‘月月粉’月季NAC家族全基因组鉴定及皮刺发育相关成员的筛选

由玉婉，张雨，孙嘉毅，张蔚

‘月月粉’月季NAC家族全基因组鉴定及皮刺发育相关成员的筛选

由玉婉，张雨，孙嘉毅，张蔚

华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室/农业农村部华中都市农业重点实验室, 武汉 430070

从‘月月粉’月季全基因组中鉴定NAC家族成员，并进行生物信息学和表达模式分析，为研究‘月月粉’的潜在功能提供理论基础，筛选可能参与皮刺发育的候选基因。以拟南芥NAC氨基酸序列为参考，利用双向Blast及HMM结构域检索筛选RcNAC；
对筛选成员进行理化性质、亚细胞定位、序列特征、顺式元件和系统进化分析；
基于已释放转录组数据，分析在不同组织器官，和不同逆境处理条件下的表达特性；
同时通过‘月月粉’不同发育阶段皮刺组织转录组测序，筛选与皮刺发育可能相关的。共鉴定得到116个s，均含有完整典型的NAM保守结构域，其编码蛋白包含69—713个氨基酸，等电点从4.43—9.54，分子质量从7.87—79.99 kD，81个RcNACs被预测定位于细胞核内；
115个s在7条染色体上不均匀分布，1个未明确位置信息；
系统进化树分析将AtNACs、OsNACs和RcNACs聚为21类；
在不同组织器官中，116个s表达模式各异，遭受水胁迫和感染灰霉病之后，31个s表达量发生变化；
在衰老的花组织中，6个s表达量上升；
皮刺转录组数据中检测到53个s，其中26个s为差异表达基因。基于已有转录组数据分析，s协同调控植物组织发育及逆境胁迫响应；
结合皮刺转录组数据，部分成员可能参与皮刺细胞增殖、次生细胞壁生物合成及细胞程序性死亡等过程，可作为皮刺发育相关候选基因进行深入研究。

‘月月粉’；
NAC转录因子；
转录组测序；
皮刺发育

【研究意义】月季（sp.）是蔷薇科（Rosaceae）蔷薇属（L.）的一个重要类群，因其色彩绚丽、花型优美、花香馥郁，且连续开花，在世界各地被广泛种植和栽培，具有极高的观赏价值和经济价值。然而，月季茎杆多着生皮刺，对月季的田间管理、采后运输及园林应用等造成了极大不便，并带来了安全隐患。因此，培育无刺或软刺品种是月季育种的重要目标之一。对中国古老月季品种‘月月粉’（Old Blush）NAC家族基因进行全面的生物信息学分析和表达特性研究，有利于深入了解NAC家族基因的功能，并对月季品种的遗传改良具有重要的参考意义。【前人研究进展】已有研究表明，蔷薇属植物皮刺起源于表皮下的原分生组织，分为腺体型皮刺与非腺体型皮刺，依据皮刺是否有毛附着及是否分叉可进一步划分为5种亚类[1]，‘月月粉’皮刺为典型的非腺体型皮刺。转录因子（transcription factor）在基因表达过程中起着重要的作用，其中最常见的一类转录因子就是转录激活子和转录抑制子，这类转录因子与特定的DNA序列结合，在转录水平调控基因的相关表达[2]。ZHANG等[3]利用高通量测序手段，分析了有刺野蔷薇及无刺突变体间的差异表达基因，从而确定了可能与皮刺形成有关的关键基因和代谢途径。在这些差异表达基因中，一些与发育和次生代谢相关的转录因子基因，包括、、和等，在着生皮刺的节间部位表达明显上调。其中，NAC转录因子是植物特有的最大的转录因子家族之一，命名由（no apical meristem）、（transcription activation factor）、（cup-shaped cotyledon）3个基因的首字母缩写组成[4]，这3个基因在N端编码高度保守的蛋白序列，与DNA的结合能力相关，包含A—E五个亚域，蛋白C端具有多样性，其富含酸性氨基酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸等简单重复序列，与转录调控相关[5-6]。随着植物各基因组数据的释放，在拟南芥（）、水稻（）、棉花（spp.）等物种中都已鉴定出大量的[7-9]。研究表明，广泛参与植物生长发育进程，在植物种子发育、分生组织生长、次生壁和木质部的形成、根的生长以及植物的衰老过程中都起着重要的作用[10-15]，在黄瓜（L.）中，NAC转录因子还与黄瓜刺的形成及刺密度相关[16]。同时，在植物胁迫响应中发挥着重要的作用。的沉默增强了莴苣（）对假单胞菌的抗性，并且降低了植株在干旱胁迫下的萎蔫效应[17]；
在烟草中表达欧洲葡萄‘粉红亚都蜜’（Yatomo Rose），植株对干旱的耐受性降低[18]；
桃（L.）在低温胁迫处理下，16个表达量显著上调[19]；
番茄（）在响应铝胁迫时发挥重要作用[20]。以上研究表明，NAC家族成员广泛参与植物生长发育及各种防御反应。【本研究切入点】已在多个物种中被鉴定，并发现其发生不同程度的功能分化，但在‘月月粉’中尚未有NAC家族相关研究报道。目前，高质量的‘月月粉’双单倍体基因组信息已经公布[21-22]，为研究相关基因的功能及关系奠定了坚实的基础。【拟解决的关键问题】本研究利用生物信息学手段，鉴定‘月月粉’NAC基因家族，并系统分析‘月月粉’NAC家族的理化性质、基因结构、染色体定位及系统进化等，结合组织表达特异性、胁迫表达模式以及不同发育阶段皮刺转录组数据，为进一步研究的生物学功能，寻找可能与皮刺发育相关的，并应用于月季品种的遗传改良提供理论参考。

试验于2021年7至2022年3月在华中农业大学进行。

1.1 ‘月月粉’NAC家族成员鉴定及理化性质分析

在NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及蔷薇科基因组数据库（https://www.rosaceae.org）中分别下载获得拟南芥和‘月月粉’基因组序列及基因结构注释文件。在PlantTFDB数据库（http:// planttfdb.gao-lab.org/）[23]中下载拟南芥NAC蛋白ID，结合拟南芥基因组序列获得拟南芥NAC家族成员基因序列，使用TBtools[24]和NCBI中的Blast工具进行双向blast比对筛选，结合HMM结构域检索，初步得到候选s，利用在线网站NCBI-Batch-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）对候选RcNACs序列进行保守结构域分析，得到最终NAC家族成员。利用ExPASy（https://web. expasy.org/compute_pi/）分析RcNACs等电点和蛋白分子量等理化性质，使用WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）对RcNACs进行亚细胞定位预测。

1.2 ‘月月粉’NAC家族成员系统进化分析

在PlantTFDB数据库中下载水稻（subsp.）NAC氨基酸序列，使用MEGA X[25]对拟南芥、水稻和‘月月粉’中鉴定出的NAC蛋白的氨基酸序列进行多序列比对，并采用邻接法（Neighbor-Joining）构建进化树（bootstrap=1000）。利用iTOL[26]在线网站（https://itol.embl.de/）进行进化树美化。

1.3 ‘月月粉’NAC家族染色体定位、共线性分析、基因结构及保守基序分析

利用在线网站MEME（http：//meme-suit.org/index. html）对‘月月粉’NAC蛋白进行保守基序序列预测[27]。利用TBtools工具，基于‘月月粉’、拟南芥基因组序列进行共线性分析，并结合‘月月粉’基因组注释文件信息以及NCBI-Batch-CDD保守结构域分析结果，对s染色体定位、共线性结果、基因结构以及保守基序进行可视化展示。

1.4 ‘月月粉’NAC家族启动子顺式元件分析

结合‘月月粉’基因组注释文件，使用在线分析网站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）对s顺式作用元件进行分析，并利用TBtools进行可视化展示。

1.5 ‘月月粉’NAC家族成员表达分析

1.5.1 组织及诱导表达分析 利用RcNAC成员的氨

基酸序列在‘月月粉’参考转录组数据库（https://lipm- browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/）进行blast比对，获取并下载部分成员在幼叶和幼茎（FTN），水胁迫的植株叶片（FTS），感染灰霉病LR18的叶片（FTB），白色幼根（RAC），休眠的腋芽即营养分生组织（NDB），萌发的腋芽即营养分生组织（DBO），花分生组织转变时期的花芽（IFL），花分生组织和早期花器官包括萼片、花瓣、雄蕊和心皮（IMO），闭合的花（BFL），开放的花（OFT），衰老的花（SEN），雄蕊（DET），从授粉到色素积累早期的果实（CYN）组织中的表达数据[28]。利用TBtools工具绘制不同组织表达热图。

1.5.2 皮刺相关的筛选及qRT-PCR分析 以华中农业大学蔷薇科植物种质资源圃内保存的中国古老月季品种‘月月粉’为试材，采集其植株茎杆上4个不同发育阶段的皮刺。Stage I为柔软幼嫩、尚未木质化的皮刺，Stage Ⅱ为一定程度木质化、尖端开始向基部弯曲的皮刺，Stage Ⅲ为木质化较完全、形态基本成熟的皮刺，Stage IV为发育成熟、并初步开始衰老的皮刺（图1）。每个阶段的样本设置3个生物学重复，样品送至武汉博越致和生物科技有限公司进行转录组测序，建立皮刺不同发育时期基因数字表达谱，并根据TPM法计算基因表达量的结果。使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒（RN0902，艾德莱生物）提取4个阶段样本RNA，使用PrimeScript™ RT Reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（RR047A，TaKaRa）进行cDNA第一链的合成，供荧光定量使用。从转录组测序结果中选取10个基因，使用Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/）设计定量引物，内参基因为‘月月粉’，在QuantStudio™ 6 Flex荧光定量PCR仪（Thermo）上进行分析，每个阶段设置3个生物学重复，扩增体系共10 μL，含1 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，TB GreenII（RR820A，TaKaRa）5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，ddH2O 3 μL。反应程序为两步法：95℃预变性30 s；
95℃变性5 s，60℃退火/延伸34 s，40个循环。用参照基因的ΔCt法计算10个基因的表达量。

基于转录组数据，通过差异倍数（|log2(Fold change)|≥1）和显著水平（-value＜0.05）两个水平挑选出样品间的差异表达基因[29]，并对其中的进行统计与分析，利用TBtools软件绘制NAC家族基因表达热图，对在皮刺4个阶段转录组数据中高表达的进行qRT-PCR分析（引物信息见表1）。

Stage I：柔软幼嫩、尚未木质化的皮刺；
Stage II：一定程度木质化、尖端开始向基部弯曲的皮刺；
Stage III：木质化较完全、形态基本成熟的皮刺；
Stage IV：发育成熟、并初步开始衰老的皮刺

表1 qRT-PCR引物序列

2.1 RcNAC家族成员鉴定及进化分析

基于拟南芥基因组序列，从PlantTFDB数据库中获取138个拟南芥NAC家族成员氨基酸序列。根据‘月月粉’基因组序列文件以及基因结构注释文件，利用TBtools工具，对拟南芥和‘月月粉’基因组进行双向blast，并利用Pfam NAC家族结构域索取号进行HMM结构域检索。经过保守结构域分析，最终鉴定得到116个s，依据其在染色体上的位置，命名为—。为了获取RcNAC家族的系统发育关系，进一步探讨NAC家族的进化历史，利用MEGA X使用邻接法对116个RcNACs与138个AtNACs、170个OsNACs氨基酸序列构建进化树（图2）。依据亲缘关系远近，将这424个NACs划分为21个分支，依次命名为组A—U。AtNACs、OsNACs与RcNACs不均匀分布于进化树各分支中，在B分支中，只含有AtNACs，C分支中，只含有RcNACs，但两个分支亲缘关系较近，推测这两支NAC在拟南芥和‘月月粉’中可能参与调控不同的生物学进程。

图2 ‘月月粉’（红）、拟南芥（黑）、水稻（黑）NAC蛋白系统进化树

2.2 RcNAC家族基本信息

各进化树分支包含NAC数量差距较大，为1—25个。对116个NAC家族基因蛋白序列进行基本信息分析，其蛋白长度为69—713个氨基酸，等电点为4.43—9.78，分子质量为7.87—79.99 kD。亚细胞定位预测结果显示，多数RcNACs定位于细胞核中，还有部分定位于叶绿体、过氧化物酶体、高尔基体、内质网、液泡以及细胞膜上（表2）。

表2 ‘月月粉’NAC家族成员基本信息

2.3 RcNAC家族染色体定位、共线性分析与基因结构分析

‘月月粉’的116个s成员在7条染色体上不均匀分布（图3），1号染色体上最多，有31个s；
4号染色体上最少，仅有7个成员；
未注释到‘月月粉’7条染色体上，暂用Chr0表示。在116个s成员中，有6对串联重复基因，其中有3对分布在1号染色体上，2对分布在6号染色体上，1对分布在3号染色体上。对拟南芥和‘月月粉’基因组进行共线性分析（图4），结果表明，54个s与36个s存在共线性关系，其中，与、存在共线性关系，其余都只与一个存在共线性关系。整体上看，拟南芥5号染色体和‘月月粉’2号染色体含有最多数量的共线性基因，共有7组。

对s进行基因结构分析（图5），同一亚群成员内含子外显子模式大致相同，s成员内含子0—8个，所有的s成员都含有保守结构域NAM，分布在其蛋白序列N端。

研究表明，拟南芥中的NAC家族成员保守结构域中共包含A、B、C、D、E 5个亚域[5]。对鉴定出的RcNACs蛋白序列进行保守基序预测，分析并保留10个motif。同组RcNACs成员的motif在分布类型和分布顺序上基本相同。其中，motif 1（GFRFHPTDEELVSYY）与亚域A，motif 4（IIPEIDLYKYEPWDLPEKAKI）与亚域C，motif 6（EWYFFTPRDRK）以及motif3（YPNGTRTNRATGSGYWKA）与亚域B，motif 5（ISGSKKVIGMKKTLVFYKGRA）以及motif2（PKGQKTBWVMHEYRL）与亚域D，motif 7（DDWVLCRLFKK）与亚域E序列相似，有62个RcNACs包含这全部7个motif，且在RcNAC050中有重复的NAC完整基序。motif 9与motif 10分布在序列C端，猜测与RcNAC的转录调控功能相关。

2.4 RcNAC启动子顺式作用元件分析

利用PlantCARE对s上游2 000 bp序列中的顺式元件进行分析预测（图6），结果表明，除了启动子和增强子区域常见的顺式作用元件外，s启动子上还具有不同数量的光响应元件、厌氧诱导元件、干旱响应元件、低温应答元件、分生组织调控元件，以及响应不同植物激素（脱落酸、赤霉素、生长素、茉莉酸甲酯、水杨酸）等多种特异性顺式作用元件。

图3 RcNACs在染色体上的分布

图4 RcNACs 与AtNACs共线性分析

图5 ‘月月粉’NAC蛋白保守基序预测及保守结构域分析

图6 RcNACs启动子顺式作用元件分析

2.5 RcNAC家族成员组织及诱导表达分析

使用RcNACs氨基酸序列在月季转录组数据库[28]中进行比对，得到其中42个成员在‘月月粉’13个不同组织样本中的转录组RPKM数据，绘制热图并进行分析（图7）。结果显示，除外，其余40个成员均在一个或多个样本中表达。

叶片经胁迫处理（FTS、FTB）后，相比于对照组（FTN），有31个NAC成员的表达量有明显变化，且14个成员在FTS中的表达量高于它们在其他12个组织中的表达量。其中，在FTS、FTB组织中表达量上调变化最为显著，在感染灰霉病的植株叶片中表达量下降明显。

Rosa-FTS：水胁迫的植株叶片；
Rosa-FTB：感染灰霉病LR18的叶片；
Rosa-FTN：幼叶和幼茎；
Rosa-RAC：白色幼根；
Rosa-NDB：休眠的腋芽即营养分生组织；
Rosa-DBO：萌发的腋芽即营养分生组织；
Rosa-IFL：花分生组织转变时期的花芽；
Rosa-IMO：花分生组织和早期花器官包括萼片，花瓣，雄蕊和心皮；
Rosa-BFL：闭合的花；
Rosa-OFT：开放的花；
Rosa-SEN：衰老的花；
Rosa-DET：雄蕊；
Rosa-CYN：从授粉到色素积累早期的果实

在不同组织和器官中，不同成员的表达水平有明显差异。在FTN，在NDB、SEN、CYN，在RAC、IFL、BFL、OFT、DET，在DBO、IMO组织中相对于其他NAC成员高表达，其中，在FTN中表达量较高，其他成员表达量略低；
在花器官的不同发育阶段组织（IFL、IMO、BFL、OFT、SEN）中，检测到35个NAC成员在一至多个阶段表达，、、、、、在花器官发育后期高表达，整体表达量呈上调趋势，在花发育5个组织中持续稳定高表达，这些成员可能参与调控花器官的生长发育进程；
、只在早期花器官中表达，、只在闭合的花中表达，猜测其在花器官发育特定阶段行使功能。

2.6 皮刺相关RcNAC筛选及表达分析

根据月月粉不同发育阶段皮刺转录组中表达量绘制热图，其中63个成员因其表达量过低未纳入分析，基于剩余53个成员在皮刺中的表达量的TPM值绘制热图（图8-a），对各表达模式进行聚类分析，共聚为4组七7个亚组。其中，组只包含，其在Stage Ⅰ中高表达；
组在各阶段相对平稳表达，-1成员在各阶段表达量在50—110，-2成员在各阶段表达量在0—50，其中有少数基因在Stage Ⅰ或Stage Ⅳ中表达量相对Stage Ⅱ和Ⅲ较高；
组成员在Stage Ⅳ中高表达，-1成员表达量高于200.00，-2表达量约100.00；
组成员在皮刺多个发育阶段高表达。

从中筛选不同发育阶段皮刺差异表达，共有26个。Stage I—Ⅱ有11个基因差异表达，10个在Stage Ⅱ下调，1个上调；
Stage Ⅱ—Ⅲ中有5个基因差异表达，全为上调；
Stage Ⅲ—IV中有18个基因差异表达，全为上调（图9），此18个上调基因包含Stage Ⅱ—Ⅲ中的5个差异基因。分析各差异基因在不同皮刺发育阶段表达量趋势变化（图8-b），、、、整体呈上升趋势，在Stage Ⅲ—Ⅳ阶段上调趋势最为明显，猜测这些基因与皮刺的硬化与木质化程度可能息息相关；
、、、、在4个阶段表达较稳定，在Stage Ⅰ和Stage Ⅳ略高，各阶段表达量未超过5.00；
在Stage Ⅰ—Ⅱ呈下调趋势，可能与Stage Ⅰ中皮刺细胞的增殖有关，在Stage Ⅱ—Ⅳ呈上升趋势，猜测其也参与了皮刺后期木质化阶段；
、、、变化趋势相同，在Stage Ⅰ高表达，Stage Ⅱ表达下降，之后稳定表达，其中在Stage Ⅰ表达量为126.82，在Stage Ⅱ下降为23.34，其在皮刺前期细胞增殖过程中可能行使一定功能；
其余12个差异表达基因在Stage Ⅰ—Ⅲ表达较为平稳，在Stage Ⅲ—Ⅳ呈上调趋势，推测这些基因可能参与调控皮刺木质化及细胞程序性死亡。

2.7 皮刺转录组相关基因的qRT-PCR验证

在皮刺转录组数据随机选取8个基因进行qRT-PCR分析，其中包含3个NAC家族基因，1个三酰甘油脂肪酶基因，1个谷胱甘肽转移酶基因，以及WRKY、bHLH、Expansin家族基因各1个。结果显示，各基因qRT-PCR结果与皮刺转录组数据计算结果相符，说明转录组数据较准确可靠（图10-a）。此外，选取皮刺转录组中NAC家族及-1组中7个s进行qRT-PCR分析，结果如图10-b所示，其中的qRT-PCR分析结果与转录组数据差异较大，其余6个s qRT-PCR分析结果与转录组数据相符。

3.1 NAC家族基因在不同物种间具有一定保守性

本研究基于s对月月粉基因组数据进行分析，共鉴定出116个s，与苹果（）中鉴定得到的180个[30]，沙梨（）中185个[31]，海滨木槿（Sieb. et Zucc）中182个[32]s相比，基因数目较少；
与杉木（）中鉴定得到的45个[33]，毛竹（）中94个[34]s相比，基因数目略多；
与桃中119个[19]s数量相近。由此可见，在不同的物种之间的数量有明显差异，同科物种数量差异也较大，推测这与物种进化和基因组复制相关。对RcNAC蛋白序列进行分析，有62个RcNACs蛋白包含完整的5个亚域（A—E），说明NAC在不同物种中的序列保守性较高。

3.2 RcNAC参与调控‘月月粉’胁迫应答及生长发育

有研究表明，在经过盐、干旱和脱落酸处理后，表达量显著上调[35]；
敲除后，降低了水稻对脱落酸的敏感性，但是提高了水稻对盐胁迫的敏感性[36]；
在干旱胁迫和复水后，部分基因的表达量出现变化[37]。本研究对‘月月粉’不同组织中s表达量进行分析，在FTS组织中，14个s表达量上调，推测这些基因在‘月月粉’响应水分胁迫过程中发挥作用，这与前期的研究结果一致。以往研究显示，NAC转录因子在花器官发育及开花调控中发挥重要作用[38]，本研究中多个s在花器官的不同发育阶段表达量发生显著变化，推测这些基因在‘月月粉’花器官发育过程中发挥重要作用。另外，牛早柱等[39]研究发现，4个s在葡萄果实成熟过程中发挥重要作用；
Martín-Pizarro等[40]研究表明，草莓NAC转录因子FaRIF是草莓果实成熟早期的关键调节因子。在‘月月粉’CYN组织中，和高表达，推测这些基因在‘月月粉’果实成熟过程中行使一定功能。

图8 ‘月月粉’NAC基因在不同发育阶段皮刺中的表达量热图

图9 ‘月月粉’不同发育阶段皮刺差异表达NAC数量

3.3 RcNAC参与调控‘月月粉’皮刺发育

在月季[41]和野蔷薇[3]中，皮刺的发育伴随着木质素、花青素、类黄酮等物质的积累。‘月月粉’在Stage Ⅱ—Ⅲ中木质素不断积累至完全，结合进化树与4个阶段皮刺转录组数据，在‘月月粉’皮刺转录组Stage Ⅰ—Ⅲ阶段高表达，qRT-PCR分析其在Stage Ⅰ和Stage Ⅳ相对表达量较高。与（）的进化距离较近，通过负调节次生细胞壁纤维合成和细胞程序性死亡来影响管状分子和木质部发育。过表达导致木质部导管缺失和管状分子标记基因表达很少或不表达[42]，推测在‘月月粉’皮刺发育过程中调节木质化的进程，在皮刺发育初期是否也发挥一定作用需要进一步验证。与旁系同源的在皮刺转录组中未检测到表达，其是否在皮刺发育中发挥作用有待进一步研究。在Stage Ⅳ中表达上调，与（）为同源基因，在拟南芥次生细胞壁合成中发挥作用[43]，且在毛果杨中的同源基因通过调节木质素、纤维素合成的关键基因来调控次生壁组织合成[44]，是否在皮刺细胞的次生壁合成过程中发挥作用需要进一步验证。在Stage Ⅰ—Ⅳ中整体表达呈上升趋势，研究表明，其同源基因（）在花瓣和雄蕊发育后期表达，在叶片衰老期间上调[45]，且调控拟南芥角果衰老[46]，这与‘月月粉’皮刺发育阶段和SEN组织中的表达模式相同，猜测与皮刺衰老进程相关。在Stage Ⅰ高表达，为中极少数在皮刺发育前期高表达的基因，qRT-PCR分析进一步证实其在Stage Ⅰ相对表达量较高，其是否在皮刺发育早期行使重要功能？、、和在皮刺发育各个阶段的表达量均较高，其相似的表达模式是否暗示其功能的冗余，这些问题还有待深入研究。

本研究在‘月月粉’全基因组中鉴定出116个s，不均匀分布在7条染色体上，均具有NAM保守结构域，系统进化树将RcNACs分为21类。多数s在遭受水分胁迫或灰霉病感染的叶片组织中表达量发生显著变化；
在皮刺发育进程中，绝大多数成员中后期表达显著，这些基因可能主要参与皮刺木质化及细胞程序性死亡等相关进程。、、和在皮刺发育多个阶段高表达，在皮刺StageⅠ中高表达，可作为皮刺形态发生和发育相关重点候选基因。

a：转录组随机挑选基因的qRT-PCR分析；
b：NAC家族δ及γ-1组中7个RcNAC的qRT-PCR分析

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Genome-Wide Identification of NAC Family and Screening of Its Members Related to Prickle Development inOld Blush

YOU YuWan, ZHANG Yu, SUN JiaYi, ZHANG Wei

College of Horticulture & Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education/Key Laboratory of Urban Agriculture in Central China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430070

This study was designed to identify thegene family inOld Blush and to analyze the sequences characteristics and expression pattern ofs to reveal the biological functions ofs, which also provided an important foundation to explore the role ofs in prickles.The BLATP and HMMER search were conducted to identify NAC proteins inOld Blush using the sequences of NAC proteins of. Physical and chemical properties, subcellular location, structure and phylogenetic relationship of each gene were further analyzed. Based on the released transcriptome data, the expression characteristics ofs in different tissues and organs under different stress conditions were analyzed. What’s more, the technology of RNA-seq was used to screengenes that might be related to the prickle development.In this study, 116genes fromOld Blush genome were identified and characterized. Theses genes encoded proteins containing 69 to 713 amino acids, with the theoretical isoelectric points ranging from 4.43 to 9.54 and the molecular weight ranging from 7.87 to 79.99 kD. The prediction of subcellular localization showed that 81s were located in the nucleus. Moreover,s were unevenly distributed on 7 chromosomes. According to phylogenetic relationships, AtNACs, OsNACs and RcNACs were clustered into 21 groups. These 116s were differentially expressed in various tissues and organs, and the expression levels of 31 members changed in response to abiotic and biotic stresses. Furthermore, in the RNA-seq data of prickles, 53s were detected, among which 26 members were differentially expressed genes.This study demonstrated thats were involved in the regulation of plant development and stress responses. Some members might be involved in the processes of prickle cell proliferation, secondary cell wall biosynthesis, and programmed cell death, which could be selected as candidate genes related with prickle development for further study.

‘Old Blush’; NAC transcription factor; transcriptome sequencing; prickle development

2022-03-04；

2022-04-24

国家自然科学基金（32072617）

由玉婉，E-mail：1797435616@qq.com。通信作者张蔚，E-mail：zhangw@mail.hzau.edu.cn

（责任编辑 赵伶俐）

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