基于eDNA宏条形码技术的喀斯特高原人工湖泊鱼类多样性分析
时间：2023-02-27 08:05:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
许龙飞，姚邓雕，杨原伟，郭星辰，李君轶，姜海波，安苗，董响红，邵俭*
（1贵州大学动物科学学院/高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州贵阳 550025；
2中国水产科学研究院长江水产研究所/农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，湖北武汉 430223）
【研究意义】我国以云贵高原为中心的西南地区喀斯特地貌丰富，是世界三大喀斯特集中分布区域之一，其中贵州境内61.9%的国土面积为喀斯特地貌（李秋华等，2013；
阮玉龙等，2013）。西南喀斯特地区是我国珍稀物种、濒危物种、特有物种分布最集中、种类最丰富的地区之一（王波等，2018）；
但喀斯特生态系统也是典型的脆弱生态系统，土层浅薄，土壤承载力差，生态地质环境脆弱（贺忠权等，2021）。近年来，人工筑坝导致的河道破碎、工农业污染引起的水体富营养化及不合理引种造成的外来物种生物入侵等，致使我国喀斯特地区土著鱼类种群受到不同程度的胁迫。因此，亟待摸清喀斯特高原鱼类群落现状，为保护西南喀斯特地区鱼类多样性提供科学依据。【前人研究进展】红枫湖和阿哈湖是典型的喀斯特高原人工湖泊。红枫湖位于贵州省清镇市，是猫跳河梯级水电站拦河而成的人工湖泊，属长江流域乌江水系（曾华献等，2020）；
阿哈湖位于贵州省贵阳市西南郊8 km，流域面积180.3 km2，总库容0.87亿m3，同属长江流域乌江水系（黄轶婧等，2020）。至今，有关红枫湖和阿哈湖的研究多围绕水质评价（郭云等，2015；
韩翠红等，2020；
金祖雪等，2020；
费志军等，2021），涉及鱼类资源调查的研究较少，对于二者的鱼类种群现状尚不清楚。红枫湖和阿哈湖作为长江上游重要的生态屏障，研究其鱼类多样性是维持当地水生生态系统的关键，对于维持和补充长江鱼类资源同样具有重要意义（de Paula Gutiérrez and Agudelo，2020；
Wang et al.，2021）。环境DNA（Environmental DNA，eDNA）是指生物散落在环境中的DNA片段，通常来源于生物的皮肤碎屑、配子、黏液及粪便等（Bohmann et al.，2014）。Ogram等（1987）利用eDNA研究土壤沉积物中的微生物，并首次提出eDNA的概念。eDNA宏条形码技术是利用环境中的DNA结合高通量测序技术完成对环境样本总DNA测序，通过生物信息学分析，以及与公开物种序列数据库进行比对，最终得到环境样本中物种组成的技术（Shu et al.，2020；
杨海乐等，2021）。目前，eDNA宏条形码技术已广泛应用于监测鱼类空间结构（Zhang et al.，2020）、鱼类物种组成与种群丰度（王梦等，2022）及鱼类生物入侵现状（Zhang et al.，2022）等领域。eDNA宏条形码技术的优点包括：（1）不受科研人员的主观判断影响；
（2）避免了长期的鱼类样本采集，极大提高了物种监测效率；
（3）eDNA宏条形码技术不入侵环境，对监测物种及其栖息地几乎不产生影响（Antognazza et al.，2019；
Aglieri et al.，2021）。【本研究切入点】随着国际动物保护公约、动物福利及生态生物多样性保护等法规措施的执行，eDNA宏条形码技术无疑更符合当下生物多样性监测的需求。【拟解决的关键问题】利用eDNA宏条形码技术探究喀斯特高原人工湖泊鱼类多样性，综合评估红枫湖和阿哈湖鱼类群落结构及环境因子对喀斯特高原人工湖泊鱼类分布的影响，以期为喀斯特地区水域鱼类多样性评估提供新方法、新思路，也为红枫湖和阿哈湖鱼类保护管理措施的制定积累基础资料。
1.1 样点设置及样品采集
红枫湖和阿哈湖样品采集时间为2021年11月25日，采样点设置参考SC/T 9402—2010《淡水浮游生物调查技术规范》，具体如下：红枫湖分为南湖和北湖，在南、北湖湖心处、湖泊入水口、出水口设置采样点，结合红枫湖水域特点，环湖布置采样点，南、北湖各设5个采样点，共计10个采样点；
在阿哈湖湖心处、湖泊入水口、出水口设置采样点，结合阿哈湖水域特点，环湖布置采样点，共计7个采样点（图1）。样品采集全部在船上完成，使用采水器分水体上（1 m）、中（5 m）、下层（10 m）采样混合后，每个采样点留取2 L水样低温避光保存，送回实验室立即抽滤，实验人员操作时每个采样点更换1次手套。采样过程记录采样点的经纬度，使用黑白盘测定水体透明度（Transparency，Tra），并以YSI便携式水质仪测定水温（Water temperature，WT）、总溶解固体（Total dissolved solids，TDS）、盐度（Salinity，Sal）、pH、溶解氧（Dissolved oxygen，DO）、离子氨（Ionic ammonia，NH4+）等环境因子（表1）。
表1 eDNA样品采集点地理位置及其环境因子Table 1 Geographic locations and environmental factors of eDNA sampling sites
图1 红枫湖和阿哈湖采样点设置分布情况Fig.1 Sampling site distribution of Hongfeng Lake and Aha Lake
1.2 eDNA提取及扩增
使用隔膜真空泵和砂芯玻璃过滤装置抽滤水样，选用0.45 μm孔径的玻璃纤维滤膜。抽滤时操作环境充分通风，每过滤1份样品均用1%次氯酸溶液处理实验操作台面及过滤装置，实验人员更换1次手套。设1个空白对照，使用同样滤膜抽滤2 L的ddH2O检测有无环境污染。抽滤完成后将滤膜置于1.5 mL离心管中，-20℃保存备用。使用OMEGA公司的Water DNA Kit D5525试剂盒提取水体eDNA，选用Tele 02硬骨鱼类通用引物（Tele 02-F：5"-AAA CTCGTGCCAGCCACC-3"；
Tele 02-R：5"-GGGTATC TAATCCCAGT TTG-3"）进行PCR扩增（Taberlet et al.，2018）。对提取的eDNA进行凝胶电泳检测，质检合格的样本上机测序，测序平台为Illumina NovaSeq 6000。
1.3 测序及生物信息学分析
设10 bp的窗口，若窗口内平均质量值低于20，则从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的序列（Trimmomatic v0.3），根据双端测序的overlap关系，将成对序列拼接成1条序列，最小overlap长度为10 bp，overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛除不符合序列（FLASH v1.2.7），按照标签和引物序列进行拆分并调整序列方向，得到每个样本的优质序列。对优质序列按照98%相似性进行OTU聚类（Zhang et al.，2020），在聚类过程中去除嵌合体，生成OTUs表格（perl v5.18.2，Usearch v10，qiime v1.9.1）。将生成的OTUs表格在基于NCBI网站nt数据库自建的淡水鱼类数据库中进行物种基因注释（建库时间2021年10月），得到鱼类物种信息，鱼类分类依据参考Fishbase数据库。
1.4 鱼类多样性数据处理分析
为确保鉴定结果更准确，对鉴定结果进行如下校正：（1）将低丰度序列（序列样本平均读数低于1）订正为未识别；
（2）将鉴定到的杂交种进行校正，若杂交种父母本隶属于同属鱼类A属，则将该杂交种订正为Asp.，否则将该杂交种序列订正为未识别。使用Excle 2020分析含鱼类物种信息注释的OTUs表格，并绘制物种组成饼图；
基于鱼类代表OTUs序列读数，绘制属分类水平鱼类分布热图，为消除数据差异过大对热图的影响，先将序列读数进行均一化处理，再使用R语言绘制热图。同时，使用R语言进行PerMANOVA分析，明确红枫湖南、北湖鱼类群落结构差异性；
利用R语言vegan包进行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），将鱼类代表OTUs序列读数进行Hellinger转化，环境因子数据进行均一化以消除量纲影响，RDA分析前需对环境因子进行共线性分析，剔除方差膨胀因子过大的环境因子。
2.1 PCR扩增产物质量检测结果
红枫湖10个eDNA样本和阿哈湖7个eDNA样本的PCR扩增产物质量检测目的条带大小正确，均满足测序条件，而空白对照组无任何条带，说明试验过程中无污染。
2.2 高通量测序结果
红枫湖10个eDNA样本的物种累积曲线如图2-A所示，随着测序深度的增加，观测到的OTUs数量趋于稳定，说明eDNA样本数量足以代表红枫湖鱼类多样性。阿哈湖7个eDNA样本的物种累积曲线如图2-B所示，随着样本数量的增加，观测到的OTUs数量趋于稳定，也说明eDNA样本数量足以反映阿哈湖鱼类多样性。
图2 红枫湖（A）和阿哈湖（B）的eDNA样本物种累积曲线Fig.2 Cumulative curve of species of eDNA samples from Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）
2.3 鱼类基因注释结果
经人工校正后，在红枫湖鉴定出鱼类32种，隶属于5目11科27属，有2种 鱼 类 鉴 定 到 属［鳜 属（Siniperca）］，有11种鱼类在历史数据库中得到匹配（表2）。其中，鲤形目（Cypriniformes）鱼类18种，鲇形目（Siluriformes）鱼类5种，日鲈目（Centrarchiformes）鱼类5种，胡瓜鱼目（Osmeriformes）鱼类2种，鰕虎鱼目（Gobiiformes）鱼类2种（图3-A）。在阿哈湖鉴定到鱼类33种，隶属于6目12科28属，有3种鱼类鉴定到属（表2）。其中，鲤形目鱼类18种，鲇形目鱼类5种，日鲈目鱼类5种，胡瓜鱼目鱼类2种，鰕虎鱼目鱼类2种，攀鲈目（Anabantiformes）鱼类1种（图3-B）。
图3 红枫湖（A）和阿哈湖（B）的鱼类物种组成结构Fig.3 Fish species composition of Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）
表2 基于eDNA宏条形码技术在红枫湖和阿哈湖各采样点的鱼类检出情况Table 2 Detection of fish from each sampling site in Hongfeng Lake and Aha Lake based on eDNA metabarcoding technology
在属分类水平上，红枫湖鱼类在各采样点的分布情况如图4显示。红枫湖鱼类代表OTUs（属分类水平）序列读数排名前10的分别是鱯属（Hemibagrus）、鲤属（Cyprinus）、鳜属、黄颡鱼属（Tachysurus）、鲢属（Hypophthalmichthys）、属（Hemiculter）、新银鱼属（Neosalanx）、草鱼属（Ctenopharyngodon）、青鱼属（Mylopharyngodon）和特鲶属（Tatia）。阿哈湖属分类水平鱼类在各采样点的分布情况如图5所示，阿哈湖鱼类代表OTUs（属分类水平）序列读数排名前10的分别是鲢属、鱯属、鳜属、鲤属、黄颡鱼属、属、新银鱼属、草鱼属、吻鰕虎鱼属（Rhinogobius）和鳑鲏属（Rhodeus）。
图4 基于红枫湖各采样点鱼类代表OTUs（属分类水平）序列读数的鱼类分布热图Fig.4 Heat map of the distribution of fish OTUs（genus classification level）sequence reads based on sampling sites in Hongfeng Lake
图5 基于阿哈湖各采样点鱼类代表OTUs（属分类水平）序列读数的鱼类分布热图Fig.5 Heat map of the distribution of fish OTUs（genus classification level）sequence reads based on sampling sites in Aha Lake
2.4 红枫湖和阿哈湖鱼类多样性
红枫湖各采样点鱼类的Chao1指数显示，在H6采样点观察到的OTUs数量最低（1205.08），在H10采样点观察到的OTUs数量最高（1434.26）；
在Shannon指数方面，H7采样点群落多样性最高，H9采样点群落多样性最低；
Simpson指数的变化趋势与Shannon指数一致（表3）。在监测到的32种鱼类中，有27种鱼类在所有采样点均能监测到，红枫湖全部采样点均无特有鱼类，各采样点检出鱼类总数差异不明显，保持在28~30种。红枫湖南湖监测到32种鱼类，其中2种为南湖独有鱼类；
北湖监测到30种鱼类，无北湖独有鱼类（表2）。PerMANOVA分析结果显示，红枫湖南、北湖鱼类群落结构差异不显著（R2=0.08，P=0.562＞0.05）。
表3 红枫湖鱼类α多样性指数Table 3 α diversity index of fish in Hongfeng Lake
阿哈湖各采样点鱼类的Chao1指数显示，在A7采样点观察到的OTUs数量最低（1051.95），在A5采样点观察到的OTUs数量最高（1435.24）；
在Shannon指数方面，A5采样点群落多样性最高，A3采样点群落多样性最低；
Simpson指数则显示以A6采样点群落多样性最高、A3采样点群落多样性最低（表4）。在监测到的33种鱼类，有26种鱼类在所有采样点中均能监测到，阿哈湖全部采样点均无独有鱼类，各采样点检出鱼类总数差异不明显，保持在28~32种（表2）。
表4 阿哈湖鱼类α多样性指数Table 4 α diversity index of fish in Aha Lake
2.5 鱼类多样性与环境因子的相关性
对红枫湖鱼类多样性与环境因子进行RDA分析前，在共线性分析中剔除了Tra和Sal 2个环境因子，剩余5个环境因子（表5）对引起红枫湖各采样点鱼类群落结构差异的解释度为69.38%。RDA分析结果（图6-A）显示，红枫湖各采样点分布较散，无聚集趋势。在RDA1轴上，WT呈正相关，其余环境因子呈负相关；
在RDA2轴上，pH、DO和NH4+呈正相关，其余环境因子呈负相关。对阿哈湖鱼类多样性与环境因子进行RDA分析前，在共线性分析中剔除了Sal和pH 2个环境因子，剩余5个环境因子（表5）对引起阿哈湖各采样点鱼类群落结构差异的解释度为68.74%。RDA分析结果（图6-B）显示，阿哈湖各采样点分布较散，也无聚集趋势，其中A3、A5采样点与其余采样点距离较远，说明这2个采样点与其余采样点鱼类群落相似度更低。在RDA1轴上，NH4+、DO和WT呈正相关，其余环境因子呈负相关；
在RDA2轴上，5个环境因子均呈正相关。
图6 红枫湖（A）和阿哈湖（B）鱼类多样性与环境因子的RDA分析结果Fig.6 RDA results of fish diversity and environmental factors of Hongfeng Lake（A）and Aha Lake（B）
表5 RDA分析中各环境因子的决定系数及其相关性Table 5 Determination coefficients and correlation of each environmental factor in RDA
3.1 红枫湖和阿哈湖鱼类组成
本研究在红枫湖设10个采样点，通过eDNA宏条形码技术共监测到32种鱼类，其中有11种鱼类在历史数据库（牟洪民等，2012）中得到验证。红枫湖有21种鱼类没有在历史数据库中得到验证，主要是由于历史数据库为2010—2011年采集样本，对于目前红枫湖现有鱼类群落组成尚不清楚，说明选取的历史数据库不能完全代表红枫湖现阶段鱼类群落结构。此外，利用公用鱼类线粒体12S序列文库进行物种信息注释可能会对个别亲缘近的物种出现偏差（Lamy et al.，2021；
de Santana et al.，2021）。本研究监测到鲢（H.molitrix）、鳙（H.nobilis）（H.leucisculus）、南方马口鱼（O.uncirostris）、棒花鱼（A.rivularis）、鲤（C.carpio）、草鱼（C.idella）等红枫湖历史优势鱼类，但1982和2010年2次红枫湖鱼类资源调查中监测到的红鳍鲌（Culter erythropterus）、长春鳊（Parabramis pekinensis）、三 角 鲂（Magalobrama tarminalis）、泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）、黄鳝（Monopterus albus）等鱼类（牟洪民等，2012）在本研究中均未监测到，说明这些鱼类种群极度萎缩或已消失。本研究在红枫湖监测到鲤形目鱼类18种（占56.25%），还包括日鲈目大口黑鲈（M.salmoides）、中国少鳞鳜（C.whiteheadi）、鳜（S.chuatsi）及鳜属（Sinipercasp.）未定种鱼类2种，胡瓜鱼目太湖新银鱼（N.taihuensis）、中国大银鱼（P.chinensis），鲇形目斑鱯（H.guttatus）、南方鲶（S.meridionalis）等常见非红枫湖土著经济养殖鱼类。阿哈湖并无传统的鱼类资源调查数据作为历史数据库，本研究在阿哈湖监测到鲤形目鱼类18种（占54.55%），另有鳢属未定种鱼类1种，日鲈目大口黑鲈、中国少鳞鳜、鳜及鳜属未定种鱼类2种，胡瓜鱼目太湖新银鱼、中国大银鱼，鲇形目斑鱯、南方鲶等常见经济养殖鱼类。可见，现阶段的红枫湖和阿哈湖鱼类组成以鲤形目鱼类为主，但存在以日鲈目为主的养殖鱼类生态入侵。
3.2 高通量测序序列读数与鱼类种群丰度的关系
本研究结果显示，在OTUs（属分类水平）序列读数排名中，红枫湖鱼类以鱯属排名第一、特鲶属排名第十，阿哈湖鱼类以鱯属排名第一、黄颡鱼属排名第五、特鲶属排名第十三。鱯属仅监测到斑鱯1种鱼类，斑鱯隶属于鲇形目鲿科（Bagridae），俗称芝麻剑，是我国传统的名贵养殖鱼类，主要分布在钱塘江、九龙江和珠江等水系（刘伟，2016），而红枫湖和阿哈湖属于长江水系。在红枫湖监测到斑鱯eDNA信号可能是由于2021年更新的《国家重点保护野生动物名录》将斑鱯野生种群列为国家二级保护动物（养殖群体除外），贵州多地开展斑鱯人工繁育及养殖所造成，但斑鱯是否成为红枫湖和阿哈湖鱼类的优势种尚有待进一步考证。黄颡鱼隶属于鲇形目鲿科，在我国长江、黄河及珠江等各大水系均有分布，是常见的经济养殖鱼类（王凌宇等，2020）。有研究表明，大坝的建成通常导致原有江段鱼类多样性下降，繁殖鱼类群落结构趋于单一，其中条等小型鱼类等易成为优势种（李世健等，2011；
常涛等，2021），但鲜见黄颡鱼成为优势种的报道。特鲶属鱼类监测到中间特鲶（T.intermedia），中间特鲶隶属于鲇形目颈鳍鲶科（Auchenipteridae），俗名为银河豹鲸，在南美洲广泛分布（Pereira et al.，2017），Fishbase数据库标记我国无分布，但在公开网络上可检索到国内已将其作为观赏鱼进行人工繁育的记录。故推测中间特鲶是因遗弃、放生等方式进入我国自然水域，但其为热带鱼类，红枫湖和阿哈湖的环境并不利于中间特鲶发展成为优势种。
既往研究显示，序列丰度读数和生物量存在一定的相关性（Kelly et al.，2014；
Evans et al.，2016）。陈世静（2020）研究表明，在鱼类组成相对简单的水族箱中，鱼类生物量与序列读数呈正相关。在PCR扩增过程中，通用引物对水环境中不同物种的扩增效率也不同，是由于通用引物对个别物种存在扩增偏好性，而导致个别物种序列读数产生数量级差异（Elbrecht and Leese，2015；
Piñol et al.，2015）。因此，黄颡鱼属、鱯属、特鲶属鱼类代表OTUs序列读数较高，也有可能是通用引物的扩增偏好性所造成。
3.3 红枫湖和阿哈湖鱼类多样性与环境因子的关系
红枫湖环境因子与鱼类群落结构差异的决定系数（R2）排序为DO＞TDS=WT＞pH＞NH4+。DO（P=0.034）是引起红枫湖各采样点鱼类群落结构差异的主要环境因子。DO是影响鱼类生存最重要的环境因子，当水体DO在2.0~3.0 mg/L时会影响鱼类摄食等生命活动，而DO高于5.0 mg/L时鱼类摄食生长完全正常（申玉春，2008）。本研究的采样均在日出时间，红枫湖各采样点水体DO在6.3~10.5 mg/L，可能是由于日出时间湖中生产者正在进行光合作用，因此水体DO均高于5.0 mg/L；
在日落时间因光合作用停止，红枫湖部分区域水体DO降至5.0 mg/L以下，致使DO成为红枫湖鱼类群落分布的主要制约因子。阿哈湖环境因子与鱼类群落结构差异的决定系数（R2）排序为TDS＞WT＞Tra＞NH4+＞DO。TDS（P=0.005）是引起阿哈湖各采样点鱼类群落结构差异的主要环境因子。据李美霞（2021）的研究显示，TDS和浮游植物群落呈显著正相关。本研究中，阿哈湖以鲢和鳙的OTUs序列丰度最高，且二者都是以浮游生物为主要食物来源的滤食性鱼类。这可能也是TDS成为引起阿哈湖各样点鱼类群落结构差异主要环境因子的原因。
现阶段的红枫湖和阿哈湖鱼类组成以鲤形目鱼类为主，但存在以日鲈目为主的养殖鱼类生态入侵。eDNA宏条形码技术在喀斯特高原水域鱼类多样性评估方面具有较好的适应性，可快速监测到鱼类群落结构和空间分布情况，但通用引物可能对某些鱼类存在扩增偏好性；
此外，不同人工湖泊水质理化因子特异性较强，研究环境因子与湖泊鱼类群落的关系时应对每个湖泊单独进行评估。
