利用生物信息学方法分析EZH2基因在肝细胞癌组织中的表达水平及临床意义*
时间：2023-03-01 16:50:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
杨 丹，王树辉，陈素花，邓开仙，韩 然
贵州省人民医院:1.检验科;2.消化内科，贵州贵阳 550002
肝细胞癌(HCC)是世界范围内的第五大恶性肿瘤[1]，也是常见的恶性消化道肿瘤之一。由于 HCC起病隐匿、HCC细胞侵袭转移能力强、导致疾病发展迅速，当大多数患者临床确诊时已经发展至癌症晚期，从而错过了手术时机。所以，探索、筛选与HCC侵袭、转移相关的生物标志物，进一步明确HCC侵袭、转移机制对提高肝癌患者的预后至关重要。
EZH2 是果蝇 zeste 基因增强子的人类同源物，属于多梳蛋白基因家族(PcG)的重要成员[2]，具有组蛋白甲基转移酶活性，参与多种生理、病理调控过程，如调控胚胎早期发育[3]、促进肿瘤转移[4]。EZH2在多种恶性实体瘤中的表达水平呈高表达或过表达，包括胆囊癌、卵巢癌、乳腺癌、脂肪肉瘤、皮肤黑素瘤等[5-9]；
EZH2高表达可促进癌细胞的增殖、浸润和转移，并可作为判断前列腺癌和乳腺癌患者预后的指标。同时，也有研究证明EZH2在急性白血病中呈高水平表达[10]，且与患者预后相关[11]。但是，目前关于EZH2基因在肝癌中表达水平情况及与多种免疫细胞、免疫细胞浸润以及是否与HCC患者预后相关的研究相对较少。
因此，本文采用生物信息学分析Oncomine、GEPIA、THE HUMAN PROTEIN ATLAS等多个热门公共数据库，通过挖掘HCC患者中EZH2的表达水平数据，分析EZH2基因表达水平在HCC组织中发挥的作用，以及对HCC患者预后的相关性，为HCC的临床诊治和评估HCC患者的预后提供生物信息学证据。
1.1一般资料 THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库在线分析EZH2基因在健康人体各器官组织中的表达情况。利用GEPIA和Timer数据库(http://gepia.cancer-pku.org，https://cistrome.shinyapps.io/timer/)在线分析EZH2基因在正常肝组织和HCC组织中表达水平的情况。利用Oncomine数据库分析HCC组织与正常肝组织的基因差异表达水平和EZH2高表达水平研究的分析。利用 Kaplan-Meier Plotter数据库(https://kmplot.com/analysis/)的HCC数据集在线分析总生存期(OS)、无病生存期(PFS)、无远处转移生存期(RFS)和后进展生存期(DDS)与EZH2表达水平的关系。通过String数据库(http：//string-db.org)在线检索EZH2的相关蛋白网络图，并进行功能注释和KEGG通路富集分析。使用肿瘤免疫评估Timer数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析EZH2在B细胞、CD4+T细胞、中性粒细胞等免疫浸润细胞中的表达水平和对HCC患者生存预后的影响。
1.2THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库检索方法 利用THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库检索目录，检索关键词Gene：EZH2。
1.3GEPIA数据库检索方法 设定检索关键词Gene：EZH2，CancerType：Hepatocellular carcinoma。
1.4Oncomine数据库检索方法 Oncomine数据库检索条件如下。(1)Cancer Type：Hepatocellular carcinoma；
(2)Gene：EZH2；
(3)Data Type：mRNA；
(4)Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis，采用条形图描述结果。
1.5Kaplan-Meier Plotter 数据库分析 筛选条件如下。(1)Cancer:Hepatic carcinoma；
(2)“Gene：EZH2”；
(3) “Survival：OS,PFS,RFS,DDS”。
1.6String数据库检索方法 使用 Ggencards 网站(https://www.genecards.org)分析EZH2基因相关蛋白功能，并在String数据库设定如下限定条件。(1)Protein Name：EZH2；
(2)Organism：Human；
(3)Pathway：KEGG；
(4)P<0.05。进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。
1.7TIMER 数据库检索方法 利用数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)来分析，检索条件为Gene：EZH2。
2.1EZH2蛋白和mRNA在健康人体各器官组织中表达水平的情况 THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库分析结果显示，EZH2 mRNA在多数器官组织中广泛表达，其中胸腺、骨髓和睾丸组织中表达量最高(图1A)。从蛋白水平来看，睾丸、胎盘、扁桃体和骨髓细胞的表达量最高。在正常肝组织中，EZH2 mRNA呈低表达水平，EZH2蛋白不表达(图1B)。
注：A为EZH2 mRNA在健康人体组织的表达水平;B为EZH2蛋白在健康人体组织的表达水平;C为EZH2 mRNA在健康人体组织和常见恶性肿瘤中的不同表达水平情况；
**P<0.01;***P<0.001。图1 EZH2蛋白和MRV在健康人体各器官组织的表达水平
2.2EZH2在正常组织和临床常见恶性肿瘤中的表达水平 本研究使用TIMER2来研究TCGA库中肿瘤与相邻正常组织中EZH2的差异表达，如图1C所示，TIMER数据库分析结果显示，与正常组织相比，EZH2在常见恶性肿瘤如结直肠癌、肺癌、肉瘤、卵巢癌、肾癌和宫颈癌等恶性肿瘤中EZH2表达水平显著增加，肿瘤组织中的表达水平明显高于相应对照组，差异有统计学意义(P<0.001)，在淋巴瘤、恶性黑色素瘤、骨髓瘤和白血病中未检测到EZH2的表达。Oncomine数据库检索结果亦显示，在有关EZH2基因的449项研究中，有136项研究中EZH2表达水平差异有统计学意义(P<0.05)，其中127项研究中EZH2表达水平增高，9项研究中表达水平下调。
2.3EZH2 mRNA和EZH2蛋白在HCC中表达水平的情况 GEPIA数据库检索结果亦显示，与正常肝组织比较，HCC组织中EZH2 mRNA表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。Ualcan数据库分析结果亦显示HCC组织中EZH2mRNA 表达水平显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。Oncomine数据库分析结果显示，涉及HCC与EZH2基因表达水平的研究共3项，与正常肝组织比较，EZH2 mRNA在所有差异表达基因中其中位数值排名为188.0(P<0.05)，提示在HCC组织中EZH2显著高表达。
在这3项研究中，HCC组织中EZH2表达量分别是正常肝组织的3.42、3.296和5.261倍。THE HUMAN PROTEIN ATLAS数据库结果显示，EZH2在HCC组织中的蛋白表达水平显著升高(图2)。
图2 EZH2在正常肝组织和HCC组织的蛋白表达水平(×200)
2.4EZH2 mRNA在HCC患者不同分组中的表达水平 Ualcan数据库分组分析显示，EZH2基因在正常肝组织中的表达水平为0.428(0.322～1.426)，在1级HCC组织中的表达水平为2.379(1.209～4.204)，在2级HCC组织中的表达水平为3.545(2.094～5.710)，在3级HCC组织中的表达水平为5.296(3.416～9.236)，在4级HCC组织中的表达水平为5.410(4.394～11.150)，结果分析表明EZH2基因在各级HCC组织中的表达水平均高于正常肝组织，且3级HCC组织中的表达水平显著高于1级和2级HCC组织，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3A。
注：A为EZH2基因在各级HCC组织中的表达水平；
B为EZH2基因在各期HCC组织中的表达水平；
C为EZH2基因在不同体质量HCC患者组织中的表达水平。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。图3 EZH2 mRNA在HCC患者不同分组中的表达
根据肿瘤临床分期来看，EZH2在Ⅰ期HCC组织中表达水平为3.532(1.993～5.938)，在Ⅱ期HCC组织中表达水平为4.673(2.345～6.799)，在Ⅲ期HCC组织中表达水平为5.896(3.395～10.854)，在Ⅳ期HCC组织中表达水平为2.816(2.197～7.504)，分析结果显示EZH2基因在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期HCC组织中的表达水平均高于正常肝组织，且Ⅱ期和Ⅲ期HCC组织中的表达水平显著高于Ⅰ期HCC组织，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3B。
根据体质量分组来看，在任何体质量患者的HCC组织中EZH2的表达水平显著高于正常肝组织，此外肥胖患者HCC组织中EZH2的表达水平显著高于正常体质量患者，差异有统计学意义(P<0.001)，见图3C。
2.5EZH2与HCC患者预后的关系 检索Kaplan-Meier Plotter数据库进行单因素分析，本研究发现EZH2高表达的HCC患者的OS、RFS、PFS和DSS均显著低于EZH2低表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。Ualcan数据库在线分析结果亦显示EZH2高表达的HCC患者的OS显著缩短。
注：A为EZH2表达与HCC患者总生存期的关系；
B为EZH2表达与HCC患者无远处转移生存期的关系；
C为EZH2表达与HCC患者无病生存期的关系；
D为EZH2表达与HCC患者后进展生存期的关系。图4 EZH2和相关基因的GO功能注释和KEGG通路富集
2.6EZH2相互关联的基因网络及相关通路 通过Srting数据库在线检索EZH2的相关蛋白网络图，并进行GO富集分析和KEGG通路分析。结果显示，EZH2涉及的生物学过程主要有真菌状乳头形成、毛囊基板形成、组蛋白H3-K27的甲基化调控、组蛋白H4的甲基化调控等主要过程；
分子功能主要有组蛋白去乙酰化酶活性、启动子特异性染色质结合、NF-KB结合、RNA聚合酶Ⅱ抑制转录因子结合、组蛋白甲基化酶活性等；
细胞组分主要涉及ESC/E(Z)复合体、性染色质、NuRD复合体、Sin3复合体和PcG蛋白复合体等。KEGG通路分析表明，EZH2主要参与的信号通路有Notch信号通路、长寿调节信号通路、慢性粒细胞白血病通路、癌症MicroRNA信号通路和甲状腺激素信号通路、细胞周期。见表1。
表1 EZH2表达与HCC患者的OS、RFS、PFS和DSS的关系
2.7EZH2共表达情况 本研究进一步分析了EZH2在HCC中的共表达基因，相关性最强的8个基因分别是BUB1B、KIF4A、TPX2、MELK、DLGAP5、KIF20A、BIRC5、CDC20，均呈正相关(r=0.90、0.89,0.89、0.88、0.87、0.85、0.84，P<0.001)，见图5。
注：
A为EZH2与共表达基因BUB1B的相关性 ；
B为EZH2与共表达基因KIF4A的相关性；
C为EZH2与共表达基因TPX2的相关性；
D为EZH2与共表达基因MELK的相关性 ；
E为EZH2与共表达基因DLGAP5的相关性；
F为EZH2与共表达基因KIF20A的相关性；
G为EZH2与共表达基因BIRC5的相关性；
H为EZH2与共表达基因CDC20的相关性。图5 EZH2在HCC中的共表达相关基因
2.8EZH2 mRNA在HCC组织中与免疫细胞的关系 在线检索TIMER数据库发现，EZH2 mRNA 在HCC免疫微环境中与肿瘤纯度、B细胞(r=0.474,P=9.73×10-4)、CD8+T细胞(r=0.284,P=9.30×10-8)、CD4+T细胞(r=0.378,P=3.84×10-13)、巨噬细胞(r=0.436,P=3.22×10-17)、中性粒细胞(r=0.374,P=7.02×10-13)和树突状细胞(r=0.453,P=1.38×10-18)的表达呈正相关性，差异有统计学意义(P<0.05)。
HCC是世界范围内的第5大恶性肿瘤[1]，也是常见的的恶性消化道肿瘤之一。由于 HCC起病隐匿、HCC细胞侵袭转移能力强、导致疾病发展迅速，当大多数患者临床确诊时已经发展至癌症晚期，从而错过了手术时机。所以，探索、筛选与HCC侵袭、转移相关的生物标记物，进一步明确HCC侵袭转移机制对提高HCC的预后至关重要。而针对临床常用化疗、放疗或介入治疗等治疗手段在 HCC 中的临床治疗中相对比较局限。所以积极寻找与 HCC侵袭转移相关的有效生物标记物，探明 HCC 侵袭转移机制对提高 HCC 预后至关重要。
EZH2 是果蝇 zeste 基因增强子的人类同源物，属于多梳蛋白基因家族(PcG) 的重要成员[2]，具有组蛋白甲基转移酶活性，在胚胎发育的早期能够调控细胞的增殖及分化功能[3]，可以与SUZ12、EED、RbAP46/48 形成 PRC2 复合物，从而使核小体组蛋白 H3 的第 27 位赖氨酸发生三甲基化，三甲基化后的H3K27(H3K-27me3) 能将 PRC2 复合物招募到特定的基因位点，抑制靶基因的转录。通过抑制E-cadherin 的表达水平直接诱导 EMT 发生，促进肿瘤转移[4]。大量研究证明，EZH2在多种恶性肿瘤中高表达或过表达，包括胆囊癌、卵巢癌、乳腺癌、脂肪肉瘤、皮肤黑素瘤等[5-9]，并可作为前列腺癌和乳腺癌患者判断临床预后的预测指标。孙健等[10]研究发现，EZH2在急性白血病(LAML)中高表达，且与临床高白细胞和血清LDH水平升高显著相关，同时EZH2高表达患者预后较低表达患者差[11]。所以，EZH2表达与癌细胞的增殖、浸润和转移密切相关；
因此，深入研究EZH2在肿瘤发生、发展中的作用及其机制，对开发EZH2相关的靶向药物，在肿瘤治疗上能否取得突破具有重要意义。
目前关于EZH2在HCC中的具体作用机制认为EZH2复杂的调控模式，尤其与DNA甲基化和组蛋白其他修饰的相互作用对下游基因表达的影响,参与HCC发生发展[12]，但具体机制仍不清楚，张淑群等[13]研究认为EZH2在HCC细胞中影响MMP-9的表达水平，从而参与HCC的分化和转移，但EZH2基因与HCC细胞浸润的关系尚鲜有阐述，CAI 等[14]进一步研究发现，EZH2 调控的 H3K27TM 蛋白含量可影响HCC预后；
另有研究也表明，原发性HCC靶向药物甲苯磺酸索拉菲尼耐药与EZH2明显相关，其EZH2 表达水平越高，耐药性越强；
耐药性随EZH2 表达水平降低而降低[15]。因此，基于目前研究背景，本研究通过Oncomine数据库和Kaplan-Meier Plotter数据库深入挖掘EZH2基因表达的相关数据，探寻EZH2基因在HCC组织与正常肝组织中的不同表达水平与患者预后的关系。
本研究结果发现，EZH2在不同肿瘤中表达水平不一，在大多数肿瘤中呈现高表达水平；
在所有研究中，表达水平增高的研究有127项，表达水平下调的研究有9项，涉及HCC与EZH2基因表达水平的研究共3项。
通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现，EZH2基因表达水平对HCC患者的OS、PFS、RFS、DDS均存在显著的影响，EZH2 高表达水平组HCC患者的OS和PFS、RFS、DDS均明显低于EZH2低表达水平患者，表明HCC患者预后与EZH2基因表达水平明显相关，高表达水平组预后可能会更差。Ualcan数据库在线分析结果亦显示，EZH2高表达水平的HCC患者的OS显著缩短。在此基础上继续通过Srting数据库挖掘到和EZH2相关联的蛋白，并进行功能注释和KEGG通路富集分析，主要涉及的生物学过程有真菌状乳头形成、毛囊基板形成、组蛋白H3-K27的甲基化调控、组蛋白H4的甲基化调控等过程，涉及的信号通路主要集中在Notch信号通路、长寿调节信号通路、慢性粒细胞白血病通路、癌症microRNA信号通路和甲状腺激素信号通路、细胞周期。本研究进一步分析了EZH2在HCC中的共表达基因，BUB1B、KIF4A、TPX2、MELK、DLGAP5、KIF20A、BIRC5、CDC20是与其相关性最强的8个基因。
通过在线检索TIMER数据库也发现，在HCC免疫微环境中，EZH2 mRNA表达水平与肿瘤纯度、B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的表达也呈正相关。
综上所述，本研究通过数据库中HCC组织中EZH2相关基因信息的深入挖掘、分析，EZH2在HCC组织中呈高表达，其表达水平与患者不预后密切相关，在HCC诊断、靶向治疗及预后分析中具有重要的临床意义。本研究为进一步探索EZH2基因与HCC的关系奠定了一定的基础。本研究对判断HCC的恶性程度、预后、治疗进一步提供可行的方法。
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