‘新番72号’加工番茄定点突变的耐贮性初步探讨
时间：2023-02-27 18:20:09 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
张西英，刘江娜，李荣霞,薛丽萍，白云凤，张爱萍
(新疆生产建设兵团 第六师农业科学研究所，新疆五家渠 831300)
新疆是中国主要的加工番茄种植基地，其机械采收已达到70%以上。由于番茄果实易过熟软化，致使耐压性能变差、抗病原菌能力降低，已严重影响到生产、贮运及加工品质[1]。培育抗软化、耐贮运的番茄新品种对新疆加工番茄的种植及加工产业的发展具有重要意义。
利用常规育种方法改良番茄品种周期长，易受不良基因连锁和种间生殖隔离的限制[2]。近年来，以多种新型高效的DNA靶向内切酶为基础建立的基因组编辑技术(Voytas，2013)，可以在不同物种中对目标基因进行定点敲除、单核苷酸或多核苷酸片段置换、添加等靶向修饰，不必通过导入反义基因或RNAi基因抑制靶基因功能[3-6]。在各种基因编辑技术中，CRISPR/Cas9技术操作较为简单、高效，应用更为广泛[7-10]，CRISPR-Cas9系统对目标基因进行精确的原位编辑后，不必再通过转基因调控目标基因功能，而由于sgRNA-Cas9基因的整合位点和编辑位点是分离的，因此可通过自交分离剔除sgRNA-Cas9基因，获得无转基因序列的新种质，比常规转基因技术安全可靠。基因编辑修饰的基因只有少数核苷酸改变，与自然突变或人工理化诱变本质相同，而在效率和可控性方面则远远优于诱变育种[11]。
番茄基因组较小，已完成了全基因组精细序列分析，为通过全基因组层面扫描、筛选出高特异性 sgRNA 以规避脱靶效应提供了可靠的基因组序列和遗传背景，且遗传转化体系也已成熟。迄今利用CRISPR-Cas9系统改良番茄农艺性状的报道较少。番茄是二倍体自花授粉作物，利用CRISPR-Cas9系统原位定点修饰乙烯代谢相关基因以迟滞番茄过熟腐烂，并通过自交分离剔除外源DNA序列，获得无转基因序列的耐贮运新种质，为加工番茄新品种培育和功能基因研究提供技术支撑，也将为利用CRISPR-Cas9系统改良番茄其他农艺性状做出有益探索。
1.1 材 料
番茄品种为‘新番72号’，由新疆生产建设兵团第六师农科所番茄课题组选育提供。母本‘A-10’ 是从‘里格尔87-5’中筛选出综合抗性好的株系，经过8代自交提纯得到的稳定材料，属早熟加工番茄品种；
父本‘MG-01’是从国外引进的加工番茄材料‘JQ-23’，经7代分离、纯化得到的稳定、早熟品系，以番茄的下胚轴和子叶为外植体，农杆菌介导转化。
1.2 方 法
番茄为呼吸跃变型果实，伴随呼吸跃变产生大量乙烯，即系统Ⅱ乙烯，易使番茄果实过熟，腐烂变质。1-氨基环丙烷1-羧酸ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylicacid)是合成乙烯的直接前体，ACC合酶ACS(ACCsynthase)是乙烯合成的限速酶，由多基因家族编码，SlACS1和SlACS6等主导系统I乙烯的合成，SlACS2和SlACS4主导系统Ⅱ乙烯的合成。利用多种信息学工具从SlACS2基因上游的编码区筛选出高特异性sgRNA，通过CRISPR-Cas9基因组编辑系统仅对SlACS2基因进行定点突变，调控系统Ⅱ乙烯过量表达，而不影响SlACS家族其他基因序列，以保证番茄正常生长发育，又适度抑制系统Ⅱ乙烯的生成，以期迟滞番茄过熟腐烂。
1.2.1 SlACS2sgRNA的设计和选择 克隆待改良加工番茄品种‘新番72号’等的SlACS2基因cDNA，以此作query进行BLAST，确定SlACS2的基因组结构以及外显子所在染色体位置，规避设计的sgRNA被内含子相隔而成为无效sgRNA。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则，利用CRISPRdirect筛选SlACS2第1、2外显子区域的sgRNA序列，sgRNA的结构设定为5′-(N)20NGG-3′，N为任意核苷酸。利用CRISPR-P验证sgRNA的靶向特异性，筛选出靶向特异性好的sgRNA。
1.2.2 突变株的获得和突变类型的研究 以番茄的下胚轴和子叶为外植体，农杆菌介导转化，抗性筛选和分子检测获得T0代转基因阳性植株，然后筛选获得T0代突变植株自交结实后得到的T1代种子，将T1代种子播种成苗后提取叶片基因组DNA特异性引物检测，确定突变类型，并筛选纯合突变植株。
2.1 基于RNA-seq的 SlACS2数字表达谱
以番茄功能基因组数据库网站(http://ted.Bti.ornell.edu/cgi-bin/)中 RNA-seq data 的数据作基础，建立SlACS2基因的基于 RNA-seq 的数字表达谱(图1)。
1.子房;2.半绿果实;3.成熟绿果实;4.破色期果实;5.成熟红果实;6.0～3 mm花蕾;7.3～8 mm花蕾;8.8 mm开花前花蕾;9.完全展开花;10.发育阶段花的混合物;11.野生番茄花粉;12.感染假单胞菌叶片;13.假单胞菌叶片;14.混合诱导叶片;15.4～6周龄植株的顶端分生组织;16.8周龄植株顶端分生组织;17.花前根;18.挂果期根;19.营养匮乏的根;20.完全吸涨5 d后的胚根;21.完全吸涨7 d后的幼苗;22.休眠种子;23.愈伤组织；
PRKM.每百万reads中来自于特定基因每千碱基长度的reads数
结果显示：SlACS2在番茄的子房、愈伤组织中有低水平表达，在破色期果实、成熟的红果实中有较高水平的表达。证实了SlACS2是与果实成熟相关的基因，利用CRISPR-Cas9技术对该基因进行原位编辑，可能会减缓番茄内源乙烯的产生，迟滞番茄过熟，提高储运品质。
2.2 同源克隆新疆番茄 ACS2基因
以 cDNA 为模板，在 NCBI 上对序列进行查找和分析，设计引物，如表1所示，进行ACS2基因序列的扩增。
表1 目的基因扩增引物
扩增后对目的基因进行回收与纯化。先对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下含有目的片段的凝胶，用 DNA 凝胶回收盒回收测序。利用DNAman进行序列比对，克隆基因与NM_001247249.2完全一致，见图2。同时，新疆番茄acs2基因的cds及编辑位点见图3。
图2 DNAman序列比对结果
图3 新疆番茄 acs2基因的cds及编辑位点
2.3 SlACS2染色体定位和基因组结构
以SlACS2的cds作query，对NCBI番茄基因组数据库进行Blast，结果表明，由图4可知，SlACSgDNA位于番茄的1号染色体(GenBankAccession:NC_015438.2)，位置在 884 560 11～884 534 90 nt之间，长度2 522 nt，由4个外显子、3个内含子组成，前3个外显子较短，位于SlACS2的5′端，可在每个外显子区域设计sgRNA，规避sgRNA分布在外显子和内含子连接处。
图4 SlACS2染色体定位和基因组结构
2.4 sgRNA的设计和选择
根据CRISPR-Cas9靶点设计原则，利用CRISPRdirect(https://crispr.dbcls.jp/)筛选SlACS2外显子区域的sgRNA序列，即3′端有PAM元件的20个连续的碱基序列，PAM元件设定为NGG，sgRNA的结构为5′-(N)20NGG-3′，N为任意核苷酸。利用CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)对sgRNA的靶向特异性进行综合评分，由表2、3可知，综合得分在 29～49。
根据CRISPRdirect在线分析，由表2可见，在第1外显子的sgRNA中，有9条含有连续的TTTT序列，可排除。sgRNA1-2的GC含量低，sgRNA1-7在5号染色体上也有完全匹配的序列，易产生脱靶效应。在剩余7条sgRNA中，位于外显子132～154 nt的sgRNA1-14特异性最好，该sgRNA和它包含的对特异性起重要作用的、邻近PAM的12 nt种子序列在番茄基因组上都是唯一序列，没有与之完全匹配的序列。sgRNA1-14的GC含量较高，靶向特异性综合得分也较高，可为优选sgRNA。由表3可见，第2外显子有9条sgRNA序列，其GC含量均低于35%，临近PAM12nt的种子序列的脱靶位点在2个以上，没有合适的sgRNA可以选择。
表2 SIACS2基因第1外显子含有的sgRNAs
表3 SIACS2基因第2外显子含有的sgRNAs
2.5 番茄遗传转化体系的建立
对加工番茄‘新番72号’的种子消毒处理后置于1/2培养基上发芽，获得无菌苗。通过苗龄、外植体对番茄愈伤组织及不定芽诱导的影响和不同激素浓度配比对愈伤组织和芽分化诱导的影响，最终筛选建立了无菌苗快繁再生体系(图5)。
图5 番茄无菌苗
通过对农杆菌浓度、侵染时间、共培养时间等方面对番茄遗传转化率的影响进行研究，筛选出适宜的转化条件。最终通过多次筛选试验，确定了农杆菌OD600为0.6～0.8为宜，以0.7最佳，预培养2 d，侵染时间为15 min，侵染后暗培养一夜的最佳转化条件(图6)。
图6 番茄遗传转化再生植株
将与农杆菌共侵染后的愈伤组织分别放入含有 Kan的筛选培养基中进行初步筛选培养，在筛选过程中，首先用20 mg/L Kan的筛选培养基上培养15 d后，转接至40 mg/L Kan筛选培养基上培养20 d，最终在60 mg/L Kan筛选培养基上培养，这样即能保证转化的愈伤组织正常分化，分化出的抗性不定芽生长正常，也可减少逃逸芽的产生(图7)。
图7 抗性筛选
2.6 Cas9转基因番茄再生植株的PCR检测及编辑植株分子鉴定
以质粒pSlACS2-DsgRNA为阳性对照，以野生型加工番茄‘新番72号’为阴性对照，利用CTAB法提取T0代植株的DNA，通过表4中的筛选引物，对获得的21个抗性再生植株以Cas9特异引物进行PCR扩增检测是否将CAS9系统成功转入，其中7株扩增出了大小为 841 bp 的目的条带，与阳性对照一致，未转化的野生植株未扩增出目的条带，见图8，初步表明基因已经整合到转化受体基因组中。PCR 扩增体系为：基因组 DNA 1 μL，PremixTaqDNA 聚合酶 Mix 10 μL，前后引物各 0.8 μL，加双蒸水至 20 μL；
PCR 扩增条件分别为：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 30 s；
58 ℃ 30 s；
72 ℃ 30 s；
35 个循环；
72 ℃ 5 min，PCR 产物的大小通过 1.0%的琼脂糖凝胶电泳得到。
M.DL2000 DNA Marker; +.阳性质粒; WT(-).阴性对照; 1～4.转基因抗性植株
表4 筛选PCR引物
2.7 SlACS2基因编辑植株的初步分子鉴定
将收获的T0代突变株自交结实的T1代种子播种于大田中，提取温室内T1代植株DNA，利用表5中的特异引物进行PCR扩增，使用靶位点特异引物进行PCR扩增、测序及比对分析，确定编辑突变体的突变类型，并筛选纯合突变单株。目前试验共完成394份植株的测序工作，从中筛选出无T-DNA的突变株6个，根据测序结果明确了不同植株的突变类型，对测序结果进行归纳总结，其中357个植株发生突变，突变率为 90.6%，纯合突变率为36.8%。
表5 筛选PCR引物
通过调查得到种子萌发率、苗期生长情况及采摘期果实发育情况等相关指标，初步明确不同突变类型会对加工番茄生长和果实发育产生影响，同一突变类型表现型也不尽相同。由图9可见，以SgRNA2处缺失7个碱基的突变类型为例，在统计过程中发现，株型多数发育不正常，表现为株型小叶片卷曲，果实发育也不正常，果型小多为裂果，但也有少数植株生长发育正常，果型正常结果多、成熟好。
图9 SgRNA2处缺失7个碱基
果实过熟导致软化腐烂是影响新疆加工番茄种植贮运及加工品质的重要限制因素。而常规杂交育种改良周期长，可利用的种质资源有限；
理化诱变难以控制突变方向，突变位点鉴定困难；
常规基因工程易使民众产生安全性疑虑等诸多限制因素[12-14]。通过CRISPR-Cas9这一新型基因组定点编辑系统用于番茄耐贮性能改良，通过对SlACS2基因特定位点进行精准修饰，同时不影响SlACS基因其他家族基因序列，迟滞果实过熟软化，提高耐贮运性能，从根本上解决加工番茄贮藏时间短、不耐运输、严重影响加工品质等诸多问题；
利用Cas9基因整合位点和编辑位点相互独立的特点，通过遗传分离，剔出T-DNA序列，获得无转基因组分的耐贮运新种质。这一技术较杂交育种周期短，较诱变育种定向性好，较常规基因工程安全性高，将为加工番茄的遗传改良建立一个高效安全的技术体系。
番茄是植物学研究的经典模式系统之一，已经完成了全基因组精细序列分析，通过突变体揭示基因功能成为重要研究内容[15-18]。建立加工番茄有效的基因敲除技术体系，可促进其基因功能的研究发展，完善加工番茄CRISPR-Cas9基因编辑系统将为加工番茄基因功能研究、改良其他农艺性状、培育新品种提供新的平台和技术支撑，具有较大的应用前景。
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