婴儿配方奶粉中二十碳四烯酸的测量不确定度评定
时间：2023-02-12 22:15:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
葛萃萃，王文祥，吴曙霞，张惠君，王 潇，秦芸桦，王 静
1 浙江公正检验中心有限公司，浙江杭州 310009
2 赞宇科技集团股份有限公司，浙江杭州 310009
3 中国检验认证集团澳新分公司，悉尼-奥克兰 2220
母乳是母亲为婴儿提供所需全部营养的最佳食物。在人生最初阶段，婴儿通过母乳摄入充分的能量和营养对生长发育至关重要。当母亲由于种种原因无法提供充足的母乳时，婴儿配方奶粉就成为了最好的替代品。婴儿配方奶粉通过添加各种营养物质模拟母乳以实现与母乳组成成分高度相似。二十碳四烯酸（C20:4n-6），俗称花生四烯酸（Arachidonic Acid，ARA）是婴儿生长发育的必需脂肪酸之一，具有帮助脑部神经发育、参与造血与免疫调节、促细胞分裂等一系列生理活性[1，2]。依据《GB 10765—2021 食品安全国家标准 婴儿配方食品》，ARA的最大添加值为19.1 mg/100 kJ[3]，和欧盟、澳大利亚和新西兰等国家一致[4]，同时，也是婴儿配方奶粉可选择性成分食品安全的必检项目[5]。
测量不确定度是表征测量结果准确度的重要指标，在食品检验中得到了广泛的应用和发展[6]。分析和评定测量不确定度可以发现影响检测结果的关键步骤，进而通过改善和优化关键步骤进一步提高检测结果的准确度。对于影响婴儿配方奶粉中ARA等油脂检测结果不确定度的主要来源多数具有共识，重复性检测十分必要，但对于次要来源存在一定分歧。本文采用《GB 5009.168—2016食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》第二法乙酰氯-甲醇法甲酯化（外标法）[7]，区别于第一法（内标法），结合《JJF1059.1—2012 测量不确定度的评定与表示》中规定的基本程序[8]，对采用气相色谱法测定婴儿配方奶粉中ARA检测结果进行了不确定度分析。通过分析不确定度来源的各因素对ARA检测结果的偏移，尤其关注次要来源对检测结果的影响，旨在为进一步提升检测结果的可靠性提供具体建议和参考。
1.1 材料试剂
婴儿配方奶粉，市售澳大利亚DEVONDALE；
ARA甘油三酯标准品，Merck公司；
乙酰氯（分析纯），西亚化学公司；
无水碳酸钠（分析纯），西陇科学公司；
甲醇（色谱纯）, Merck公司；
甲苯（色谱纯），Merck公司。
1.2 仪器设备
气相色谱仪配氢火焰离子检测器GC-2010 plus，岛津制作所；
SP-2560聚二氰丙基硅氧烷色谱柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），Merck公司；
XP-205电子天平，Sartorius公司；
组织粉碎机，IKA公司；
旋涡混匀仪，上海雷磁公司；
电热恒温水浴锅，上海博迅公司；
离心机，Beckman Coulter公司。
1.3 分析步骤
称取婴儿配方奶粉0.5015 g试样于螺口玻璃管中并加入5 mL甲苯混匀，再加入10%乙酰氯甲醇溶液6 mL，充氮气后旋紧螺旋盖。振荡混合置于80 ℃水浴锅2 h，期间每20 min振摇1 次，水浴后冷却至室温。将玻璃管中样液完全转移至50 mL离心管中，并分别用3 mL碳酸钠溶液清洗玻璃管3 次合并转移后混匀，5 000 r/min离心5 min，分离上清液后气相色谱仪测定。
1.4 色谱条件
载气：氮气；
程序升温：初始温度100 ℃，持续13 min；
100～180 ℃，升温速率10 ℃·min-1，保持6 min；
180～200 ℃，升温速率1 ℃·min-1，保持20 min；
200～230 ℃，升温速率4 ℃·min-1，保持10.5 min；
进样口温度：270 ℃；
检测器温度：280 ℃；
进样方式：分流进样，分流比=100∶1；
进样量：1.0 μL。
2.1 影响量化不确定度的主要来源
2.1.1 相关检测过程
2.1.1.1 不确定度ur（x1） （源于样品总重复性）
2.1.1.2 标准不确定度ur（x2） （源于标准物质）
2.1.1.3 标准不确定度ur（x3） （源于样品）
2.1.1.4 标准不确定度ur（x4）（源于仪器设备）
2.1.2 不确定度传播律
由于检测函数为非线性，将泰勒级数展开成为近似线性的模型，采用以下相对不确定度合成公式：
2.2 量化不确定度分量
2.2.1 标准不确定度分量ur（x1）（源于样品总重复性）
ur（x1）包括：检测人员和设备，检测地点和当时环境条件等产生的不确定度，全覆盖影响检测结果精密度的因素。按GB 5009.168-2016要求，对同一样品开展实验室内比对，检测结果见表1。
表1 样品重复测定结果
ARA含量测定单次标准偏差
按标准要求重复两次取算术平均值作为ARA含量，故测定重复性产生的标准不确定度分量为：
2.2.2 标准不确定度分量ur（x2）（源于标准物质）
2.2.2.1 不确定度分量ur（x2.2.2.1）（源于标准物质含量）
ARA甘油三酯标准品证书信息表明ARA甘油三酯标准品扩展不确定度为U=0.5%，k=2。
按正态分布（纯度99%）：
2.2.2.2 不确定度分量ur（x2.2.2.2）（源于标准物质称量）
天平称量ARA甘油三酯标准品重量m=0.0168 g，天平校准证书表明测量结果示值误差的扩展不确定度U=0.02 mg，k=2，属正态分布。标准不确定度为：
相对标准不确定度为：
2.2.2.3 不确定度分量ur（x2.2.2.3）（源于溶液定容过程）
50 mL 单标线容量瓶（A级）产生的不确定度是溶液定容过程中不确定度的主要来源。
标准不确定度ur（x2.2.2.3.1）（源于50 mL 容量瓶校准）：v=50 mL 单标线容量瓶校准证书表明50 mL 单标线容量瓶属于A级，测量结果扩展不确定度U=0.03 mL，k＝2，属正态分布。
标准不确定度为：
相对标准不确定度为：
标准不确定度ur（x2.2.2.3.2）（源于溶液与校准温度差异）：溶液与校准温度的差异为±5 ℃，容量瓶体积为50 mL。甲苯体积膨胀系数为（1.08×10-3）/℃，甲苯体积膨胀显著大于玻璃体积膨胀，故只考虑甲苯体积膨胀因素，按矩形分布取k=
标准不确定度为：
相对标准不确定度
合成相对标准不确定度ur（x2.2.2.3）（源于50 mL单标线容量瓶）：
由以上不确定度结果综合计算：ARA甘油三酯标准物质产生的相对标准不确定度为：
2.2.3 标准不确定度ur（x3）（源于婴儿配方奶粉样品）
2.2.3.1 不确定度ur（x3.2.3.1）（源于样品称量）
天平称量样品重量m=0.5083 g，天平校准证书显示测量结果示值误差的扩展不确定度U=0.02 mg，k=2，属正态分布。
标准不确定度为：
相对标准不确定度为：
2.2.3.2 不确定度ur（x3.2.3.2）（源于样品定容）
样品与标准物质定容过程产生的不确定度相同，均为0.31%。
由分析综合计算：婴儿配方奶粉样品产生的相对标准不确定度为：
2.2.4 不确定度ur（x4）（源于气相色谱仪）
由于仪器设备性能因素的影响属A类评定，故对同一样品开展重复实验，检测结果见表2。
表2 重复进样峰面积的测量值
单次检测结果标准偏差:
标准不确定度为：
相对标准不确定度为：
2.2.5 合成标准不确定度评定
根据以上结果，综合评定合成标准不确定度为:
2.3 扩展不确定度评定
合成标准不确定度乘包含因子得到扩展不确定度：置信概率p=95%，k=2，故婴儿配方奶粉样品中ARA 含量检测扩展不确定度为：U95=k×ucr（x）=2×2.73%=5.46%
2.4 报告与表示测量不确定度
由上述结果表述婴儿配方奶粉样品ARA 含量：检测结果为（0.264±0.007）g，k=2，即95%可能性为0.257～0.271 g。
2.5 测量不确定度的结果与讨论
通过对检测婴儿配方奶粉样品ARA含量的不确定度分量进行定量分析，利用相对标准不确定度开展分布计算和整体合成，综合评定得到：合成不确定度为2.73%，扩展不确定度为5.46%。检测婴儿配方奶粉样品中ARA 含量为（0.264±0.007）g，95%可能性为0.257～0.271 g。本文不确定度的评定结果表明，影响检测婴儿配方奶粉样品中ARA含量（外标法）的不确定度主要来源于样品重复测定（分量不确定度2.68%），其次为标准溶液配制（分量不确定度0.40%）和样品处理（分量不确定度0.31%），气相色谱仪器（分量不确定度0.00002%）影响最小。
李永凯等[9]采用气相色谱内标法检测裂殖壶菌培养物中二十二碳六烯酸（DHA）含量的评定结果表明，重复测定引起的分量不确定度（1.12%）是称量环节（0.0058%）的193倍，标准溶液配制、内标添加量、回收率、校正因子等分量不确定度介于0.15%～0.58%。张方圆等[10]采用气相色谱内标法检测婴儿配方奶粉中ARA和DHA，将样品的重复性测定及检测定量误差作为同一不确定度来源分析，在各影响因素中相对标准不确定度最高（0.0173%），其次为前处理过程及仪器波动、重现性等引起的不确定度0.00612%。与此不同，陈蕊等[11]在检测调制乳中环己基氨基磺酸钠的测量不确定度评定过程中引入了标准曲线拟合和方法回收率引起的不确定度来源，两者的影响程度仅次于对测量结果的不确定度影响最大的分量重复测定。张喜金等[12]利用气相色谱法测定藻油中DHA含量不确定度评定时得出最大分量为标准溶液和样品溶液配制（各为0.6%），重复性分量仅为0.3%。作者认为气相色谱检测脂肪酸采用的前处理方法繁琐复杂，无论是内标法还是外标法，人为操作的及时准确性对检测结果的显著影响多数已达成共识，重复检测的必要性毋庸置疑。但不确定度来源的次要因素存在着较大差异，作者经过ARA含量的不确定度主要来源比较和综合分析认为，标准溶液配制的重要程度超过除重复性检测的其余不确定度来源，其微小差异对检测结果的可靠性影响较大，建议在配制标准溶液时采用专人专区专用具，避免对检测结果可靠性的较大影响。样品处理过程产生的不确定度通过规范操作动作和习惯来降低对可靠性的影响。标准曲线拟合和方法回收率以及气相色谱等仪器引起的不确定度影响较小，周期性关注即可。
无论内标法还是外标法检测婴儿配方奶粉中ARA含量，检测过程中人为操作带来的不确定度对检测结果准确性影响最大，重复检测的必要性毋庸置疑。此外，标准溶液配制和样品处理过程产生的不确定度有必要通过必要手段来降低其对检测结果可靠性的影响。为提高检测婴儿配方奶粉中ARA含量的准确度，通过样品重复检测、专人专区专用具配制标准溶液、样品处理过程中规范操作动作和习惯，多项措施共同实施具有现实意义。
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