工业化提取女贞子中花青素的实验研究
时间：2023-02-17 15:00:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
薛涛，张成龙，李昀达，赵越超，林琳，常芷健，岳勇铭，王苏桐，李剑男*
（1. 神威药业（四川）有限公司生产车间，四川 邛崃 611530；
2. 长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117）
女贞子又称女贞实，是女贞的成熟、干燥果实[1]，是一种补肾养肝养目的中药，出现内热外渴、腰膝无力、耳鸣、肝肾阳虚、眩晕、胡须干白等症状的人群可以根据医嘱使用，现代药理学研究表明其具有增强血管强度、抗肝损伤、降血脂、降血糖的作用，可增强机体对于外来细菌或致病物质的抵抗能力，提高人体免疫力[1～3]。
花青素，别名花色素，基本骨架为C6-C3-C6，是由糖苷配基和糖组成的类黄铜酚类化合物，是2-苯基苯并吡喃烊离子或黄烊盐的多羟基和甲氧的衍生物。女贞子中花青素含量较高，其药材可获得性较好、提取便捷。花青素的开发不仅可以为食品工业提供安全、高质量的天然色素，在医药领域，花青素亦可取代合成色素以着色剂形式加入到药物制剂中以生产出彩色片剂、口服液等[4]，因此研究女贞子中花青素的提取工艺具有市场价值。
目前国内外文献中对女贞子中花青素提取方法报道包括加压溶剂萃取、超声波辅助提取法、有机溶剂提取、煎煮法、生物发酵提取、超临界提取法等，其优点和缺点不一而足，如加压溶剂萃取可以提高沸点从而提高萃取效率，但加压条件需要配合专门的设备，同时也具有一定危险性；
生物发酵法反应条件温和，有效成分保留较好，但操作过程比较复杂；
煎煮法是最常用的提取方法，但花青素化学结构为热敏性结构，煎煮法温度高，易造成有效成分的分解。
温浸法也是中药材传统提取工艺之一，该方法对设备没有特殊要求，提取条件温和，有利于保持有效成分的稳定性，操作简单，对操作工人的要求较低，但在近五年的文献资料中并未检索到以温浸法提取花青素的研究报道；
因此本研究采用温浸法提取女贞子中花青素，花青素含量以矢车菊素-3-0-葡萄糖苷计，采用单因素实验和正交实验优化女贞子中花青素的提取工艺[5]，为女贞子中花青素的工业化提取提供理论基础。
1.1 仪器
UV-935 型紫外可见分光光度计（大连依利特仪器公司）；
RE371D 型电热数码恒温水浴锅（金坛市电热仪器厂）；
ME204E 型梅特勒电子天平 （梅特勒-托利多集团）；
P-500B-2D 粉碎机（永康久品工贸有限公司）；
SHZ-III 台式循环水真空泵（郑州科达机械仪器设备有限公司）；
LXJ-IIB 型离心机（上海安宁科学仪器厂）；
DHG9101-A 型电热恒温鼓风干燥箱（天津盛欣有限责任公司）。
1.2 试药
女贞子于2021 年1 月购买于吉林省通化市。经生药学鉴定该药品为木犀科（Oleaceae）女贞属（Ligustrum Linn）女贞子（Ligustrum Lucidum）；
标准品矢车菊素-3-0-葡萄糖苷，购于山东制剂有限公司；
无水乙醇、氯化钠等均为分析纯。
2.1 花青素分析方法的建立
2.1.1 对照品溶液的配制
将矢车菊-3-0-葡萄糖苷干燥至恒重[6]，称取2.5 mg 置于10 mL 量瓶中，用浓度为60%、pH 值为2.0 的酸性乙醇溶液溶解后定容，得到浓度为0.25 mg/ mL 的标准品溶液[6～10]。
2.1.2 供试品溶液的制备
取女贞子提取液， 浓缩后离心15 min（4 500 r/ min），将上清液移入100 mL 量瓶中，用pH值为2.0 的酸性乙醇溶液定容至刻度线[6～10]。
2.1.3 标准曲线的绘制
取已经配制好的标准品溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL， 分 别 置 于5 mL 量 瓶中，用pH 值为5.0 的无水乙酸钠缓冲溶液定容至刻度线[6～10]。以第一瓶溶液为空白对照，用紫外-可见分光光度计在最大吸收波长500 nm 处分别测量其吸光度，以浓度为横坐标（X），以吸光度值为纵坐标（Y），绘制出标准曲线，得线性回归方程为Y= 19.793X-0.091 3，相关系数r= 0.999 5，结果表明溶液浓度与吸光度在0.025 ～ 0.08 mg/mL 范围内线性关系良好。
2.1.4 方法学考察
图1 矢车菊-3-0-葡萄糖苷标准曲线Fig.1 Bluebonnet-3-0-glucoside standard curve
（1）精密度考察 精密吸取标准品溶液1 mL，共6 份，分别置于10 mL 量瓶中，用浓度为60%、pH值为2.0 的酸性乙醇溶液定容至刻度线，在紫外分光光计中于波长500 nm 测定其吸光度[6～10]。结果表明，花青素含量的RSD 值为0.70%，小于3%，证明仪器的精密度较好。
（2）重现性考察 取6 份2 mL 的供试品溶液，用60%的pH 值为2.0 酸性乙醇溶液于100 mL 量瓶中定容至刻度线，再将其分别放在紫外分光光计中依次在波长500 nm 处测定其吸光度[6～10]。结果表明，重现性实验RSD 值为2.02%，小于3%，证明该分析方法的重现性良好。
（3）稳定性考察 取供试品溶液，分别于0、3、6、9、12 h 在波长500 nm 处测定吸光度[6～10]，结果各样品检测值的RSD值为1.04%，表明样品在12 h内稳定。
（4）回收率考察 取2 mL 供试品溶液共6 份，分别加入0.25 mg/mL 矢车菊-3-0-葡萄糖苷1 mL、2 mL、3 mL 在波长500 nm 处测定吸光度，计算回收率[6～10]。结果表明，加样回收率平均值为98.16%，RSD%=0.473%，这就表明加样回收结果较好。
回收率=（测得量-样品量）÷ 加入量
表1 加样回收率试验结果Tab.1 Results of sample addition recovery rate
综合以上方法学考察结果得知，试验方法的精密度、稳定性、重现性、回收率均良好，证明该试验方法可行，可用于女贞子中花青素的含量测定。
2.2 单因素试验
2.2.1 乙醇浓度对提取率的影响
将女贞子过50 目筛，取筛下样品100 g，共5 份，分别置于装有搅拌桨的圆底烧瓶中；
将恒温水浴锅调至30 ℃，料液比1∶10（g/mL），分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%的pH 值为2.0 酸性乙醇溶液，搅拌桨调至第一档（下同），浸提60 min；
将提取液按“供试品溶液的制备”中的方法制备成供试品溶液，测定吸光度，计算提取率[11-13]。结果显示：当乙醇浓度分别为40%、50%和60%时花青素的提取率较高。乙醇浓度为70%时提取效果与40%接近，但用高浓度乙醇提取，生产成本更高，因此乙醇浓度三个水平选40%、50%、60%进行正交实验。
图2 乙醇浓度对花青素提取率的影响Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of anthocyanin
2.2.2 料液比对提取率的影响
将女贞子过50 目筛，取筛下样品100 g，共5 份，分别置于装有搅拌桨圆底烧瓶中，根据不同的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）各加入浓度为60%的pH 值为2.0 酸性乙醇溶液，浸提60 min，将提取液按“供试品溶液的制备”中的方法制备成供试品溶液，测定吸光度，计算提取率[11-13]。结果显示：当料液比达到1∶15（g/mL）时提取率较高，溶剂体积继续增加后花青素含量仅有较小的提高，但溶剂体积大意味着需要更多的时间进行干燥，会增加生产成本，因此，选取1∶10、1∶15、1∶20（g/ mL）三个水平进行正交试验。
图3 料液比对花青素提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin
2.2.3 粒径大小对提取率的影响
将女贞子粉碎，用药筛分别将女贞子过10 目筛、24 目筛、50 目筛、65 目筛、80 目筛，各取筛下物100 g，加入60%的pH 值为2.0 酸性乙醇溶液，浸提60 min，将提取液按“供试品溶液的制备”中的方法制备成供试品溶液，测定吸光度，计算提取率[11-13]。结果显示：当女贞子的粒径依次减小时，提取率增加，达到50 目以下时，粒径继续减小对试验结果影响不大，且粒径越小粉碎难度越大，成本越高，因此决定将药材粒径控制在完全可以通过50 目筛即可，不作为正交试验的考察因素。
图4 粉碎程度对花青素提取率的影响Fig.4 The effect of pulverization degree on the extraction rate of anthocyanin
2.2.4 提取温度对提取率的影响
称取五份过50 目筛的女贞子粉样品，每份100 g，放在5 个圆底烧瓶中，将恒温水浴锅依次调至25、30、35、40、45 ℃，按料液比1∶20（g/ mL），加入浓度为60%的pH 值为2.0 酸性乙醇溶液，浸提60 min，将提取液按“供试品溶液的制备”中的方法制备成供试品溶液，测定吸光度，计算提取率[11-13]。结果表明：随着温度的升高，提取率先升高后降低，提取率较高时的温度分别为30 ℃、35 ℃、40 ℃。造成这种波动的原因可能是花青素本身的不稳定性，低温条件下花青素提取不完全，高温会导致花青素降解，有效成分被破坏。综合花青素的性质及实验结果，较优提取温度三个水平为30 ℃、35 ℃、40 ℃。
2.2.5 提取时间对提取率的影响
称取五份过50 目筛的女贞子粉样品，每份100 g，放在5 个圆底烧瓶中，按料液比1∶20（g/ mL）加入60%的pH 值为2.0 酸性乙醇溶液，水浴至40 ℃，依次浸提40、60、80、100、120 min；
将提取液按“供试品溶液的制备”中的方法制备成供试品溶液，测定吸光度[11-13]。结果表明：随着时间的增加，女贞子中花青素的提取率呈先升高后下降的趋势，这是因为随着时间的延长花青素不断溶出，到最后接近饱和，然而，时间继续延长，导致花青素受热时间过长而使花青素分解，降低提取率[12]，同时提取时间过长会增加成本，因此选取60、80、100 min进行正交试验。
图5 提取温度对花青素提取率的影响Fig.5 The effect of extraction temperature on the extraction rate of anthocyanins
图6 提取时间对花青素提取率的影响Fig.6 The effect of extraction time on the extraction rate of anthocyanins
2.3 正交试验
根据上述单因素结果，选取料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间进行L9（3）4正交试验，并对结果进行分析，选出最佳工艺条件。
以上结果表明：以花青素提取率为考察指标，通过直观分析可知（R值大小对比），影响提取率因素大小顺序依次为：B ＞A ＞C ＞D，即料液比＞乙醇浓度＞提取温度＞提取时间，见表3；
通过方差分析，料液比和乙醇浓度对提取率的影响具有显著性差别，见表4；
结合KA3 ＞KA2 ＞KA1、KB3 ＞KB2 ＞KB1、KC3 ＞KC2 ＞KC1、KD2 ＞KD3 ＞KD1 的结果，确定最佳工艺为：A3B3C3D2，即料液比为1∶20（g/mL）、乙醇浓度为60%、提取温度为40 ℃、提取时间为80 min。
表3 正交试验结果Tab.3 Orthogonal test results
表4 方差分析结果Tab.4 Analysis of variance results
2.4 验证试验
根据正交试验所得的结果，取女贞子药材进行粉碎，取三份，每份1.0 kg，备用；
在生产用带搅拌桨的反应罐中加入20 L 浓度为60%、pH 值为2.0 的乙醇溶液，加热至40 ℃后，加入粉碎好的女贞子药材，开启机器搅拌，浸提80 min，滤过；
重复上述操作3 次，依法制备供试品溶液，测定吸光度，计算提取率。经测定，提取物中花青素的平均含量为2.972 mg/g，相对标准偏差（RSD）为0.701%，证明该工艺条件稳定。
表2 正交试验因素水平表Tab.2 Orthogonal test factor level table
在实验最开始时并没有使用到搅拌桨，结果提取过程中有效成分溶出后出现浓度差，可明显看出药材周围有有色物质溶出但外围溶剂几乎无色，从而造成有效成分提取不完全。因此后期实验中引入搅拌桨辅助提取，缩短提取时间，提高提取率。
乙醇浓度、提取时间、药材粒度等在一定范围内合理变动有助于提高提取率；
实验过程中也曾对提取次数进行了初步研究，结果发现相同提取时间，料液比1∶10 的条件下提取两次与1∶20 条件下提取一次的提取率差不多，而在1∶20 料液比条件下提取两次，第二次提取出来的花青素含量不足第一次的五分之一，且有大量其他物质被溶出，从提取效率、操作周期、人工和水电等方面考虑，放弃提取两次的操作方法，通过条件优化在提取一次的情况下可将更多花青素提取出来。
浸渍法操作简单，成本低廉，同时安全性高，能够节约能源；
通过单因素试验、正交试验以及验证试验确定女贞子中花青素最佳提取工艺为：料液比为1∶20 g/mL、乙醇浓度60%、提取温度40 ℃、提取时间80 min，提取率为2.972 mg/g。
