基于网络药理学和分子对接的五苓散治疗肝硬化腹水作用机制探讨△
时间：2023-03-01 12:45:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
韦柳婷，胡振斌，高松林，韦湘红，黄玲珊，吴凡
1.广西中医药大学，广西 南宁 530000；
2.广西中医药大学 第一附属医院，广西 南宁 530000
肝硬化腹水是肝硬化患者病程由代偿期过渡至失代偿期的标志，是门静脉高压、肾素-血管紧张素-醛固酮系统失衡和低蛋白血症等多种因素综合作用的结果[1]。腹水是肝硬化自然病程中的典型症状，每年会存在于5%～10%的代偿期患者中[2]。代偿期患者疾病进展过程中如果出现腹水，其5 年生存率将由原来的80%左右降为失代偿期的30%左右，总体中位生存期仅约2 年[3]。西医的治疗方式主要有病因治疗、限钠、利尿、放腹水和补充白蛋白等[4]，但是可能会引起低钠血症、肝肾综合征和肝性脑病等严重不良反应[5-6]。
肝硬化腹水属于中医“鼓胀”范畴，其主要病机为三焦气化不利、水液代谢失常[7]。五苓散源自《伤寒论》，由白术、泽泻、猪苓、茯苓和桂枝组成。方中猪苓、泽泻相配利水渗湿，使水湿之邪从小便而去；
白术、茯苓健运中焦，培土以制水；
桂枝温阳化气，助膀胱气化功能，加强利水作用；
全方共奏温阳化气利水之功，恰中其病机。此方有利尿、护肾、止泻、控制血压和调节代谢等效果[8]，同时具有改善肝功能的作用[9]。多篇文献报道其对肝硬化腹水患者具有改善腹水症状、人血清白蛋白（ALB）水平和肝功能的疗效，安全性较高，但相关的分子机制研究尚匮乏[10-13]。本研究基于网络药理学和分子对接方法，探讨五苓散治疗肝硬化腹水的作用机制，为其后续深入研究和临床应用提供参考。
1.1 五苓散成分、靶点收集与整理
在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）中以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18 为条件检索五苓散中所有中药的活性成分并收集所对应的靶点蛋白。通过UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）将靶点蛋白转换为标准基因名。
1.2 肝硬化腹水靶点收集
以“Cirrhosis ascites”为关键词，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMⅠM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和DrugBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）数据库中检索疾病靶点。
1.3 交集靶点的筛选
应用R语言获取五苓散和疾病的交集靶点。
1.4 中药-活性成分-靶点网络的构建
以交集靶点为桥梁，反向筛选得到对应活性成分和中药，制作网络关系表及属性文件，导入Cytoscape 3.8.0 软件中构建中药-活性成分-靶点网络，运用Network analyzer功能进行拓扑分析。
1.5 蛋白质-蛋白质相互作用（PPⅠ）网络构建及核心靶点筛选
在STRⅠNG 数据库（https://string-db.org/）中导入交集靶点，限定物种为“Homo sapiens”，其他默认数值不做调整，构建PPⅠ网络。运用Cytoscape 3.8.0软件中CytoNCA插件对结果进行可视化分析。
1.6 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析
使用R 语言程序和Bioconductor 数据库（https://www.bioconductor.org/）中的“org.Hs.eg.db”人类数据库，“clusterProfiler”“DOSE”“enrichplot”和“stringi”等软件包对疾病和药物的交集靶点以P=0.05、Q=0.05进行GO和KEGG功能富集分析。
1.7 分子对接
运用AutoDock Vina 1.1.2 将核心靶点与β-谷甾醇、(+)-儿茶素、花旗松素、表儿茶素和常春藤皂苷元（由于PubChem 数据库未检索到3β-乙酰氧基苍术酮，故不进行分子对接）进行分子对接。首先利用PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性成分的2D 结构文件，导入Chem3D软件转换为最小自由能的3D 空间构象的.mol2 格式。在UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）中将Status 设置为Reviewed，Popular organisms 设置为Human，结合是否存在小分子配体、构象分辨率和中国知网数据库文献综合分析，寻找核心靶点对应蛋白的PDB ⅠD，通过PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）下载3D 晶体结构。最后通过PyMOL 软件和AutoDockTools 1.5.6 软件对活性成分的3D 空间构象和核心靶点对应蛋白的3D晶体结构进行预处理，利用AutoDock Vina 1.1.2 进行分子对接，并用PyMOL软件展示结果。
2.1 五苓散活性化学成分和靶点筛选
通过TCMSP 得到五苓散50 个活性化学成分，其中茯苓、猪苓和泽泻分别为15、11、10 个，白术和桂枝同为7 个，去重后共有46 个活性成分。桂枝和泽泻中均含有谷甾醇；
啤酒甾醇和麦角甾-7,22E-二烯-3β-醇是茯苓和猪苓的共同成分；
过氧麦角甾醇是桂枝和猪苓的共同成分。46 个活性成分所对应的61 个蛋白靶点，经UniProt 数据库校正后共得到47个靶点，涉及27个活性化学成分（表1）。
表1 五苓散潜在活性成分信息
续表1
2.2 肝硬化腹水相关靶点及交集靶点的筛选
收集GeneCards 数据库（将score 设置为1）、OMⅠM、TTD 和DrugBank 数据库中的肝硬化腹水相关靶点，整合去重后共得到1623 个靶点基因。通过R 4.0.4 的VennDiagram 数据包得到17 个药物-疾病交集靶点（图1），反向推导得到23个活性成分。
图1 五苓散治疗肝硬化腹水的药物-疾病共同作用靶点韦恩图
2.3 药物-活性成分-疾病靶点网络构建和关键活性成分分析
使用Cytoscape 3.8.0 软件对17 个交集靶点进行药物-活性成分-疾病靶点网络的构建（图2）。利用Cytoscape 3.8.0 软件的“Network analyzer”功能，根据度值筛选排名前6 名的活性成分，分别是β-谷甾醇、(+)-儿茶素、花旗松素、表儿茶素、常春藤皂苷元、3β-乙酰氧基苍术酮（表2）。
表2 五苓散治疗肝硬化腹水度值前6位的活性成分
图2 五苓散治疗肝硬化腹水的药物-活性成分-核心靶点网络
2.4 PPⅠ网络的构建及核心靶点的筛选
运用STRⅠNG 数据库对17 个交集靶点构建PPⅠ网络（图3），得到17个节点、55条边，平均节点度值为6.47。通过Cytoscape 3.8.0 软件分析中心性、介度中心性、特征向量中心性、紧密中心性、网络中心性和基于局部平均连通性的方法拓扑参数，以6 个数值均大于其中位数的节点为条件进行筛选，得到胱天蛋白酶3（CASP3）、CASP8、热休克蛋白90α（HSP90AA1）、环氧合酶2（PTGS2）和过氧化氢酶（CAT）、雌激素受体1（ESR1）等核心靶点（图4）。
图3 五苓散治疗肝硬化腹水靶点PPI网络
图4 五苓散治疗肝硬化腹水PPI网络核心靶点拓扑分析
2.5 GO功能富集分析
GO 分析得到800 个生物过程（BP）条目，30个细胞组成（CC）条目，73 个分子功能（MF）条目，GO 分析分别取前10 条进行展示（图5）。在BP中主要涉及对类固醇激素的反应和生殖结构、生殖系统、女性性腺发育等方面；
在CC中靶点富集在细胞器外膜、细胞外膜、膜筏、质膜微区、膜区、线粒体外膜、核孔复合体和髓鞘等；
在MF 中核受体活性和配体激活的转录因子活性富集程度最高。
图5 五苓散治疗肝硬化腹水的GO功能富集分析
2.6 KEGG富集分析
KEGG分析得到67条通路（P＜0.05，图6），主要涉及晚期糖基化终产物（AGE）-晚期糖基化终产物受体（RAGE）、p53、白细胞介素-17（ⅠL-17）、肿瘤坏死因子（TNF）和雌激素信号通路等。上述通路与五苓散干预肝硬化腹水的发生发展有关。
图6 五苓散治疗肝硬化腹水的KEGG通路分析（排名前30）
2.7 分子对接验证
选取PPⅠ网络中核心靶点蛋白（HSP90AA1、CASP3、CASP8、PTGS2、ESR1、CAT）与β-谷甾醇、(+)-儿茶素、花旗松素、表儿茶素和常春藤皂苷元进行分子对接。结果显示，化合物与靶点最低结合能为-10.5～-6.8 kcal·mol-1（1 cal≈4.184 J），均具有良好的结合力（表3）。其中花旗松素与CAT、表儿茶素与CAT、(+)-儿茶素与CAT、表儿茶素与PTGS2、β-谷甾醇与PTGS2、β-谷甾醇与HSP90AA1结合能分别为-10.5、-10.0、-9.2、-9.2、-9.2、-9.1 kcal·mol-1，结合能力最好，用PyMOL 可视化后见图7。
图7 五苓散治疗肝硬化腹水部分活性成分与核心靶点分子对接
表3 五苓散治疗肝硬化腹水活性成分与核心靶点分子对接结果
拓扑分析得出五苓散可能是通过β-谷甾醇、(+)-儿茶素、花旗松素、表儿茶素、常春藤皂苷元和3β-乙酰氧基苍术酮等活性成分治疗肝硬化腹水。β-谷甾醇在富含脂质的素食中含量丰富，具有抗菌抗炎、抗氧化、降血糖、调血脂和类激素功能等多种药理作用[14]。β-谷甾醇能降低肝星状细胞（HSC）中与细胞外基质（ECM）合成相关的蛋白表达水平，减少胶原蛋白的积累量，发挥减轻活化人肝星状细胞及二甲基亚硝胺诱导的小鼠肝损伤的作用[15]。儿茶素及其立体异构体可以通过调控丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核因子E2相关因子2（Nrf-2）、Toll 样受体4（TLR4）/核转录因子-κB（NF-κB）、儿茶酚-O-甲基转移酶（COMT）和NF-κB 等多条信号通路发挥抗菌、抗炎、抗癌、护肝、控制血糖和增强记忆力等作用[16]。(+)-儿茶素能够促进抗氧化酶中超氧化物歧化酶的表达，减少血清中血脂和丙二醛含量，从而修复小鼠的肝损伤和改善脂质代谢[17]。表儿茶素可以通过抑制炎症反应、调节抗氧化防御系统和减轻甲氨蝶呤肝毒性诱导的损伤起到护肝效果[18]。花旗松素能通过激活磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B（PⅠ3K/Akt）信号通路、抑制NF-κB 信号通路和提高抗氧化酶含量 [还原型谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）] 发挥抗凋亡、抗炎、抗氧化作用来逆转小鼠肝损伤[19]。常春藤素皂苷元可以抑制促炎因子表达和阻断p38 MAPK 活化达到抗炎、抗凋亡的效果，治疗乙醇诱导的肝损伤[20]。苍术酮可以抑制肝癌HepG2 细胞的迁移，并且能够通过线粒体途径促进其凋亡，其作用效果与剂量呈正相关[21]。
PPⅠ网络预测的关键靶点包含CASP3、HSP90 AA1、CASP8、PTGS2、ESR1 和CAT。CASP3 和CASP8 均属 于凋亡Caspases 家族蛋白，CASP3 在细胞凋亡方面发挥着关键作用[22]。CASP3 活化与肝星状细胞（HSC）活化、胶原蛋白沉积和小鼠肝细胞损伤有关，能促进肝纤维化进程和肝细胞死亡[23]。CASP8 能够减轻肝脏脂质堆积和炎症，在非酒精性脂肪肝炎（NASH）疾病进展中起负调控作用[24]。PTGS2 的表达产物环氧合酶2（COX-2）可以通过激活NF-κB 通路引起炎症反应和增加线粒体活性氧的产生导致氧化应激损伤肝脏[25]，其过度表达常与肿瘤密切相关[26]。塞来昔布（COX-2 抑制剂）可作用于脾肝轴，通过减少脾源性促炎性细胞因子表达和淋巴组织增殖，抑制氧化应激刺激，对肝硬化有明确的治疗效果[27]。HSP90AA1 是HSP90 基因家族中的1 种癌蛋白，能够提高c-核蛋白类基因（c-MYC）的表达，促进肝细胞癌的产生和发展[28]，也是肝细胞癌的潜在诊断生物标志物，其表达的程度高低与肝细胞癌、胃癌等多种癌预后有紧密的联系[29]。对酒精性肝病患者使用HSP90AA1 抑制剂能够降低NLRP3 炎性体活性和下游促炎趋化因子（ⅠL-1β和ⅠL-18）的表达[30]。ESR1 是多种细胞色素P450酶（CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19）的调节剂，对肝脏的代谢过程有重要的影响作用[31]，其介导的环状RNA-4018（circ_0004018）能够抑制肝肿瘤细胞中血管的生成[32]。CAT 是一种抗氧化酶，能够减轻氧化应激损伤，抑制肝硬化的发展[33]。
对筛选出来的17 个交集靶点进行KEGG 通路富集分析，发现五苓散主要通过AGE-RAGE、p53、ⅠL-17、TNF 和雌激素信号通路等治疗肝硬化腹水。AGE与RAGE结合后能作用于MAPK、JAK2/STAT1等多条通路激活NF-κB 引起TGF-β、TNF-α和ⅠL-1等细胞因子的产生，促进肝星状细胞活化、促纤维化因子形成和胶原蛋白合成及沉积，进而导致肝纤维化，逐步发展为肝硬化[34]。铁死亡与肝纤维化相关，而p53 通路在细胞铁死亡中具有关键作用[35]。p53 可以通过诱导铁死亡抑制肝星状细胞活化，减轻四氯化碳诱导的小鼠的肝纤维化程度[36]。ⅠL-17 是Th17 的主要效应分子，Th17/ⅠL-17 信号通路能够引起持续炎症反应和纤维化，推动着乙型病毒性肝炎（HBV）和丙型病毒性肝炎（HCV）向肝硬化的方向发展[37]。Th17/ⅠL-17 轴既可以诱导HSC 活化、促纤维化因子表达和促进上皮-间质转化（EMT），促进胶原蛋白的合成和沉积，导致肝纤维化，又可以促进炎症细胞的募集并增加促炎因子表达[38-42]。TNF-α是一种涉及细胞增殖、分化和凋亡，以及炎症反应、免疫反应等多方面的多功能促炎性细胞因子[43]。由TNF-α形成的TNF-α诱导蛋白8 样分子1（TⅠPE1）可以与凋亡信号调节激酶1（ASK1）直接结合，抑制TNF 受体相关因子6（TRAF6）的泛素化活性，产生预防肝脂肪变性、炎症反应和肝纤维化的作用[44]。雌激素信号通路在调节脂肪生成方面很重要，可以维持肝脂质稳态[45]。
综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接方法从理论上初步论证了五苓散可以通过多成分、多靶点、多通路治疗肝硬化腹水，主要起到抗炎、抗纤维化、抗氧化等多种作用。
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