蛋白结构及功能特性的影响进行系统研究。

2.3 二级结构

蛋白质的二级结构是指蛋白质多肽链借助氢键进行自身盘绕折叠的方式，主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，是蛋白质形成立体结构的前提[51]。傅里叶变换红外光谱(FTIR)是一种很好的生物分析方法[52]，可用于研究化学键的变化，故用来测定蛋白质的二级结构。在 FTIR 光谱研究中通常选用酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm-1)的变化分析蛋白质二级结构的变化，该区域代表了蛋白质主干中最突出、最敏感的振动带[53]。研究表明，蛋白质二级结构对应条带为：α-螺旋(1 650～1 660 cm-1)、β-折叠(1 618～1 640和1 670～1 690 cm-1)、β-转角(1 660～1 670和1 690～1 700 cm-1)、无规则卷曲(1 645 cm-1)[54]。Ji 等[55]在大气压低温等离子体(ACP)处理花生蛋白分离物的研究中表明，ACP 处理 3 min 时，处理组样品与未处理组相比，β-转角含量呈增加的趋势，但β-折叠含量则出现明显下降；
当处理时间超过 3 min 时，β-折叠和无规卷曲含量增加，而α-螺旋和β-转角的含量有所下降，花生分离蛋白的结构经处理后被破坏，蛋白构象从致密、折叠变成展开、松散，该研究的二级结构变化与 Misra 等[69]在大气低温等离子体处理小麦粉的研究结果一致。蛋白质二级结构的展开、松散与电场下高速粒子的蚀刻作用和活性粒子对蛋白基团的氧化作用有关，在多种作用下，蛋白质的化学键被打开、重新折叠或氧化，从而改变蛋白质的二级结构，进而影响蛋白质的功能特性。有研究结果表明α-螺旋、β-折叠均与样品疏水性有关，α-螺旋含量越低、β-折叠含量越高其疏水性越大，溶解性就相对较差，乳化活性也就相对越好[73]。Ji 等[58]表明，较高的β-折叠和无规则卷曲含量可以提高溶解度、持水性和起泡性。因此，并不是β-折叠含量高，其溶解性差，这还要根据其分子内外的β-折叠含量比、疏水基团与亲水基团间的比例等因素影响，结构变化是对功能性的一种解释手段，但是否存在必然关系，其关系如何需进一步研究。大量研究表明，低温等离子体处理过程中的蚀刻作用会使蛋白质结构展开，产生的活性粒子也会氧化蛋白质的氨基酸基团，导致蛋白质二级结构改变，最终起到改变蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性等功能性质的作用。

2.4 游离巯基

巯基(-SH)和二硫键(S-S)是蛋白质基食品中表达功能性质的两个重要功能基团，二者间的转换或变化代表着蛋白质结构的变化[58]。维持蛋白质三级结构稳定的主要作用力——二硫键，是蛋白质分子中巯基氧化形成。氨基酸侧链基团中含有对氧敏感的巯基和芳香基，易被活性粒子氧化，其中半胱氨酸最为敏感[59]。此外，蛋白质结构中的共价键(S—S 键、C—S 键)之间的裂解能较低，在等离子体处理过程中很容易发生裂解[60]。巯基和二硫键的变化会改变蛋白质的结构，进而改变其功能特性，是研究蛋白质结构的重要参数，通常采用分光光度法测定。Segat 等[61]在大气压低温等离子体(ACP)处理乳清分离蛋白模型溶液的研究中表明，与对照组相比，处理组样品中的游离巯基随处理时间延长，游离巯基的含量逐渐降低，在 ACP 处理 10 min时，-SH含量降到初始值的一半，故表明ACP会诱导蛋白质结构中存在的半胱氨酸巯基丢失。研究结果表明，巯基经过氧化会转变成分子间的二硫键，从而加强分子间的稳定性，与薄膜结构间存在良好的相关性。季慧等[62]在低温等离子体处理对花生分离蛋白溶解行为的研究中分别采用 1、2、3、4 min处理样品，结果显示，经处理后花生蛋白中的总巯基含量逐渐减少，在处理3 min时，总巯基含量与未处理样品相比，降低了50%，这与巯基被氧化成二硫键有关，随后总巯基含量有所增加是因为高能粒子的轰击使生成的二硫键断裂重新形成巯基。故低温等离子体处理蛋白时，巯基含量的变化趋势并不是一成不变的，当处理条件不同时，不同的作用方式会对巯基含量产生不同的影响。游离巯基并不是随处理时间的延长而无限增加的，适当的等离子体处理会使蛋白分子中的巯基氧化生成二硫键，过度处理则会使形成的二硫键再次断裂。而且，低温等离子体是一个复杂的体系，其处理对蛋白质的影响是相互作用的结果，故在用低温等离子体改性蛋白时应针对不同蛋白探索相应的处理参数，并将该蛋白质性能修饰到最佳效果。

2.5 分子质量分布

蛋白质大多是由多个亚基通过二硫键结合而成的大分子物质，若二硫键被破坏，构成蛋白质的亚基分开，其结构和分子质量也会相应发生改变。因此，测定蛋白质分子质量是研究蛋白质结构改变的重要参数，通常采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定，表征蛋白质一级结构和其组成。SDS-PAGE 可通过SDS消除蛋白质分子间原有的电荷差异和分子形状差异，从而使该电泳速度只取决于蛋白质分子质量大小。Mahdavian 等[63]对草豆(甘草豆)分离蛋白(GPPI)纳米颗粒分别采用 9.4、18.6 kVpp的大气低温等离子体处理300、600 s，其 SDS-PAGE 结果显示，非还原条件下，草豆分离蛋白在高压和长时间处理后分子质量发生改变，且在酸性和碱性条件下的亚基也存在不同程度的变化，还会出现新的亚基条带，新亚基条带的出现主要是由物理和化学蚀刻作用使原始蛋白聚集体破坏，使其碎片化造成的。根据 Segat 等[59]的研究表明，蛋白分子质量的变化主要与二硫键的变化或硫醇在等离子体处理过程中过度氧化有关。通常，蛋白质是由肽链经二硫键连接并折叠盘区而成的，二硫键的断裂会使蛋白小亚基条带增多，相反，二硫键的形成会出现较大亚基条带，但二硫键的变化不会影响蛋白质的一级结构。这表明二硫键的断裂会使原蛋白聚集体解聚，形成小分子亚基，但蛋白质的主要条带不变，即该处理不会改变蛋白质的一级结构。因此，适当低温等离子体处理可在不改变蛋白质分子主要条带的前提下使蛋白质分子展开，改善蛋白质功能。但较高电压或较长处理时间的等离子体处理会因二硫键的再次形成而使较小分子亚基间键合形成较大亚基，但是否会对蛋白质分子主要条带产生影响还需进一步研究。

在粮油食品加工过程中，由于低温等离子体处理属于非热加工，所以对处理样品的理化性质及感官性质影响较小，可最大程度的保持原有品质。低温等离子体改性蛋白质的机理主要是高速粒子对蛋白表面的蚀刻作用和活性粒子与蛋白质氨基酸残基的相互作用，不会改变植物蛋白的一级结构及氨基酸组成，且植物蛋白中脂肪含量低，活性粒子的氧化作用并不会引起大量脂肪酸氧化，进而影响植物蛋白的营养价值及感官品质。但低温等离子体的作用机理均局限于蛋白表面，无法使蛋白彻底改性，且处理条件、处理样品的种类及样品内部结构均会影响蛋白质的改性效果，故距离现实应用还需要进一步研究。

随着低温等离子体(CP)在蛋白质改性领域的应用，CP对蛋白质结构和功能的作用机制需要更深入的探索。此外，单一 CP处理对蛋白质的改性存在一定的局限性，可与一些传统蛋白质改性方法相结合，如酶法与CP处理结合、糖基化与CP处理结合等，以提高蛋白质改性的效果。当前，大多低温等离子体改性蛋白的研究均采用介质阻挡低温等离子体，且多将样品置于培养皿内处理，其处理面积及作用效果均受到限制，后续可针对蛋白改性设计相应的等离子体处理器，将样品直接置于处理器内，并向处理器中充入相应的改性气体，从而达到蛋白改性的目的。最后，CP改性后的蛋白质是否存在过敏性、处理本身是否安全或是否会存在其他的安全隐患均需进行大量毒理学实验，以确保 CP改性蛋白质的食用安全及使用安全，进而为大规模的产业化发展打下基础。

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