基于外泌体介导的巨噬细胞极化探讨针刺治疗慢性阻塞性肺疾病的潜在机制

刘路,齐文川,曾倩,周子扬,陈道鸿,高蕾,何斌,蔡定均,余曙光,赵凌,2

(1.成都中医药大学针灸推拿学院,四川 成都 610075;2.四川省针灸与时间生物学重点实验室,四川 成都 610075)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种严重危害人类健康的常见病,严重影响患者的生命质量,是导致死亡的重要病因,并给患者带来沉重的经济负担[1]。慢性阻塞性肺疾病以肺结构退行性病变、炎症和纤维化为特征[2],通常由慢性支气管炎、黏液高分泌、慢性气道阻塞、气道重塑和肺气肿引起[3]。临床上常以咳嗽、咳痰、气短、喘息和胸闷等为主要表现。我国20岁以上成人COPD患病率为8.6%,其中40岁以上人群患病率高达13.7%[4]。根据全球疾病负担调查,COPD是我国2016年第5大死亡原因[5],2017年第3大伤残调整寿命年的主要原因[6]。

COPD的发病机制复杂，近年来,在原有的氧化应激、炎症机制、蛋白酶/抗蛋白酶失衡以及细胞凋亡等假说基础上,研究人员还提出了自身免疫反应、微生物组的变化以及无效的受损修复机制等[7]。其中炎症机制是贯穿COPD整个病理进程的关键病理机制,病变涉及气道、肺实质及肺血管,由多种细胞和炎症介质参与。细菌、有害颗粒或气体等致病因素进入肺后,激活炎症细胞,活化的炎症细胞释放炎症介质,可直接破坏肺组织或通过靶向位于上皮组织和血液交界处的呼吸上皮募集更多的炎症细胞,产生更多炎症因子,增强炎症信号,产生瀑布样炎症反应,加速COPD病理进程,影响COPD预后[2-3]。并且炎症反应是启动其他一系列病理进程的始动因子,系统性炎症反应可破坏细胞外基质,导致胶原蛋白沉积。炎症刺激破坏气道上皮细胞、胶原纤维、纤毛正常结构,促进黏液产生,减弱纤毛清除黏液的功能。反复的炎症刺激造成肺组织损伤和修复的异常,进而导致气道重塑和肺气肿的形成[7]。因此,抑制炎症反应是延缓COPD病理进程的重要途径。

而各种炎性细胞在COPD中发挥不同作用,近年来巨噬细胞在COPD中的作用逐渐被发掘,目前已有大量研究证实巨噬细胞在COPD的炎症机制中具有关键作用[8]。大量研究表明外泌体参与COPD的发生发展,可通过调控巨噬细胞功能而影响COPD的进展[9-10]。目前COPD的治疗以长期口服激素、使用支气管扩张剂等西药为主,尽管能改善患者症状,但伴随着耐药、免疫抑制及骨质疏松等多种不良反应[11-12]。

针刺是以中医理论为指导防治疾病的一种方法,注重辨证论治与整体观念相结合,因证立法,辨证用穴。在COPD的治疗上,针刺疗法通过刺激相关穴位,激发人体经气,调整脏腑功能,使得肺、脾、肾之气得养而气道通畅,呼吸均匀和调,从而达到宣肺定喘、运湿化痰的目的。现代研究表明针刺可减轻COPD患者的临床症状,改善患者的肺功能、生活质量及提高呼吸肌力量和运动能力等,并具有简便易行、经济安全等优点,但其具体机制仍在探索。巨噬细胞在微环境刺激下可极化为M1型或M2型巨噬细胞,其中M1型极化后可释放促炎细胞因子,具有促炎作用,而M2型则具有抗炎及免疫调节等功能。研究表明电针可能通过抑制肺泡巨噬细胞向M1型极化,降低COPD大鼠肺内炎性反应,从而改善肺功能[13]。大量研究发现与针刺效应相关的外泌体表达[14-16],提示外泌体可能是解释针刺效应的潜在手段,其中一项研究提示针刺可能通过调节相关外泌体的释放,抑制COPD小鼠肺组织NRLP3炎症体激活,从而发挥治疗COPD的疗效[16]。因此,本文旨在从调控外泌体介导的巨噬细胞激活角度探讨针刺治疗慢性阻塞性肺疾病的可行性。

2.1 巨噬细胞简介

巨噬细胞来源于骨髓源性的单核细胞、卵黄囊和胎儿单核细胞[17],在先天免疫和后天免疫中发挥着不可或缺的作用,是抵御外来入侵的第一道屏障,并在先天免疫中协调白细胞渗透[18]。巨噬细胞具有高度可塑性,在微环境刺激下发生表型和功能上的适应性改变,即巨噬细胞极化[19]。研究者通过实验获得M0巨噬细胞,随后将这些M0巨噬细胞与特定的表型介质一起孵育,可以极化为M1和M2巨噬细胞[20]。M1型巨噬细胞又称为经典活化巨噬细胞,活化后可释放促炎细胞因子、趋化因子、诱导型一氧化氮合酶(Inducible NO synthase, iNOS)和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)等。且M1型巨噬细胞可提呈抗原,发挥免疫防御功能。M2型巨噬细胞又称为替代活化巨噬细胞,抗原提呈能力弱,具有抗炎、促进组织修复、免疫调节等功能。

2.2 巨噬细胞参与COPD疾病的炎症过程

在COPD发生进展中,巨噬细胞是重要的参与者,尤其在慢性炎症的启动阶段具有决定性作用,也是研制COPD抗感染治疗药物的主要靶细胞[21]。研究者发现巨噬细胞在COPD患者的气道内、肺实质内以及肺泡灌洗液和痰液内均显著增加[22-23]。有研究显示气道中的巨噬细胞数量与COPD严重性呈正相关,曾有文献报道COPD动物模型中消耗肺组织巨噬细胞可用来抵抗肺气肿的进展[24]。在正常肺组织中,肺泡巨噬细胞大部分是非极化的。随着吸烟和COPD严重程度的增加,巨噬细胞以双极化状态(M1和M2极化状态)存在于COPD患者肺组织中,但M2的上升速度快于M1[25-26]。He等[27]发现,肺组织M2巨噬细胞的比例与COPD小鼠模型的肺功能呈负相关。COPD肺部炎症的发展会影响气道,使气流受限,导致肺内缺氧。把气道上皮细胞与巨噬细胞共同培养,早期低氧环境刺激气道上皮细胞诱导巨噬细胞向M1极化,而长期缺氧后,气道上皮细胞则会刺激巨噬细胞向M2极化[28]。COPD早期可能是以M1为主,以激发适应性免疫反应,清除外来入侵的微生物,而在COPD中后期,由于炎症反应的持续发展,为了维护机体稳态,M2将发挥抗炎作用,以抑制过度的炎症反应[29-30]。

3.1 外泌体参与COPD发病

细胞外囊泡是一种直径为20～1 000 nm的球形双层蛋白脂质体,目前被分为微泡、外泌体和凋亡小体[31]。其中外泌体大小约为30～100 nm,机体内几乎所有的细胞均可以分泌外泌体[32]。外泌体包含独特的microRNA、信使RNA和蛋白质[33],外泌体能够介导细胞间或器官间通讯,调节细胞功能或细胞活动,如炎症[34]、细胞凋亡[31]和免疫反应[35]等。多项研究表明,外泌体在COPD的发生和发展中起着重要作用,包括肺实质和周围小气道炎症(慢性支气管炎)、肺组织变性(肺气肿)和小气道重塑,导致肺功能下降[36-38]。各种体液(包括血清、血浆和支气管肺泡灌洗液)中的外泌体miRNAs可作为COPD早期诊断、判断病情严重程度和预后的特异性生物标志物[2, 39]。综上可知,外泌体参与了COPD发生发展的进程,并且能够作为诊断和治疗的生物标记物。在肺部炎症性疾病中,外泌体激活了固有免疫系统(如肺泡巨噬细胞)从而促进了肺部炎症[40]。并且在COPD中,外泌体也参与了巨噬细胞极化过程,促进肺部炎症,从而参与COPD的发病进程。

3.2 上皮细胞来源外泌体参与巨噬细胞极化影响COPD发病过程

巨噬细胞不断接收来自周围或远处细胞的信号以实现巨噬细胞M1极化或M2极化,肺上皮细胞和肺泡巨噬细胞之间通过外泌体介导的信号传递进行细胞间的双向通讯,在对无菌刺激(如高氧或酸吸入)的反应中,肺泡巨噬细胞从上皮细胞来源外泌体中接收“促炎”信号,随后促进M1极化和巨噬细胞迁移增加[41-42]。另一项研究通过体外实验发现,来自香烟烟雾提取物处理的小鼠气道上皮细胞的外泌体通过上调髓样细胞-1表达的触发受体促进M1巨噬细胞极化,从而加重COPD的发展[10]。Chen等通过体外研究发现,香烟烟雾提取物处理后的支气管上皮细胞来源的外泌体不仅可以增加CD86+、CD80+、CD163+和CD206+细胞的百分比,还可以诱导肿瘤坏死因子、白介素6、iNOS、白介素10、精氨酸酶1和转化生长因子-β,表明RAW264.7巨噬细胞的M1和M2极化都在增加[43],这与He等的研究结果相反,He等发现香烟烟雾提取物处理后的支气管上皮细胞衍生的外泌体通过减轻M2巨噬细胞极化,减轻了参与COPD发病机制的上皮-间质转化的进程[9]。两项研究结果相悖的原因可能是因为在He等的研究中,巨噬细胞与外泌体共培养了48 h,而在Chen等的研究中,巨噬细胞与外泌体共培养了24 h。可能是由于巨噬细胞的应激反应,M2巨噬细胞在短期内显著增高,促进炎症的消失,这与Feng等的研究结果一致,Feng等发现暴露于香烟烟雾提取物9～24 h,大鼠肺泡和腹腔巨噬细胞向M2极化[44]。

3.3 巨噬细胞来源外泌体调控巨噬细胞极化参与COPD

不仅上皮细胞来源的外泌体能够激活巨噬细胞,参与COPD发病过程,巨噬细胞来源的外泌体在COPD的发病过程中也十分重要。首先,巨噬细胞来源的外泌体通过介导miR-223诱导未成熟单核细胞分化为巨噬细胞[45]。然后,外泌体miR-17和miR-221通过介导整合素β促进巨噬细胞迁移[46]。最后外泌体miR-221和miR-320刺激促炎细胞因子的分泌,从而激活肺泡巨噬细胞[41]。在这一系列的分化、迁移和激活后,肺泡巨噬细胞募集中性粒细胞、Th1和Tc1,促进了COPD肺部炎症[47]。综上,外泌体通过介导巨噬细胞极化参与COPD肺部慢性炎症,在COPD的发病及进展中有十分重要的作用。

4.1 针刺治疗COPD疗效确切

针刺治疗COPD不仅疗效确切,而且还具有刺激温和、无毒副作用、简便易行等特点,临床上普遍被患者所接受。COPD患者在接受针刺治疗后,其6 min步行距离和呼吸困难等症状得到改善,同时还可以提高患者的运动耐力以及机体免疫力[48-51]。多项系统评价也表明针刺对COPD患者有效,能够改善患者肺功能及生活质量[52-53]。动物实验也发现针刺具有较好的抗炎作用,其可降低COPD大鼠肺组织及支气管肺泡灌洗液内促炎细胞因子的表达水平[54-55],抑制COPD大鼠肺部炎症反应的加重,减轻肺损伤[56],改善大鼠肺功能。目前,针刺治疗COPD的机制研究主要以炎症机制[57]、免疫机制[58-59]为主,其次是氧化应激机制[60]和蛋白酶抗蛋白酶失衡机制[61],针刺是否通过其他机制治疗COPD还需要进一步研究[62]。

4.2 针刺调控炎症性疾病巨噬细胞极化过程

近年来研究表明,针刺参与调节炎症性疾病的巨噬细胞极化过程。针刺的抗炎效应可通过降低炎性疾病中M1的表达水平,增加M2的表达水平以维持M1/M2极化平衡,从而缓解炎症的持续加重,起到保护组织等作用。其中,Song等发现连续6 d电针足三里穴可降低结肠炎小鼠结肠组织中的M1比例,增加M2比例[63]。研究发现,肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞中iNOS和肿瘤坏死因子的表达水平较正常小鼠明显升高,CD206和白介素10的表达水平明显降低,而经8周针刺关元、足三里和胃脘下俞穴治疗后,肥胖小鼠脂肪巨噬细胞中iNOS和肿瘤坏死因子表达量降低,CD206和白介素10的表达量升高,脂肪炎性反应得到减轻,表明针刺可通过降低肥胖小鼠脂肪组织巨噬细胞中M1的表达,增加M2的表达以改善炎症反应[64]。关节炎模型大鼠炎症踝关节中的M1巨噬细胞数量显著增高,而经4周针刺足三里穴治疗后,关节炎模型大鼠炎症踝关节M1巨噬细胞数量显著降低,而M2巨噬细胞比例略有增加[65]。以上研究表明针刺能够调控炎症性疾病巨噬细胞极化过程,而COPD也是炎症性疾病之一,且炎症机制是贯穿其病理过程的核心病理机制。针刺对炎症性疾病巨噬细胞极化过程的调控提示针刺可能参与调控COPD巨噬细胞的极化过程。

4.3 针刺调节COPD巨噬细胞极化过程

李尹等发现了电针干预足三里和肺俞穴后,COPD大鼠肺泡M1型巨噬细胞极化相关标志物的表达下调,M1型巨噬细胞极化被抑制,从而改善了大鼠的肺功能以及肺部炎性反应[13],李尹等还发现了电针后不仅能抑制M1极化,还能增强M2极化,达到调节COPD大鼠肺泡巨噬细胞的M1/M2极化平衡,从而改善肺部炎症反应。上述研究表明针刺参与调节炎症性疾病的巨噬细胞极化过程,并且针刺可通过参与COPD巨噬细胞极化过程改善大鼠肺功能及肺部炎症反应,但其具体过程还有待探索。

5.1 外泌体在针刺效应机制中的作用

外泌体可携带大量胞内交流信息,是细胞间通讯的必要信使,在免疫、内分泌、神经不同细胞和系统间交流起转输作用[66]。Ding等[67]提出针刺对神经-内分泌-免疫网络有一定的调节作用。外泌体特殊的功能特点使得其与针刺效应机制关系密切。陈波等[68]提出传导针刺信息、传导网络调节作用的重要生物学基础是外泌体。一项研究发现穴位局部外泌体参与针刺效应启动的过程[69],针刺引起穴位局部肥大细胞功能激活,释放肥大细胞源性外泌体,肥大细胞源性外泌体内包含了许多类别的信号分子,促进周围神经末梢感受器兴奋,释放了很多化学物质,从而启动针刺效应[70]。刘小亚[71]提出外泌体在针灸起效机制中主要包含三个方面的作用:广泛地接收并回应信号、充当信使,传导针刺信号以及自稳态系统分泌的外泌体能刺激针灸双向调节机制,维持体内平衡。

5.2 外泌体参与针刺抗炎效应

李牧洋等[69]发现电针足三里和环跳穴可促进正常大鼠血清外泌体释放,并且电针显著降低了关节炎模型大鼠急性发作时与炎症关系密切的外泌体的释放。叶静通过检测血清外泌体microRNA在针刺前后的变化趋势,以此来探索外泌体microRNA在针刺治疗膝骨性关节炎过程中发挥的作用。结果发现针刺治疗膝骨性关节炎的机制,可能是通过下调血清外泌体miR-1228-5p、miR-1296-5p、miR-3168表达以及调控细胞凋亡自噬、凋亡代谢、MAPK信号通路等方式发挥作用[72]。从上述研究中可知,针刺对炎症反应的影响是通过改变外泌体及其内含物质的表达水平,从而导致抗炎物质或促炎物质的释放而起到调节炎症的作用,这样的调控拥有双向影响的作用[73]。外泌体还能反映针刺对细胞代谢的调控[74],以及对神经功能的调控[14, 75]。以上研究均证明,针刺能够调节外泌体的释放,提示外泌体可能是解释针刺效应的潜在手段。近来,Zou等使用猪胰腺弹性蛋白酶诱导的小鼠肺气肿模型,研究针刺是否抑制肺组织NLRP3炎症小体的形成和激活,抑制炎性外泌体的释放,从而改善猪胰腺弹性蛋白酶诱导肺气肿期间的肺部炎症和慢性损伤。研究结果提示肺组织NLRP3炎症小体激活和相关的外泌体释放可能是介导肺气肿发展过程中肺部炎症和退行性损伤的重要致病机制,电针肺俞和足三里能够抑制肺气肿小鼠的肺组织NRLP3炎症激活和相关外泌体释放,这可能与其在肺气肿期间抑制肺部炎症的作用有关[16]。

6.1 针刺可能通过调控外泌体参与巨噬细胞极化治疗COPD研究现状

现有研究结果证明,针刺可能通过调节巨噬细胞极化,抑制炎症,从而改善COPD期间的肺部炎症和慢性损伤,而其中具体机制可能是通过针刺调控特定外泌体,参与了巨噬细胞的极化,从而发挥了抗炎功效,改善了肺部慢性损伤(图1)。目前尚无直接从外泌体参与巨噬细胞极化角度探索针刺治疗COPD的潜在机制的研究。但是,大量的研究已经间接提示针刺可能通过调控特定外泌体,参与巨噬细胞的极化,抑制COPD期间肺部炎症和慢性损伤。

图1 针刺可能通过调控外泌体参与巨噬细胞极化过程治疗COPDFig.1 Acupuncture"s possible therapeutic mechanism in COPD treatment may be involved in macrophage polarization through modulating exosomes

6.2 未来研究设想及实现路径

针刺可通过调控炎症反应发挥治疗作用,但其对COPD炎症的调控机制仍有待深入研究。炎症机制是COPD的核心发病机制之一,而外泌体介导的巨噬细胞极化是COPD炎症过程的重要参与者,也是研究热点之一,对其深入研究可为针刺抗炎机制提供新的证据。在未来的研究中,首先可通过临床试验,收集COPD患者在针刺治疗前后的肺泡灌洗液,从中分选出巨噬细胞,通过体外细胞培养,搜集细胞分泌的外泌体,结合高通量测序技术筛选出关键的外泌体小分子(例如circ-RNA,microRNA和lncRNA等),这些外泌体小分子是针刺发挥疗效的关键靶点。在临床试验的基础上,可开展动物实验,结合外泌体分离技术、流式细胞术验证针刺对COPD外泌体分泌和巨噬细胞极化的调控作用。然后进一步设计实验,敲低或过表达关键外泌体,寻找针刺调控巨噬细胞极化的分子通路。最后设计分子实验,结合细胞培养,免疫荧光等技术观察针刺通过调控外泌体参与巨噬细胞的极化的过程。

如图2所示,针刺可能调节COPD患者体内特定外泌体的分泌,抑制巨噬细胞激活,从而发挥抗炎、改善肺部慢性损伤以及缓解COPD患者临床症状的作用。针刺治疗COPD疗效确切,从外泌体介导的巨噬细胞极化角度切入,可为针刺的抗炎机制提供新的科学证据。有利于促进针刺治疗COPD临床疗效提升和应用推广。同时,外泌体也可作为诊断COPD以及检测针刺疗效的客观生物标志物,为后续进一步研究奠定基础。

图2 从外泌体-巨噬细胞极化角度研究针刺治疗COPD的潜在机制Fig.2 Investigation of the potential mechanism of acupuncture in treating COPD from the perspective of exosomes-macrophage polarization

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