重症监护室患者胃肠道产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11株的分布调查及遗传相关性分析*
时间：2023-02-17 11:15:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
胡金曹，曹小利，万会林，周辉，周万青，李阳
(1.南京大学附属鼓楼医院a.检验科，b.医院感染管理科，南京210008；
2.南京市高淳人民医院检验科，南京 211300)
肺炎克雷伯菌是医院获得性感染包括呼吸道、尿道及血流感染等的重要病原菌[1]。流行病学研究显示，该菌是主要的碳青霉烯类耐药肠杆科细菌(carbapenem resistant Enterobacteriaceae, CRE)，碳青霉烯酶KPC的产生是主要的耐药机制[2]。在亚太地区，特别是中国，ST11菌株是主要的流行克隆菌株[3]，约占碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)的60%。研究报道，肺炎克雷伯菌主要定植在胃肠道[4]，和感染密切相关。本研究旨在分析产KPC-2 CRKP ST11在南京大学附属鼓楼医院重症监护室(Intensive Care Unit，ICU)住院患者胃肠道的定植情况，并分析blaKPC-2阳性肺炎克雷伯菌ST11菌株之间的遗传相关性，现报道如下。
1.1仪器和试剂 麦康凯粉剂(BD公司)，2×PCR mix(擎科生物公司)，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(法国生物梅里埃公司)，脉冲场凝胶电泳仪、成像仪(Bio-Rad公司)，Bionumeric 7.6软件购自上海一贝科技有限公司，药敏纸片(Oxiod公司)。
1.2实验菌株筛选 取2018年12月25—28日南京大学附属鼓楼医院6个ICU病区(心胸外科ICU、呼吸ICU、神经内科ICU、神经外科ICU、全院ICUA和ICUB)住院2 d以上患者的肛拭子样本共125份。样本接种至含有0.5 μg/mL美罗培南的麦康凯培养基上[5]，37 ℃过夜培养，筛选CRKP菌株，使用经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术鉴定，质控菌株为大肠埃希菌ATCC 8739。
1.3药物敏感性试验 对于筛选到的肺炎克雷伯菌，使用K-B法测定下列药物的敏感性：氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/舒巴坦、亚胺培南、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、米诺环素、替加环素、阿米卡星。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。依据美国临床和实验室标准协会(CLSI) M100 2019版标准判定药物的敏感性[6]。替加环素的药敏结果判读依据Eucast(www.eucast.org)的判读指南。
1.4blaKPC-2基因检测 煮沸法提取细菌基因组DNA。使用PCR法检测blaKPC基因[7]。引物序列设计如下。KPC-F：5′-CGTCTAGTTCTGCTGTCTTG-3′，KPC-R: 5′-CTTGTCATCCTTGTTAGGCG-3′，产物大小为798 bp。PCR反应体系为50 μL，包括2×Taq Mix 25 μL，10 μmol/L上、下游引物浓度各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；
72 ℃ 7 min。PCR产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳，将PCR阳性产物送擎科生物公司纯化测序(仪器：ABI 3730测序仪，Sanger测序法)，测序结果提交NCBI对比，确定基因型。
1.5ST11菌株的确定 依据网站提供的肺炎克雷伯菌多位点序列分型引物及条件(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)[8]，合成7个管家基因rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB引物，分别进行PCR扩增。PCR扩增条件为：94 ℃ 2 min；
94 ℃ 20 s，50 ℃(rpoB、mdh、pgi、phoE、infB)/60 ℃(gapA)/45 ℃(tonB) 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；
72 ℃ 5 min。扩增产物送擎科生物公司测序(仪器：ABI 3730测序仪，Sanger测序法)，并提交网站进行菌株的序列分型(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef&page=sequenceQuery)。
1.6脉冲场凝胶电泳(pulsed field electrophoresis, PFGE) 取新鲜培养的菌落，混匀于细胞悬液缓冲液制成菌悬液，加入蛋白酶K，制成胶块。经XbaⅠ酶切后，14 ℃、6.0 V/cm电泳19 h，夹角为120°，转换时间由2.2 s增加到54.2 s，梯度为6 V/cm，EB染色20 min后成像，Bionumerics7.6软件分析。采用基于带容限为1.5%的均值关联不加权配对群法(UPGMA)的骰子相似系数，80%为菌株遗传相关性的判定折点[9]。
2.1CRKP筛选结果 共收集肛拭子125份，在0.5 μg/mL美罗培南麦康凯平板上筛选到耐碳青霉烯菌株共计41株，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定为CRKP 30株，鲍曼不动杆菌9株，铜绿假单胞菌1株，皮尔士不动杆菌1株。CRKP在胃肠道的定植率为24.2% (30/125)。在各ICU的分布情况见表1。
2.2药物敏感性试验结果 30株CRKP对氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢哌酮/舒巴坦、阿莫西/克拉维酸、哌拉西林/舒巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星和亚胺培南的耐药率为100%，对复方磺胺甲噁唑的耐药率为96.7%，对米诺环素和替加环素的耐药率分别为63.3%和0%。
2.3碳青霉烯耐药基因的分布 PCR扩增显示，30株CRKP中，27株(90.0%)细菌携带blaKPC基因，经DNA测序分析显示，均为blaKPC-2基因。
2.4多位点序列分型 结果显示，30株CRKP中，26株(86.7%)肺炎克雷伯菌为ST11。
表1 碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌在各病区重症监护室中的分布情况
2.5细菌遗传相关性分析 PFGE结果显示，依据80%的判定折点[9]，产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11株可以分为6个PFGE簇，分为A、B、C、D、E和F。最大的簇A由19株细菌组成，除2个菌株组成B簇，其余4株细菌均单独成簇，分别为C、D、E和F簇。见图1。
注：树状图基于Dice相似系数由UPGMA算法生成，根据脉冲场凝胶电泳谱80%的相似性定义了6个PFGE簇(A、B、C、D、E和F簇)。ICU，重症监护室。图1 25株产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11株脉冲场凝胶电泳图谱的树状图
CRKP作为一种超级细菌可导致医院感染，而ICU患者医院获得性感染的风险增加，特别是获得CRKP的风险增加。目前已知，CRKP容易定植在人体的胃肠道，其胃肠道定植和医院感染关系密切[1]。相关研究表明，肺炎克雷伯菌在住院患者的胃肠道定植率最高，达77%[1]。研究发现，人体的胃肠道不仅可以动态定植CRKP，而且CRKP在胃肠道的定植是其肠外感染的重要步骤[10]，胃肠道的定植率与随后的感染显著相关[4]。但产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11作为CRKP最流行的克隆，在ICU患者胃肠道的定植情况有待于进一步明确。
本研究发现，我院ICU患者胃肠道CRKP的定植率为24.2%，显著高于以色列医院患者的定植率(5.4%)[11]和ICU患者定植率(10.5%)[12]。研究发现，在ICU患者分离的CRKP定植菌中，90.0%为ST11菌株，这与河南省人民医院ICU入住患者分离的CRKP中84.4%为ST11阳性基本一致[13]，也与产KPC-2的CRKP-ST11菌株在医院内的播散情况一致[3]，表明ST11菌株是ICU住院患者胃肠道定植CRKP最主要的流行克隆。值得注意的是，本研究中分离出来的CRKP中，86.7%菌株产KPC-2，稍微低于浙江大学附属第二医院ICU中患者胃肠道中CRKP的KPC-2阳性率(95.3%)[10]和河南省人民医院的 KPC-2阳性率(98.6%)[13]，但总体而言，blaKPC-2基因在ICU患者肺炎克雷伯菌定植菌中的存在广泛，表明ICU患者胃肠道定植肺炎克雷伯菌主要为CRKP，其对临床多种抗菌药物耐药，这可能与该基因主要位于质粒[14]，容易在细菌中播散有关。
此外，我们发现，CRKP-ST11不仅对临床检测到的大部分抗菌药物都高度耐药，而且有很高的遗传同源性，表明该类细菌在我院不同ICU病区中存在着克隆播散，需要加强医院内感染防控措施的实施，以预防该类细菌在医院内，特别是ICU里面的播散和定植，以防爆发流行。
总之，产KPC-2肺炎克雷伯菌ST11在我院ICU住院患者的胃肠道中定植广泛，感染风险大，而且对临床用抗菌药物广泛耐药，需要加强院内感染控制措施，以预防其播散。
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