饲料中添加月桂酸单甘酯对尖吻鲈脂质代谢与肝脏功能的影响
时间：2023-02-28 12:05:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
张 慧，董宏标，孙彩云,3，陈 健，黄聪灵，李 勇，段亚飞，张家松
(1.河北农业大学海洋学院，河北秦皇岛，066000；
2.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室，广州 510300；
3.水产科学国家级实验教学示范中心(上海海洋大学)，上海 201306；
4.阳江市水产技术推广站，广东阳江 529500；
5.珠海市现代农业发展中心，广东珠海 519070)
尖吻鲈(Latescalcarifer)属尖吻鲈科，尖吻鲈属，又称金目鲈、盲鰽，主要分布于太平洋西部和印度洋海域，因其广盐性、生长速度快、无肌间刺、味道鲜美、营养价值高等优点，深受养殖户和消费者的喜爱，是我国南方沿海地区重要的养殖对象之一[1-2]。随着养殖集约化程度的不断提高，生产上愈发追求低成本高产出，由此带来的过度投饵、饲料能量过高或质量下降以及水质恶化等问题，易导致鱼体脂肪代谢障碍，造成脂肪过度累积，进而影响肝脏功能，诱发代谢性疾病。本项目组前期在珠海市斗门区多家养殖场随机抽检尖吻鲈养殖成品鱼发现，多数样品患有不同程度脂肪肝，比例高达90%以上。脂肪代谢障碍在养殖生产上表现为生长缓慢、饲料系数升高、抗应激能力下降，尤其高温季节还会引起养殖鱼类的大批死亡，给生产造成巨大的损失，严重制约尖吻鲈养殖业的健康发展[3]。
当饲料中脂肪被消化和水解后，循环脂蛋白和非酯化脂质会通过脂蛋白受体、脂肪酸转运蛋白等被肝细胞吸收和氧化[4-5]。而当脂质积累和脂质消耗之间处于不平衡状态时就会导致脂质的过度沉积，加剧肝脏负荷与氧化损伤，影响机体肝脏功能。而营养与代谢调控是改善养殖鱼类脂肪沉积的根本途径[6]。目前，已有多种功能性添加剂被用于改善鱼体脂质代谢，常见的如中链脂肪酸(MCFAs)[7-9]，它是类C8-C12的饱和脂肪酸，以辛酸(C8H16O2)、癸酸(C10H20O2)和月桂酸(C12H24O2)为代表，相较于长链脂肪酸(LCFAs)碳链更短，更容易被肠道吸收，具有独特的消化吸收、转运、代谢途径[10-11]。月桂酸单甘酯(glycerol monolaurate, GML)，又名十二酸单甘酯，主要从椰子油等天然植物提取，是一种中链脂肪酸酯[12]，GML安全性非常高且廉价，常用为食品添加剂。已有研究发现，GML饲喂对提高川藏黑猪(Susscrofadomesticus)、肉鸡等禽畜生长性能、消化能力和肌肉营养品质具有积极的作用[13-14]。此外，GML具有优良的乳化性，可以促进脂肪的消化吸收，进而促进肌肉脂肪酸含量的增加[15-16]。在水产动物中，GML能促进花鲈(Lateolabraxmaculatus)[17]、中华鳖(Pelodiscussinensis)[18]、大黄鱼(Larimichthyscrocea)[19]等的营养吸收，增加生长速度，调控肠道健康，而其对鱼类肝脏功能的影响尚未见报道。
本研究以尖吻鲈为实验对象，分析GML对其脏器系数、脂质代谢与消化酶活性以及肝脏组织形态、抗氧化酶活性和血清生化指标的影响，以期为GML在促进鱼类脂质代谢和肝脏代谢性疾病防治中的应用提供实验依据和数据参考。
1.1 饲料制备
实验用GML获赠于广东省脂类科学与应用工程技术研究中心。基础饲料为市售鲈鱼配合饲料(珠海海龙生物饲料有限公司)。将GML溶于乙醇溶液和蒸馏水配置成母液，按每公斤饲料0 g、1 g、2 g和4 g的GML设为4个梯度，高压喷壶均匀喷涂于饲料表面，经自然风干后，4℃冰箱中冷藏备用。
实验用尖吻鲈体质量(442.727±54.423)g、体长(28.438±1.493)cm，购自广东省珠海市某养殖场，共计200尾，水车运输至珠海德洋水产养殖有限公司养殖基地，于室内水泥池(4 m×2.5 m×1 m)暂养，暂养密度为20 尾·m-3。稳定1周后，选取192尾体表无损伤、规格均匀尖吻鲈随机分到16个水泥池(2 m×1.5 m×1 m)中。按0 g·kg-1(G0组、对照组)、1 g·kg-1(G1组)、2 g·kg-1(G2组)和4 g·kg-1(G4组)设置4个试验组，每组4个重复，每个重复12尾鱼，分别投喂对应饲料。养殖实验进行8周，每日8∶00和17∶00各饱食投喂一次，上午投喂前池底吸污一次，日换水20%。暂养和养殖期间水温(28.00±0.22)℃，pH 7.8～8.2，溶解氧≥7.0 mg·L-1，盐度1.0～1.5，自然光周期。
1.3 样品采集
经饲喂8周后取样，取样前停喂24 h，每个重复取1尾鱼，合计每个处理组4尾鱼。样品鱼经200 mg·L-1MS-222浸泡麻醉后，测量鱼体长、体质量，再经1.5 mL无菌注射器尾静脉取血，3 000 r·min-1离心10 min后收集血清，4℃保存，用于血清生化指标分析，此后，于冰盘上剖离内脏团与沉积脂肪进行称重，取部分肝脏组织用于组织形态学分析，取剩余部分肝脏和肠道组织置于2 mL离心管中，液氮速冻过夜后-80 ℃保存，用于相关酶学检测。
1.4 指标测定及方法
1.4.1 脏器系数
根据以下公式计算肝体比(hepatosomatic index, HSI)、脏体比(viscerosomatic index, VSI)、肥满度(condition factor, CF)和腹脂率(intraperitoneal fat ratio, IPF)。
HSI(%)=Wh/W×100%
VSI(%)=Wv/W×100%
CF(%)=W/L3×100%
IPF(%)=Wi/W×100%
式(1)～式(4)中，W为鱼体总质量(g)；
Wi为腹脂质量(g)；
Wh为肝脏质量(g)；
Wv为鱼内脏团质量(g)；
L为体长(cm)。
1.4.2 肝脏组织切片制备及观察
肝脏组织切片的制作及测定参照区又君等[20]的方法进行：取1/3新鲜肝脏，用0.86%的生理盐水冲洗干净后，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上。逐级脱水之后，按次序进行透明、石蜡包埋、切片(厚度为5 μm)、HE染色、脱水、透明、中性树脂等步骤。显微镜观察肝脏切片，并进行拍照。每个试验组随机选取5张400倍镜下的组织切片，每张随机选取5个视野通过图像统计软件Image-Pro Plus 6.0 统计肝细胞面积、密度和直径。
1.4.3 肝脏抗氧化酶、脂质代谢酶和肠道消化酶活性测定
酶学指标均采用南京建成生物工程研究所相关试剂盒测定。分别称取肝脏和肠道组织样品0.08～0.10 g，按照质量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例加入预冷好的0.85%生理盐水，冰浴匀浆，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行活性测定。其中，肝脏抗氧化酶测定总抗氧化能力(T-AOC)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)活性，脂质代谢酶测定肝脏中脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HL)和总脂酶(LPL+HL)活性，肠道消化酶测量淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)和蛋白酶(PRS)活性。
1.4.4 血清生化指标测定
血清生化指标分析血清中总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLB)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等指标。按照深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司商业试剂盒(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，中国)检测方法，全自动生化分析仪(BS200)检测。
1.5 数据统计与分析
数据以平均值±标准差(mean ± SD)表示，运用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。数据间若存有显著性差异，则采用Duncan’s法进行组间多重比较，显著性水平设置为P<0.05。
2.1 饲料中添加GML对尖吻鲈脏器系数的影响
与对照组相比，添加GML组尖吻鲈VSI、HSI、CF、IPF均有所下降，且随着添加量的增加呈现先降低后升高的趋势，其中G2组VSI、HSI、IPF均显著低于对照组(P<0.05)(表1)。
表1 饲料中添加GML对尖吻鲈脏器系数的影响
2.2 饲料中添加GML对尖吻鲈肝脏组织学形态的影响
与对照组肝细胞相比，各试验组肝细胞面积分别降低了10.70%、68.35%、60.13%，肝细胞直径分别降低了27.60%、38.22%、6.91%，而肝细胞密度(单位面积内的细胞数)则相反，分别增加了3.10%、13.92%、0.79%(P<0.05)(表2)。肝脏组织学观察发现(图1)，各处理组肝细胞内均有不同程度空泡化现象。对照组中细胞核发生明显偏移，呈现出较多细胞透明空泡化的现象。添加GML组肝细胞虽仍存在空泡化现象，但空泡化现象得到缓解，其中G2组改善效果最为明显。
表2 饲料中添加GML对尖吻鲈肝细胞密度、面积和直径的影响
图1 饲料中添加GML对尖吻鲈肝脏组织结构的影响(HE，×400)
2.3 GML对尖吻鲈肝脏抗氧化能力的影响
拌喂GML后，各试验组肝脏中CAT、SOD的活性及GSH含量和T-AOC较对照组均有显著上升(P<0.05)(图2)，其中G2组最高，且随着GML添加量的增加，呈先增加后下降的趋势；
相反的，对照组MDA浓度显著高于试验组(P<0.05)，随着GML添加剂量的提升MDA逐渐降低，但各试验组间无显著性差异(P>0.05)。
2.4 GML对尖吻鲈肠道消化酶活性的影响
肠道消化酶活性结果如图3所示，与对照组相比，各试验组肠道AMS、LPS和PRS活性均呈上升趋势，其中G2组显著高于其他组(P<0.05)。
图3 饲料中添加GML对尖吻鲈肠道消化酶活性的影响
2.5 GML对尖吻鲈肝脏脂质代谢酶活性的影响
肝脏脂质代谢酶活性结果如图4所示，饲料中添加GML后，尖吻鲈肝脏中LPL、HL和LPL+HL活性均显著高于对照组(P<0.05)，其中G2组最高，且随着GML添加量的增加，呈先增加后下降的趋势。
图4 饲料中添加GML对尖吻鲈脂质代谢酶活性的影响
2.6 GML对尖吻鲈血清生化指标的影响
如表3所示，对照组血清中TP、GLB、TG、TC、和LDL-C含量显著高于试验组(P<0.05)，ALT活性则相反，而ALB、AST活性各处理组无显著性差异。各试验组间，G2组HDL-C显著高于其他组(P<0.05)，其他组别差异不显著。
表3 饲料中添加GML对尖吻鲈血清生化指标的影响
研究发现，鱼类脂质代谢过程会受到多方面因素的影响，如养殖条件、养殖模式和饲料营养水平等[23]。近几年尖吻鲈高密度集约化养殖常发生代谢性疾病，养殖鱼类脂质代谢过程受阻造成脂肪过度累积，进而影响肝脏健康。而研究表明，通过拌喂中短链脂肪酸可以调节机体脂质代谢机能，且在畜禽养殖中已有相关报道[10,14,21-22]。本研究发现，与对照组相比，饲料中添加不同水平的GML可以显著降低鱼体VSI、HSI、IPF比率。脏器系数是反映机体脏器湿重与单位体质量的比值，其数值变化从侧面反映了脏器内脂肪含量的变化，因此VSI、HSI、IPF数值的减少有利于缓解鱼体内脂肪堆积，改善鱼体健康。已有研究也有类似结果，如拌喂GML可降低蛋鸡、肉鸡和真鲷(Pagrusmajor)中VSI、CF的比率，减少体内过剩的脂肪沉积[21,24-25]。
肝脏脂肪变性与沉积极易造成肝损伤与炎症[4]。肝细胞会因细胞内脂肪滴存在，导致细胞核发生偏移，进而造成肝细胞肿胀，因此呈现出较多细胞透明空泡化的现象。肝脏组织形态学分析显示，拌喂GML组中空泡化现象较对照组有明显缓解。结合肝脏的脂质代谢酶活性分析及血清肝功能相关指标变化亦可表明，拌喂GML可改善肝脏功能。本研究表明，试验组肝脏脂质代谢酶包括HL、LPL、HL+LPL活性均显著高于对照组，血清中TG、TC、LDL-C低于对照组。普遍认为，血清中TC和TG是机体储存能量的主要形式，是反映机体脂质代谢水平的重要指标[26]。而LPS可以催化TG的水解，改善机体脂质沉积[27]。LDL-C和HDL-C是肝脏中TC转运到其他组织的载体，其含量的变化可以反映机体脂质代谢状况[28]。脂肪酸合成酶(FAS)是机体脂肪酸生物合成的关键酶，是催化脂肪合成的最后一步，而LPL和HL可以分解TG，并水解为甘油及游离脂肪酸(FFA)，从肠道进入肝脏后，无需肉碱棕榈酰基转移酶转运便可直接进入细胞线粒体进行β-氧化，进而为机体提供能量[27]。因此LPL是TG分解FFA和甘油的限速酶，当LPL活性升高时机体内TG的含量会相应的减少，而相应的试验组中血清TG较对照组含量显著减少。这些结果与对黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[28]和小鼠(Musmusculus)[29]的研究结果一致。研究表明，黄颡鱼饲料中添加富含GML的黑水虻(Hermetiaillucens)油脂后，肝脏中LPL mRNA的相对表达量呈现先升后降的趋势，小鼠高脂饲料中添加GML显著降低了血清中TG和TC的含量。这些结果都证明了GML作为一种新型生长促进剂提高饲料水平的潜力。原因可能是GML的添加可以有效地影响肝脏中中链脂肪酸的合成和代谢，导致肝脏中过氧化物酶体增殖剂激活受体(pparγ)和3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶(hmgcr)的基因表达水平显著降低[30-31]。同时SHINOHARA等[32]发现，中链脂肪酸也可以通过促进长链脂肪酸的内源性氧化，调节肝脏脂质代谢，抑制肥胖。综合各研究表明，饲料中添加GML可以有效地促进脂肪酸氧化、调节TG平衡、缓解尖吻鲈肝细胞空泡化、抑制脂肪的堆积。GML可以显著改善机体脂质沉积，缓解肝脏损伤，但是具体的调节机制仍未完全明确，有待进一步研究分析。
血清肝功能水平和肝脏抗氧化能力均反应了鱼体肝脏健康状况[33]。本实验结果显示，试验组血清内ALT活性显著高于对照组，GLB含量变化则与之相反，而AST活性在各组之间无显著性差异。ALT和AST是肝脏中重要的氨基转移酶，当肝脏受到损伤时，其会渗透入血液中，所以其活性的变化反映了机体的肝脏健康状况[34]。GLB则是反映机体免疫水平高低的代表性指标之一[35]。研究发现，拌喂GML 8周后，相对于对照组，G2组尖吻鲈肝脏的T-AOC、SOD、CAT的活性和GSH含量显著提高，且MDA浓度明显降低。T-AOC、SOD、CAT、MDA、GSH是抗氧化体系中酶体系的主要组成成分，其中SOD、CAT、GSH可以通过清除机体内的自由基，保护重要的细胞大分子和细胞器免受氧化损伤的影响，维持鱼体正常的新陈代谢过程。MDA作为过氧化脂质经过降解之后的产物，对细胞的组织有一定的损害作用，其含量的变化反映了机体的细胞损伤程度[36]。实验结果表明，GML有改善肝脏损伤，提高抗氧化能力的作用。这一结果与孙彩云等[17]和刘梦芸等[21]的结果类似，说明GML可以有效地缓解鱼体应激状态，减少肝组织损伤，提高尖吻鲈的抗炎能力。
除此之外，中链脂肪酸还可以改善鱼体的消化能力[37]。最新研究表明，饲料中添加GML可以显著提高斑马鱼肠道中LPS、AMS的活性，同时也有报道GML对肉鸡的肠道健康有益，有利于其从日粮中吸收能量和营养[37-39]。在本研究中，拌喂2 g·kg-1GML可显著提高尖吻鲈肠道中AMS、LPS和PRS的活性，与上述结果相符。此外，在对大西洋鲑(Salmosalar)[40]、猪[41]和大鼠(Rattusnorvegicus)[42]等的研究报道发现，当饲料中添加中链脂肪酸和相应的甘油时，也会使其消化率和营养利用率提高。原因可能与中链脂肪酸被吸收后会刺激胆囊收缩素的产生有关，而胆囊收缩素正是位于胃肠组织中能够引起脂肪酶和蛋白酶分泌的一种多肽激素[37]。GML作为中链脂肪酸单甘油酯，可以在酯键的保护下深入到胃肠内部[43]，使得GML能有效促进鱼体肠道的消化功能。
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