肺炎支原体坏死性肺炎患儿支气管肺泡灌洗液IL-17A及MUC5AC检测的临床意义
时间：2023-03-01 10:20:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
余燕娟 李敏 靳秀红
肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia, MPP)占儿童社区获得性肺炎的10%～40%[1-3]，是引起坏死性肺炎的最重要病原体之一[4]。儿科纤维支气管镜技术的迅速发展[5]，促进了肺部免疫的研究。MUC5AC高表达是气道黏液分泌量及黏度增加的主要原因[6]。国内外研究[7-11]表明肺炎支原体感染能够导致MUC5AC高分泌，但其机制尚不清楚。IL-17A是一种关键的促炎因子[12-13]，其产生在中性粒细胞招募及防御肺炎支原体感染中是必不可少的[14]。另外，IL-17A通过NF-κB信号通路在气道上皮细胞中对MUC5AC的表达进行调控[15]。查阅国内外文献发现，有关肺炎支原体坏死性肺炎患儿的肺泡灌洗液(BALF)中IL-17A、MUC5AC的相关研究较少，本文通过检测MP坏死性肺炎BALF中IL-17A及MUC5AC水平，揭示MPP感染导致肺部炎症反应及黏液高分泌的机制，为MPP的治疗提供理论依据及靶点。
一、研究对象
回顾性分析2018年1月～2021年12月在我院呼吸科住院治疗的肺炎支原体感染所致大叶性肺炎患儿，并根据患儿是否合并肺坏死分为肺炎支原体非坏死性大叶性肺炎(A组)30例及肺炎支原体坏死性肺炎(B组)30例，以及同期入院行纤维支气管镜下异物取出治疗的30例支气管异物患儿(对照组/C组)作为研究对象。选取的所有病例组患儿(A组+B组)根据病情均行两次纤维支气管镜灌洗治疗，第一次在入院3～5天内急性期时，第二次在第一次灌洗治疗5～7天后。该研究经过医院伦理委员会批准(2022-K-034)，且在获得患儿家长知情同意的情况下进行纤维支气管镜操作及留取肺泡灌洗液。
非坏死性大叶性肺炎选取标准：①年龄1个月～14岁；
②符合肺炎诊断，有咳嗽伴或不伴发热症状，胸部影像学显示大于1个肺段或一个肺叶有浸润影；
③符合MP感染标准，即BALF中MP-RNA/DNA阳性；
⑤排除混合其他病原感染，包括呼吸道合胞病毒、流感病毒A、B型、腺病毒、鼻病毒、副流感病毒l、2、3型、博卡病毒、人偏肺病毒的常见7种呼吸道病毒及肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae，CP)，并行血培养、痰培养、BALF培养等，排除合并其他病原体如细菌、真菌、结核等感染。
坏死性肺炎入选标准：在上述大叶性肺炎的诊断基础上合并有胸部影像学表现为肺实变区域出现小的多发性含气或液体的空洞[16]。
支气管异物组入选标准：①年龄≤14岁；
②异物在气管内存留时间不超过3d；
③异物吸入前6个月内无肺部感染病史。本研究通过医院伦理委员会的审查，经患儿家长同意并签署知情同意书。
以上入组对象均排除支气管哮喘、肺脓肿、肺囊肿伴感染、肺结核、支气管肺发育畸形、免疫缺陷病、血液系统疾病、慢性呼吸系统疾病等。
二、方法
1 一般临床资料收集 收集三组患儿的一般资料及临床资料(临床表现、实验室检验结果、支气管镜下表现、胸部影像结果和治疗用药情况等)。实验室检验结果包括C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)、D-二聚体、LDH；
痰培养、血培养和BALF病原学检测。
2 BALF标本采集 所有的支气管镜检查均有临床指征，并在适度镇静和局部麻醉下使用可弯曲的纤维支气管镜进行。肺炎组患儿选择肺部病变相应的支气管肺段进行灌洗，支气管异物对照组患儿选择异物病灶的对侧肺进行灌洗。用37℃灭菌生理盐水作为灌洗液，每次回收应大于40%。将回收的灌洗液立即置4℃冰箱保存，半小时内送检。按照欧洲呼吸病学会推荐[17]，收集第1管灌洗液送病原学检测，第2和第3管灌洗液合并混匀再次分为两份，一份送细胞学检测，另一份离心后取上清放入-80℃冰箱作为MUC5AC、IL-17A检测标本。
3 BALF中MUC5AC、IL17A检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定。试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技有限公司提供。
MUCA5AC检测操作步骤：
(一)分别设定标准孔、空白孔和样本孔。标准孔加入100μL倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL标准品&样本稀释液，其余孔加入100μL待测样本(建议所有的待检样本和标准品在检测中设立复孔)。给酶标板覆膜，37℃孵育90 min。
(二)甩尽孔内液体，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，给酶标板覆膜，37℃孵育1 h。
(三)弃去孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干。每孔加洗涤液350μL，浸泡1 min，甩掉酶标板内的液体，拍干。重复此洗板步骤3次。
(四)每孔加酶结合物工作液100 μL，给酶标板覆膜，37℃孵育30 min。
(五)甩尽孔内液体，按步骤3洗板5次。
(六)每孔加底物溶液(TMB)90 μL，给酶标板覆膜，37℃避光孵育15 min左右。
(七)每孔加终止液50 μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。
(八)立即用酶标仪测量各孔在450 nm波长的光密度(OD值)。
(九)绘制标准曲线，计算出各样本的浓度。
IL-17A检测步骤同MUC5AC。
三、统计学分析
一、一般情况
病例组60例，包括非坏死性大叶性肺炎A组30例，其中男15例，女15例(男 ∶女=1 ∶1)，平均年龄(6.12±2.33)岁，坏死性肺炎B组30例，其中男14例，女16例(男 ∶女=1 ∶1.14)，平均年龄(6.45±1.24)岁。对照组C组30例儿童，其中男18例，女12例(男：女=1：1.5)，平均年龄(5.66±2.54)岁。非坏死性大叶性肺炎组、坏死性肺炎组及对照组儿童的年龄、性别差异均无统计学意义(P>0.05)。
二、第一次灌洗BALF中MUC5AC、IL-17A水平比较
第一次灌洗，A组、B组、C组每两组之间BALF中MUC5AC、IL-17A水平的差异有统计学意义，各组数据均符合正态分布(P均<0.05)，且均以B组最高，其次为A组，C组最低(见表1)。
表1 第一次灌洗时各组BALF中MUC5AC及IL-17A水平的比较
三、第二次灌洗BALF中MUC5AC及IL-17A水平比较
第一次灌洗5～7天后，A组和B组患儿行第二次灌洗，B组患儿BALF中的MUC5AC、IL-17A水平较A组仍有显著升高(P<0.05)；
两组患儿MUC5AC、IL-17A水平较第一次灌洗时显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；
A组患儿BALF中MUC5AC、IL-17A水平较对照组差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。
表2 第二次灌洗时各组BALF中MUC5AC及IL-17A水平的比较
四、MUC5AC水平与IL-17A相关性
急性期两组患儿肺泡灌洗液中MUC5AC水平与IL-17A水平呈正相关(rA=0.9716,rB=0.9326,P均<0.001)(见图1，2)。
图1 A组患儿BALF中MUC5AC与IL-17A相关性
图2 B组患儿BALF中MUC5AC与IL-17A相关性
五、两组患儿纤维支气管镜下气道黏液栓塞情况对比
A组和B组患儿两次纤维支气管镜灌洗时气道黏液栓塞情况对比发现，肺炎支原体坏死性肺炎组患儿气道黏液栓塞发生情况较非坏死性肺炎组患儿明显增多，差异具有统计学意义(P<0.05)(见表3)。
表3 A组和B组患儿纤维支气管镜下气道黏液栓塞情况
MP是儿童社区获得性肺炎的重要病原体，MPP发病率逐年升高，且呈现低龄化趋势，由MP感染引起的大叶性肺炎在儿科门诊和病房非常常见，部分患儿出现胸腔积液、肺不张等，且由肺炎支原体引起的坏死性肺炎的发病率呈上升趋势。坏死性肺炎(necrotizing pneumonia，NP)的诊断主要依赖于胸部成像，在胸部平片中，坏死病变可表现为密度降低区域和腔病变，NP的胸部计算机断层扫描(CT)表现为正常肺实质结构的破坏，实质强化减少，结构逐渐被多个小的空气或液体的腔取代，壁薄，不增强[16,18-19]。如果不进行充分的治疗，NP可能会导致并发症，包括支气管胸膜瘘、脓胸、呼吸衰竭和脓毒性休克[20]。自1997年Oermann[21]首次报道MP感染引起的NP以来，文献中报道的病例越来越多。来自中国13家医院的儿童坏死性肺炎病原学的多中心回顾性研究发现肺炎支原体肺炎是导致儿童坏死性肺炎第一位的病原体，其次是肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌[4]。而国内外报道NP的病原体主要以细菌感染为主，肺炎支原体感染占据少数[20,22]。这可能和肺炎支原体流行的区域、人群易感、肺炎支原体的检测方法、肺炎支原体耐药以及近年来我国逐渐增多的难治性支原体肺炎、重症支原体肺炎有关。还可能跟早期抗菌药物的使用使得细菌感染的检出率降低及肺炎链球菌疫苗的普遍接种有关。
肺炎支原体肺炎的全身免疫机制及肺部局部免疫机制尚不明确， BALF来自于肺部感染部位，BALF炎症因子检测对了解MPP局部炎症应答特点和评估病情有重要作用。IL-17A是由先天免疫细胞或T辅助性17(Th17)细胞分泌的一种关键的促炎细胞因子，IL-17A通过诱导趋化因子和在感染部位诱导抗微生物蛋白招募中性粒细胞，在保护宿主防御感染中起到关键作用[23]，显著上调能够直接杀死入侵病原菌的抗菌肽，对宿主免疫做出贡献[24]。国内外已有多项研究表明肺炎支原体肺炎血清及BALF中IL-17A表达水平明显升高，且能够帮助预测难治性支原体肺炎及重症支原体肺炎的发生[13,25-27]。但是关于肺炎支原体坏死性肺炎患儿肺泡灌洗液中IL-17A的表达水平的相关研究较少。
MUC5AC是组成气道黏液的主要黏蛋白，分布于气道表面，由气道上皮细胞及黏膜下腺细胞分泌。正常情况下，只有少量黏液分泌，可以保护气道、协助纤毛运动清除病原微生物及异物[28]。在呼吸道感染后，MUC5AC过度表达，导致黏液栓阻塞气道，使得病情加重、病程迁延、甚至死亡率增加[29]。多项体外研究及动物试验研究发现肺炎支原体感染可诱导MUC5AC的表达，与支气管哮喘的气道重塑、致死性并发症以及慢性阻塞性肺疾病(COPD)的急性加重密切相关，但其致病机制尚不明确。有关肺炎支原体感染的大叶性肺炎及坏死性肺炎的BALF中MUC5AC的表达是否升高及其高表达是否与肺炎支原体感染后所导致的肺坏死性改变相关，国内外并无相关报道。
本研究收集了肺炎支原体感染的非坏死性大叶性肺炎、坏死性肺炎患儿作为病例组及支气管异物的患儿作为对照组进行研究，分别检测其BALF中IL-17A、MUC5AC水平，对于病例组第一次灌洗也就是疾病急性期时的肺泡灌洗液中，所有病例组患儿BALF中IL-17A、MUC5AC水平显著高于对照组儿童，且坏死性肺炎组儿童的IL-17A及MUC5AC水平显著高于非坏死性大叶性肺炎组，说明肺炎支原体感染后，可引起肺部局部炎症反应增强及黏蛋白分泌增多，这与临床上见到的纤维支气管镜下黏液栓及塑形性支气管炎以肺炎支原体感染为主是相一致的，提示肺炎支原体感染后IL-17A、MUC5AC的高表达与肺炎支原体坏死性肺炎的发生发展相关。病例组第二次灌洗后收集肺泡灌洗液再次检测IL-17A及MUC5AC，发现病例组仍高于对照组，且坏死性肺炎组BALF中IL-17A、MUC5AC表达水平明显高于非坏死性大叶性肺炎及对照组(P<0.05)，而非坏死性大叶性肺炎中两种蛋白的表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，说明经过治疗后肺部局部炎症反应及气道黏液高分泌的状态得到一定控制，但是坏死性肺炎BALF中的IL-17A及MUC5AC水平虽然有一定程度的下降，但是较对照组及非坏死性肺炎组中的表达水平仍显著升高，提示肺炎支原体坏死性肺炎的肺部局部炎症免疫反应及黏液高分泌状态持续时间更长，这可能导致坏死性肺炎的病例住院时间及治疗疗程更长。本研究还分析了肺炎支原体坏死性肺炎和非坏死性肺炎组患儿的纤维支气管镜下表现，发现坏死性肺炎组患儿出现气道黏液栓塞的比例更多，这与本研究中检测的两组BALF中MUC5AC在坏死性肺炎组患儿中表达水平更高相一致。
综上所述，肺炎支原体感染后引起中性粒细胞增多，增多的中性粒细胞迁移至肺组织引起IL-17A释放增多，而IL-17A又可以招募更多的中性粒细胞，并且IL-17A具有诱导IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达的能力，引起肺部过激的免疫反应，导致气道黏膜损伤、气道黏蛋白MUC5AC分泌增多，引起气道黏液栓塞及气道阻塞，进一步导致闭塞性支气管炎、支气管扩张、坏死性肺炎等的发生。
本研究通过分析肺炎支原体感染的大叶性肺炎及坏死性肺炎BALF中IL-17A、MUC5AC的表达水平，探讨了这两种蛋白分子的表达与肺炎支原体坏死性肺炎的相关性，并给肺炎支原体肺炎的治疗提供了理论依据和新的靶点，为后期开发新的药物提供了更多的选择和方向。本研究尚有不足之处，没有同步检测患儿血清中的细胞因子水平，无法判断及对比全身炎症反应与肺部局部免疫反应是否平行发生。后期研究中预期收集肺泡灌洗液中的细胞提取RNA逆转录为cDNA，通过荧光定量PCR检测IL-17A mRNA、MUC5AC mRNA的表达水平，在转录水平上揭示肺炎支原体感染后黏液高分泌的机制及对肺部并发症的影响。
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