彩虹明樱蛤染色体制备及核型分析
时间：2023-02-15 09:20:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
冯森磊，任国梁，甘树胜，梁夏菲，段海宝，葛红星，董志国
( 江苏海洋大学，江苏省海洋生物技术重点建设实验室，江苏 连云港 222005 )
彩虹明樱蛤(Moerellairidescens)俗称海瓜子，是沿海地区的一种经济贝类，属帘蛤目樱蛤科明樱蛤属。因其个体大小和形状与食用瓜子相似而得名。其味道鲜美，营养丰富[1]，主要分布于西太平洋沿岸和澳大利亚北部，在我国主要产于浙江和福建沿海等地[2]。
染色体是染色质的一种形态，易被碱性染料染色，具有一定形态及结构特征，它主要由DNA和蛋白质组成，是遗传信息的载体，具有储存和传递遗传信息的功能[3]。染色体作为细胞中重要的遗传物质，其结构和功能一直是细胞遗传学的重点研究内容。核型是染色体在细胞有丝分裂中期的表型，能反映出染色体的数目、大小、形态等特征[4]。帘蛤目是双壳贝类中的一个大类群，在我国常见的帘蛤目种类有60余种。据不完全统计，截至2014年，我国对软体动物种类的染色体核型分析已报道81种，其中双壳类52种，对帘蛤目染色体的研究有19种，其中帘蛤科9种，蛤蜊科4种，竹蛏科3种，刀蛏科2种，紫云蛤科1种[5]。段海宝等[6]研究发现，青蛤(Cyclinasinensis)二倍体与单倍体数目分别是2n=38和n=19，核型组成为2n=11m+6sm+2st；
杨品红等[7]对三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)的研究结果显示，其染色体中的绝对长度较小，二倍体数目为2n=38，核型为2n=12m+5sm+2st，臂数为NF=72；
蔡岩等[8]研究表明，法螺(Charoniatritonis)染色体二倍体数2n=70，核型为2n=32m+18sm+20st，NF=120。而有关樱蛤科种类的染色体研究尚未见报道，笔者通过染色体制片获得清晰的染色体分裂相，对彩虹明樱蛤的染色体核型进行分析，探明其染色体数目及核型组成，有助于从染色体方面为彩虹明樱蛤的遗传生化的进一步研究提供理论依据，同时也可为彩虹明樱蛤在贝类中的系统分类地位以及系统演化过程提供一定参考依据。
1.1 试验材料
试验材料选自浙江宁波的彩虹明樱蛤成贝，将彩虹明樱蛤置于实验室进行养殖，水体充氧，保持良好水质，定期投喂微藻，以保证彩虹明樱蛤的正常生理状态。
1.2 试验方法
参考文献[9]的方法，并根据试验中实际情况稍作改良，选取彩虹明樱蛤成贝中的鳃瓣外缘组织作为材料，置于提前配制好的含有0.06%秋水仙素的过滤海水中，处理30 min。经秋水仙素预处理后，通过溶液低渗40 min，加入8 mL配制好的预冷卡诺固定液[V(甲醇)∶V(冰乙酸)=3∶1]固定，反复固定3次，每次15 min，总固定时间为1 h，倒掉卡诺固定液，用镊子将鳃组织移入1.5 mL离心管，加入1 mL的50%冰乙酸，制备细胞悬液，热滴片法滴片，温度为56 ℃，配制10%的吉姆萨染液[9∶1(体积比)]，染色30 min，自然晾干，镜检。
1.3 彩虹明樱蛤染色体计数与核型分析
1.3.1 核型分析
选取分散好、形态完整的染色体中期分裂相，显微拍照并利用Nikon NIS-Elements BR 3.1软件测量染色体绝对长度。使用Office 2019进行数据整理，并计算相对长度和臂比。利用Photoshop软件提取每条染色体，数据以平均值±标准差表示。根据Levan等[10]提出的染色体分类标准进行染色体类型分类，然后进行配对，统计结果，绘制染色体核型图。
1.3.2 数据分析
分类：根据臂比的大小可以确定染色体属于哪种形态类型(表1)。
表1 染色体类型按臂比值分类
配对：根据测量数据，即染色体相对长度、臂比、染色体的性状和大小等进行同源染色体的配对。
染色体臂数(NF)：m、sm、st类型的染色体臂数计为2，t类型的染色体臂数计为1。
相对长度为实测长度占全部染色体长度总和的百分比；
臂比为长臂长度与短臂长度之比。
2.1 彩虹明樱蛤染色体数目
选取30个分裂相较好的中期分裂相染色体视野(图1)，统计染色体的数目并计算其百分比。其中2n=36占比最高，为46.67%；
2n=34占比为20.00%，而2n为其他数量的所占比例均<10%(表2)。试验结果显示，彩虹明樱蛤染色体众数为2n=36。
图1 彩虹明樱蛤中期分裂相染色体Fig.1 Metaphase chromosome of the clam M. iridescens
表2 彩虹明樱蛤染色体数目统计
2.2 彩虹明樱蛤染色体核型分析
在彩虹明樱蛤的染色体标本中，选取10个分散好、形态正常的染色体中期分裂相进行测量，计算其相对长度和臂比的结果(表3)，通过对比分析进行配对(图2)。
表3 彩虹明樱蛤染色体相对长度、臂比以及类型
图2 彩虹明樱蛤中期分裂相染色体及核型Fig.2 Metaphase chromosome and karyotype of the clam M. iridescensa.中期分裂相染色体；
b.染色体核型.a.metaphase chromosomes；
b.karyotype of chromosome.
通过比较总结得出，彩虹明樱蛤的18对染色体中，有4对中着丝粒染色体(m)、8对亚中着丝粒染色体(sm)、6对亚端着丝粒染色体(st)。染色体核型为2n=8m+16sm+12st，NF=72，染色体总长度为83.10 μm，未发现性染色体和随体。
3.1 贝类染色体制片
在制备染色体的过程中，有很多处理因素都可能会造成染色体不同程度的收缩，所测得的染色体长度往往不能真实反映染色体的长度特征，但各染色体的臂比和相对长度等，则能体现出染色体的特征[10-11]。利用Photoshop软件进行图像清晰化和抠图处理，结合臂比和相对长度以及染色体形态等特征，进行同源染色体配对，可以得到较为清晰的染色体核型图。目前制备贝类染色体的材料，大多采用的是贝类早期胚胎、生殖腺、担轮幼虫及鳃组织等[12]。蔡明夷等[13]选取波纹巴菲蛤(Paphiaundulata)担轮幼虫为材料，采用滴片法成功制出波纹巴非蛤的染色体，染色体数目为2n=38；
周琳等[14]取魁蚶(Scapharcabroughtonii)孵化后的担轮幼虫为材料采用滴片法制出其染色体，染色体数目为2n=38；
于瑞海等[15]选取活的等边浅蛤(Macridiscusaequilatera)中鳃为组织材料，采用滴片法制取出染色体，染色体数目为2n=36；
周丽青等[9]通过调节水温，选取鳃丝及鳃丝对应部位创面的愈合增生组织为材料，采用热滴片法制出栉江珧(Atrinapectinata)染色体，染色体数目为2n=34。以早期胚胎和担轮幼虫为材料可以更容易获得染色体分裂相，这是因为此时细胞处于生长旺盛时期，分裂能力强，更容易看到染色体分裂相。但利用胚胎和担轮幼虫制备染色体，会受到季节的限制，而利用鳃组织则不受季节限制，细胞分裂会相对较少[15]。对于分裂相较少的情况，一般采用植物血球凝集素进行预处理，可以有效增加细胞分裂[16]。此外，利用鳃组织制备染色体成为了一种重要手段，并在多种贝类如紫贻贝(Mytilusgalloprovincialis)、栉孔扇贝(Chlamysfarreri)等贝类中取得了成功[17-18]。染色体制片的流程一般是预处理—低渗—固定—解离—滴片—染色，然后得到清晰的染色体分裂相。在本试验中，以彩虹明樱蛤成贝鳃组织为材料，制备染色体标本，分别采用0.02%、0.04%、0.06%、0.08% 4个不同质量分数梯度的秋水仙素溶液处理鳃组织，处理时间为40 min。从制片效果看，以质量分数0.06%最适，质量分数0.02%、0.04%处理的染色体分裂相少，质量分数0.08%处理的染色体收缩、聚集、分散不好，无法计数，而在0.065 mol/L KCl溶液下处理40 min低渗效果最佳，0.045 mol/L KCl溶液低渗效果不理想，细胞形态易发生畸形。预试验结果表明，秋水仙素质量分数的高低和处理时间的长短都会影响到染色体形态，低渗时间过短会导致细胞形态发生畸形，过长则会导致细胞膜破裂，导致染色体丢失。
3.2 彩虹明樱蛤染色体核型特征及其进化规律
本试验表明，彩虹明樱蛤的染色体数目为2n=36，这与等边浅蛤的染色体数目相同[15]，而与大多数的帘蛤目种类染色体数目不同，帘蛤目种类染色体数目大多为2n=38[5]。从染色体数目来看，彩虹明樱蛤和等边浅蛤(2n=36)有着较亲密的亲缘关系。Nakamura等[19-20]认为，原始双壳贝类染色体数目可能是2n=38。贝类在核型进化过程中，主要有两个方向，一个是染色体数目的增加，一个是染色体数目的减少。目前相关研究表明，双壳贝类染色体数目减少是比较常见的类型，比如大獭蛤(Lutrariamaxima)和中国紫蛤(Sanguinolariachinensis)的染色体数目分别为34和30条[21-22]，而有关染色体数目增加的种类还未有报道。已知的帘蛤目染色体数目多为2n=38，而2n=30或2n=34可能是进化过程中染色体数目减少的类型，2n=36可能是进化过程中的中间过渡类型[5]。笔者制备染色体的材料是成体鳃组织，在得出的染色体分裂相中，存在少于正常条数的染色体数目，这可能是由于在制片过程中出现染色体丢失或者聚集等情况。同时，有丝分裂发生异常也会造成非整数倍体等异常现象，导致所得到的分裂相与正常染色体数目不同。本试验结果显示，在彩虹明樱蛤的18对同源染色体中，有4对为中着丝粒染色体(m)，8对为亚中着丝粒染色体(sm)，6对亚端着丝粒染色体(st)，m和sm类型染色体占2/3。这与大多数贝类的染色体核型组成相似，以m和sm类型染色体为主[5]，Ahmed[23]研究表明，m和sm染色体组型一般具有稳定性，而t和st染色体较多变。在彩虹明樱蛤的染色体中，中部和亚中部比值是：m/sm=4/8，因此在樱蛤科中彩虹明樱蛤的染色体进化过程比较保守，表明其有稳定的细胞学特征。m/sm着丝粒染色体核型比例比st/t型更高时，生物进化程度更为高级或特化[24]。同时比较彩虹明樱蛤和缢蛏(Sinonovaculaconstricta)中的染色体组型发现[23]，彩虹明樱蛤没有端部着丝染色体，其可能比缢蛏进化程度更为高级。然而，对文蛤(Meretrixmeretrix)染色体的研究发现，文蛤没有t或st型[25-26]，表明文蛤可能比彩虹明樱蛤进化程度更为高级。
试验结果表明，彩虹明樱蛤染色体数目为2n=36，染色体核型公式为2n=8m+16sm+12st，未发现性染色体和随体。从制片效果来看，选取繁殖前期具有较强分裂能力的彩虹明樱蛤鳃组织作为制备染色体材料，采用质量分数0.06%的秋水仙素进行预处理40 min，0.065 mol/L的KCl溶液低渗40 min，更易获得清晰的中期染色体分裂相。
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