反硝化聚磷菌定向富集筛选及代谢特征研究*

李 微 王 贺 侯云鹤 王宇琦 陈一鸣 高 原

(1.沈阳建筑大学市政与环境工程学院,辽宁 沈阳 110168;2.沈阳后勤集团房地产开发有限公司,辽宁 沈阳 110117)

尽管对于反硝化除磷工艺参数及DPAO的研究已有相关报道,但反硝化除磷系统的启动时效及稳定运行状态、优势菌群及高效菌种代谢过程对推动反硝化除磷技术的应用具有决定性影响,仍然是研究热点[3]。本研究以活性污泥为基质,通过A2-序列间歇式活性污泥法(SBR)反硝化除磷脱氮系统(简称A2-SBR)富集并筛选高效的DPAO,采用高通量测序技术探究DPAO驯化过程中微生物种群特性及优势菌群结构变化,分析菌株生理生化及反硝化除磷性能,利用16S rDNA分子生物学技术对高效菌种进行鉴定,考察反应过程中胞内聚合物浓度变化,分析高效菌株代谢特征,以期为反硝化除磷技术实际应用提供理论依据。

1.1 试验装置

A2-SBR装置由双层有机玻璃制成,内径14 cm、高85 cm,有效工作容积为12 L,外层与水浴锅相连,使系统处于最适温度。装置底部装有微孔曝气盘,连接空气泵对活性污泥进行曝气,顶部安装电动搅拌器使污泥处于悬浮状态充分进行反应,通过蠕动泵向装置投加KNO3溶液控制缺氧反应条件。整个系统通过在线的pH监测仪控制pH,超出设定pH范围时pH监测仪自动通过蠕动泵向装置内滴加酸碱缓冲溶液直至pH达到设定范围。

反硝化除磷静态试验装置为有效容积3 L的广口瓶,通入N2控制厌氧环境,通过蠕动泵投加30 mg/L KNO3溶液作为电子受体控制缺氧反应条件进行反硝化除磷静态试验。

1.2 试验材料

污泥取自辽宁省抚顺市某污水处理厂的二沉池,试验用水采用人工配制的模拟生活污水,水质情况如下：以CH3COONa作为碳源,控制COD为160～220 mg/L;以KH2PO4作为磷源,控制总磷(TP)为9～12 mg/L;以NH4Cl作为氮源,控制氨氮为5～10 mg/L;添加MgSO4·7H2O、CaCl2及微量元素;用NaHCO3调节pH为7.2～7.8。

微量元素：FeCl31.5 g/L、H3BO30.15 g/L、CoCl3·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.03 g/L、MnCl2·4H2O 0.06 g/L、Na2MoO4·4H2O 0.06 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、KI 0.18 g/L、乙二胺四乙酸10 g/L。

反硝化培养基：Na3C6H5O7·2H2O 5 g/L、KNO31 g/L、KH2PO4·2H2O 1 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、琼脂15 g/L、pH为7.2～7.4。

聚磷培养基：CH3COONa·3H2O 3.68 g/L、Na2HPO4·2H2O 28.73 mg/L、NH4Cl 57.27 mg/L、MgSO4·7H2O 131.82 mg/L、K2SO426.71 mg/L、CaCl2·2H2O 17.2 mg/L、琼脂15 g/L、微量元素2 mL/L、pH=7.0。

采用A2-SBR稳定运行阶段的反硝化聚磷污泥为种泥。

1.3 试验方法

1.3.1 A2-SBR的运行方案

A2-SBR中,种泥与模拟生活污水混合(混合液悬浮固体质量浓度(MLSS)为3 200 mg/L),运行期间24 ℃、pH为7.2～7.8、污泥龄(SRT)为15 d。运行方案分为3个阶段：(1)第1阶段(第1～15天),瞬时进水→厌氧段2 h→好氧段2 h→沉淀30 min→排水30 min,每天运行3个周期,此阶段目的在于对系统中的传统好氧聚磷菌进行富集;(2)第2阶段(第16～35天)采用厌氧/缺氧交替的方式运行,在缺氧段投加35 mg/L KNO3溶液作为电子受体进行DPAO的富集,运行模式为瞬时进水→厌氧段2 h→缺氧段2 h→沉淀30 min→排水30 min,每天运行3个周期;(3)第3阶段(第36～50天)与第2阶段运行模式相同,进一步确保DPAO的优势菌地位,实现系统高效的运行稳定性。

每天取进水、厌氧出水、好氧/缺氧出水的3个平行样,监测COD、TP、硝酸盐氮。

1.3.2 污泥染色试验

于稳定运行的A2-SBR厌氧、缺氧段取污泥样品,分别进行PHB、poly-P颗粒染色,步骤参照文献[4],考察厌氧结束后PHB积累和缺氧结束后poly-P积累的情况。

1.3.3 菌株的分离、筛选与鉴定

利用反硝化、聚磷培养基,采用稀释涂布法和平板划线分离法对DPAO进行初步分离和纯化[5]。再对分离出来的纯菌株进行释磷吸磷试验,通过硝酸盐还原产气试验筛选得到具有高效反硝化除磷脱氮功能的菌株。

对上述菌株进行革兰氏染色后在光学显微镜下观察其形态及颜色。进一步对其进行生理生化特性试验,包括接触酶、氧化酶、葡萄糖氧化发酵、糖醇发酵、甲基红、V-P、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用、明胶液化、吲哚试验。

使用TaKaRa试剂盒将菌株的基因组脱氧核糖核酸(DNA)纯化并提取,然后以总DNA为模板利用引物27F和1492R进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。PCR采用50 μL反应体系,反应条件：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,30个循环;72 ℃补充延伸5 min;4 ℃终止保存。扩增产物用1%(质量分数)琼脂糖凝胶进行电泳检验后进行16S rDNA测序。所得测序结果在GenBank数据库中进行BLAST序列的同源性比较,然后构建系统发育树[6]。

1.3.4 反硝化除磷脱氮代谢特征试验

在无菌条件下将菌株活化并富集,将富集好的菌液离心(4 000 r/min,10 min)后,去除上清液,用无菌蒸馏水洗涤后再离心,重复清洗操作3次。将菌液投入反硝化除磷静态试验装置(反应液为模拟生活污水),控制反应液的600 nm处吸光度为0.3。运行方案与第2阶段相同,在厌氧段向装置中通入N2控制厌氧条件使释磷反应充分进行,在缺氧段投入一定量的KNO3溶液作为电子受体进行反硝化除磷脱氮反应,定时取样测定上清液中COD、硝酸盐氮、TP、PHB、poly-P及糖原的浓度变化。

1.4 检测方法

PHB采用气相色谱法测量,将20 mL菌液冷冻干燥后倒入试管中,分别加入1 mg苯甲酸、1.5 mL盐酸正丙醇溶液(25%(质量分数)盐酸)、1.5 mL氯仿,于100 ℃沸水浴中进行酯化反应2 h,待样品冷却后加入无菌蒸馏水至5 mL后离心,取有机相下层溶液进行气相色谱分析[7]。COD采用快速密闭催化消解法测定;TP采用钼锑抗分光光度法测定;硝酸盐氮采用紫外分光光度法测定;糖原采用硫酸-蒽酮法测定;poly-P采用过硫酸钾-钼锑抗分光光度法测定;MLSS采用滤纸称重法测定[8]。pH采用PHS-25型pH计检测。

高通量测序：取不同阶段的活性污泥反复清洗离心3次后置于-80 ℃中保存。采用十六烷基三甲基溴化铵法提取样本基因组,利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度。取出适量的样本DNA放入离心管中,利用无菌蒸馏水将样本DNA稀释至1 ng/μL,以稀释后的基因组DNA为模板,采用引物341F与806R对16S rDNA V3～V4区序列进行扩增,用New England Biolabs公司的Phusion8 High-Fideity PCR MaterMix with GC Buffer和高效高保真酶进行PCR,确保扩增效率和准确性。PCR扩增后的产物用2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测,得到PCR扩增凝胶电泳图。使用TuSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库,经过Qubit和定量PCR,待构建好的文库合格后使用NovaSeq 6000进行上机测序[9]。

2.1 DPAO定向富集及系统运行

系统中污泥驯化及稳定运行阶段COD去除效果见图1(a)。1～15 d系统进行厌氧/好氧反应,污泥驯化1～3 d,进水COD平均为217.94 mg/L,厌氧、缺氧出水COD平均为97.09、62.70 mg/L;系统驯化第8～11天,厌氧出水COD平均为66.41 mg/L,进水中碳源量远超出聚磷菌新陈代谢所需的碳源量,厌氧结束剩余外碳源进入好氧段会被其他异养菌消耗,COD去除效果不会受到影响,COD去除率曲线仍然呈上升趋势;第12天后,降低进水外碳源量,进水COD平均为180.06 mg/L,厌氧反应结束剩余外碳源含量降低,有利于聚磷菌缺氧反硝化吸磷反应,COD去除效果逐渐稳定,反应结束好氧出水COD平均为22.27 mg/L,COD平均去除率为87.75%。第16～35天的厌氧/缺氧反应,COD去除率无明显波动,COD平均去除率为87.47%。随后系统继续在厌氧/缺氧条件下稳定运行至第50天,COD平均去除率为89.16%。由此可见,系统不同运行模式对COD去除无明显影响,活性污泥的生物降解性能良好。

图1 COD、TP和硝酸盐氮去除效果Fig.1 Removal of COD,TP and nitrate nitrogen

在厌氧/好氧条件下对系统中污泥进行活化使其具有高效的好氧除磷能力,为后续DPAO富集做好准备。污泥驯化及系统稳定运行过程中TP的变化见图1(b)。污泥驯化初期,磷的去除效果并不明显,富集第2天由于自动控制系统(PLC)故障,厌氧段电动搅拌器没有启动,泥水混合不够均匀,导致聚磷菌厌氧释磷反应不充分,释磷量最低仅为4.77 mg/L,自PLC调整后污泥释磷效果有一定增强,TP去除率先逐渐上升后又趋于平缓,这与进水中碳源量远超出聚磷菌新陈代谢所需的碳源量,厌氧结束剩余外碳源进入缺氧段也会被其他异养菌所利用,进而影响到聚磷菌优势菌群地位的研究结果相一致;富集进行到第12～15天,厌氧释磷量和缺氧吸磷量均有明显提高,TP去除率呈阶梯状上升且除磷效果稳定,系统内最大释磷量达到29.74 mg/L,吸磷率由44.92%提高至97.09%,好氧出水TP平均为0.33 mg/L,达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)一级A标准(≤0.5 mg/L),此时系统具有稳定除磷效果,聚磷菌已成为系统内优势菌种。在1～15 d污泥驯化过程中,污泥絮体量增加且颜色呈黄褐色,此时认定传统聚磷菌富集成功,可进行DPAO富集阶段。第16天开始厌氧/缺氧模式,由于高浓度硝酸盐溶液的冲击,TP去除率骤然降低至62.05%。第16～22天系统TP去除率略微上升,平均去除率为64.38%。

缺氧出水硝酸盐氮变化趋势与TP不一致,16～19 d硝酸盐氮去除率相对较低,20～22 d明显提升(见图1(c)),分析认为：厌氧/缺氧反应开始时系统中DPAO数量较少,仍然有常规反硝化菌利用硝酸盐氮进行反硝化反应。随着系统连续运行,污泥慢慢适应高浓度硝酸盐氮,23～50 d脱氮除磷效果先持续提高后长期保持稳定状态,第23天缺氧出水TP和硝酸盐氮去除率分别稳定在95%、91%左右,由此可推测系统脱氮除磷除活性污泥吸附和同化型氮、磷物质吸收转化为细胞物质贡献少量去除率,主要发生聚磷菌的反硝化吸磷反应,可确认第23天DPAO富集成功且处理效果稳定,A2-SBR启动成功。

PHB和poly-P颗粒染色结果见图2。厌氧活性污泥中明显可见PHB颗粒,PHB在聚磷菌细胞质内属于类脂性质的碳源类贮藏物,PHB好氧分解产生质子移动力,进而吸收磷酸盐合成poly-P和三磷酸腺苷(ATP)。缺氧段发生了poly-P积累,证明发生了缺氧吸磷反应,进一步确定A2-SBR内有大量反硝化聚磷菌。

图2 PHB和poly-P颗粒染色Fig.2 Stained PHB and poly-P particles

2.2 微生物菌群结构分析

为研究污泥驯化及稳定运行过程中系统微生物群落的变化,分别在第1、12、42天从系统中取污泥样品进行高通量测序,样品编号分别为S1、S2、S3,利用序列分类全局比对从纲水平对富集过程中污泥样品进行分类学分析,阐述污泥驯化过程中微生物菌群结构。污泥样品中α-变形菌纲(Proteobacteria)、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、σ-变形菌纲和δ-变形菌纲相对丰度占比较大,其中S3中β-变形菌纲占比最大(相对丰度为15.34%),γ-变形菌纲相对丰度由S1中的9.45%升到S3中的15.09%,两者是反硝化除磷污泥系统中主要菌纲;α-变形菌纲、σ-变形菌纲、δ-变形菌纲相对丰度分别由S1中8.67%、11.92%、8.86%降低到S3中的3.22%、7.31%、3.87%。JOHWAN等[10]利用变性梯度凝胶电泳技术分析电子受体对DPAO菌群结构影响时发现,以硝酸盐氮作为电子受体时DPAO属于优势菌种,且这些菌种属于β-变形菌纲和γ-变形菌纲。ZHANG等[11]在A2O系统强化反硝化除磷及菌群结构分析中得到相同的结论,由此进一步证实,本系统中DPAO逐渐被富集成为优势菌种,而S3中变形菌纲相对丰度为44.47%并不占绝对优势,系统缺氧出水TP和硝酸盐氮去除率均稳定在90%左右,由此推测系统中会存在其他反硝化除磷菌纲。3个污泥样品其他共同主导纲包括嗜热菌纲(Ignavibacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、浮霉菌纲(Planctomycetia)、疣微菌纲(Verrucomicrobiae)、黄杆菌纲(Flavobacteriia)(见图3)。污水处理膜生物反应器厌氧菌群驯化中发现,嗜热菌纲逐渐成为系统的主要菌纲,其占比由初始不到1%逐渐上升为54%[12]。美国旧金山一污水处理厂利用微藻生长离岸薄膜系统培育藻类,污水中含有高浓度有机物且其微生物菌纲以纤维黏网菌纲、黄杆菌纲和鞘脂杆菌纲为主。SBR菌群结构研究发现,溶解氧较低的厌氧层中具有反硝化功能的厌氧绳菌纲和拟杆菌纲的比例逐渐提高[13]。

图3 纲水平相对丰度Fig.3 Relative abundance at class level

2.3 菌株筛选与鉴定

2.3.1 菌株筛选与形态特征

于稳定运行的A2-SBR污泥中分离得到20株菌株,通过脱氮除磷率试验、硝酸盐还原产气试验优选出一株兼具反硝化和除磷功能的高效菌株PD1。PD1的TP和硝酸盐氮的去除率分别达到91.24%和92.83%,且硝酸盐还原产气结果为阳性,可见PD1具有明显的反硝化除磷脱氮能力。培养48 h后观察单个菌落，PD1为橘红色、不透明,表面湿润光滑微凸,质地较软,光学显微镜观察发现PD1为革兰氏阳性菌,短杆状,常呈“V”字形生长,无芽孢,无鞭毛,无运动性。生理生化特性研究结果显示：葡萄糖氧化发酵结果为发酵型,硝酸盐还原及亚硝酸盐还原均为阳性,即PD1能在缺氧条件下以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体,将其还原为N2,从而表现出反硝化功能;柠檬酸钠利用为阳性,表明PD1可利用柠檬酸盐等有机化合物作为碳源;甲基红、糖醇发酵、接触酶、吲哚试验均为阳性;V-P测定、氧化酶试验、明胶液化均为阴性。

2.3.2 菌株鉴定及发育树构建

以PD1总DNA基因组为模板PCR扩增获得一段1 349 bp的16S rDNA基因序列,将PD1的16S rDNA基因序列提交到GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov),得到GenBank登录号KC905040。利用BIOEDIT和MEGA软件,以邻接法绘制16S rDNA系统发育树。PD1与多株副球菌属(Paracoccussp.)同源性均达到95%(见图4),结合形态特征及生理生化特性,可将PD1最终鉴定为副球菌属。DPAO多为气单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)及假单胞菌属(Pseudomonas)[14],而副球菌属多用于处理石油废水[15],本研究首次发现具有反硝化聚磷功能的副球菌属。

图4 菌株发育树Fig.4 Species phylogenetic tree

2.4 PD1在厌氧/缺氧条件下的代谢特征

2.4.1 PD1厌氧代谢特征

PD1厌氧/缺氧反应中基质变化曲线见图5。厌氧混合液中COD降低108.24 mg/L,TP上升了18.01 mg/L,poly-P降低了82.13 mg/L,厌氧释磷效果明显。PHB上升了81.85 mg/L,由PHB的氧化反应可计算出PHB与COD的换算比为1.674,即以COD计PHB变化量(ΔPHB)为137.01 mg/L;糖原下降了45.19 mg/L,由糖原的氧化反应式可知糖原与COD的换算比为1.067,即以COD计糖原变化量(Δ糖原)为48.22 mg/L,此时Δ糖原/ΔPHB=0.352,表明35.2%的PHB是由糖原生成,因此将有88.79 mg/L PHB是由外碳源转化(即ΔCOD有效),说明有82%外碳源转化为PHB贮存于细胞体内,而其余18%的外碳源用以维持细胞在厌氧段的基本代谢。这与文献[16]的DPAO在厌氧条件下通过糖原酵解和胞内poly-P水解获取ATP并合成PHB储存于体内的代谢模式相同。厌氧120 min,TP变化量(ΔP)/ΔCOD有效=0.202,即每1 mg COD转化为PHB时释放0.202 mg磷,表现出较好的释磷特性,这与王亚宜等[17]在研究碳源浓度对反硝化聚磷影响时的结果相似。在研究厌氧释磷时,COD的有效转化量既影响磷的释放又影响PHB的合成,而PHB的合成继而影响后续缺氧反硝化除磷效果,因此需重点跟踪ΔP/ΔCOD有效来判断反硝化除磷效果。

图5 PD1厌氧/缺氧反应中基质变化曲线Fig.5 Matrix change curve in anaerobic/anoxic reaction of PD1

2.4.2 PD1缺氧代谢特征

缺氧150 min(即270 min),TP下降了25.59 mg/L,poly-P升高了89.39 mg/L,磷的去除率为92.64%。PHB降低了85.68 mg/L(即ΔPHB=143.43 mg/L),硝酸盐氮降低了27.84 mg/L,COD仅下降了19.86 mg/L,说明缺氧段硝酸盐氮的去除并非消耗外碳源而是消耗细菌胞内PHB完成的。因此,DPAO在缺氧反硝化吸磷过程中对硝酸盐氮的去除效果应由硝酸盐氮变化量(ΔN)/ΔPHB表征,而不是ΔN/COD变化量(ΔCOD)。并且缺氧反应中糖原相比厌氧结束后增加了51.32 mg/L(即Δ糖原=54.76 mg/L),此时Δ糖原/ΔPHB=0.382,有88.67 mg/L糖原是由PHB转化(即ΔPHB有效)。缺氧吸磷反应过程中能提供电子供体的有效碳源为内碳源PHB,反应过程中PHB分解产生的ATP用于合成糖原及poly-P[18],所以研究反硝化聚磷效果时可用ΔP/ΔPHB有效考察缺氧吸磷效果。缺氧吸磷结果表明：缺氧段ΔP/ΔPHB有效(0.289,即每分解1 mg PHB时吸收0.289 mg磷)>厌氧段ΔP/ΔCOD有效(0.202),表明PD1可吸收过量磷以达到除磷的目的。

(1) 23 d A2-SBR启动成功,缺氧出水TP和硝酸盐氮去除率分别稳定在95%、91%左右和β-变形菌纲和γ-变形菌纲占主导地位。

(2) PD1与多株副球菌属同源性均达到95%,结合形态特征及生理生化特性,可将PD1最终鉴定为副球菌属。

(3) 在厌氧段PD1将每1 mg COD转化为PHB时释放0.202 mg磷,poly-P水解获取ATP并合成PHB;在缺氧段每分解1 mg PHB时将吸收0.289 mg磷,分解PHB产生的ATP用于合成糖原及poly-P。

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