甘肃省定西市芹菜根腐病发生及病原优势种类分析*

张 敏，罗 宁，陈爱昌，李焕宇，刘永刚，李惠霞 ，石明明，韩 变

(1.甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070；
2.定西市植保植检站，甘肃 定西 743000；
3.甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃 兰州 730070；
4.甘肃省农业科学院 植物保护研究所，甘肃 兰州 730070)

芹菜(Apium graveolensL.)为伞形科(Umbelliferae)芹属(Apium)植物，在中国种植历史悠久、种植范围广泛，是一种药食同源的植物。由于其富含蛋白质、B 族维生素、胡萝卜素和碳水化合物等[1]，在临床应用和保健类食品开发方面有广阔的应用前景[2]。芹菜是甘肃外销的主要高原夏菜种类之一，种植面积逐年扩大。2020 年，定西市芹菜种植面积达1.5 万hm2，每667 m2产量达7～9 t，经济效益显著[3]。

根腐病在苗期可导致芹菜大面积死苗，在生长期造成根部腐烂死亡。在内蒙古，芹菜根腐病一般种植田发病轻时造成20%～30%的产量损失，发病重时损失可达60%～80%，甚至绝收[4]。芹菜根腐由多种病原菌引起[5]，不同地区病原种类和优势致病菌均有差异，其主要病原之一的镰孢菌(Fusariumspp.)是一种世界性分布的真菌，可侵染瓜果、蔬菜[6]、中药[7]、粮食作物[8]和牧草[9]等多种植物，引起根腐、茎基腐和花穗腐等多种病害。镰孢菌有多种专化型，不同专化型引起的症状也不尽相同，在培养过程中存在多型性和易变性，是真菌界最难准确鉴定的病原菌之一[10]。

甘肃省定西市作为中国高原夏菜主产地之一，芹菜根腐病一般田块发病率为10%～30%，严重地块高达90%以上，可造成不同程度的产量损失，重度田块甚至绝收[11]。近年来，随着市场需求量增加，芹菜种植面积不断扩大，连作现象普遍发生，导致芹菜根腐病愈加严重。目前，关于甘肃省芹菜根腐病研究较少，引起芹菜根腐病发生的病原菌种类尚不清楚。为明确该地区芹菜根腐病病原种类，本研究对定西市芹菜根腐病进行调查，鉴定病原菌种类，以明确防治靶标，为该地区芹菜根腐病的有效防控提供理论依据。

1.1 材料

供试材料：2020—2021 年，在甘肃省定西市安定区和陇西县采集芹菜根腐病样；
致病性测定的供试芹菜品种为凯尔文，由甘肃省定西市植保植检站提供。

供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、水琼脂培养基(WA)和康乃馨叶片水琼脂培养基(CLA)。PDA 由马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g 和蒸馏水1 L 制备而成；
WA 由琼脂15 g 和蒸馏水1 L 制备而成；
CLA 的制备：先加入10～15 片灭菌的康乃馨叶片(3～4 mm2)，再加入琼脂15 g 和蒸馏水1 L。

供试试剂：植物基因组DNA 提取试剂盒、琼脂糖、Marker、ddH2O、PCR mastermix、无水乙醇、葡萄糖、核酸染料和琼脂粉均购自北京擎科生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芹菜根腐病发生情况调查

2021 年4—8 月，于定西市安定区凤翔镇、内官镇、符川镇、团结镇、巉口镇、鲁家沟镇和西巩驿镇以及陇西县马河镇共8 个镇的芹菜种植地进行随机取样，统计病田率和病株率，采集病样，带回实验室进行分离鉴定。

1.2.2 芹菜根腐病病原菌的分离纯化

采用组织分离法[12]分离芹菜根腐病病原物。从根部和茎基部病健交界处剪取长约0.5 cm 的根，用75%乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3 次后在灭菌滤纸上吸干，置于PDA 平板上，于(25±1) ℃培养箱中培养；
3～4 d 后，将病样组织上长出的菌丝转接到另一个PDA 平板上。采用改良的单孢分离法[13]纯化病原菌。将孢子悬浮液稀释后，用无菌针头转移至WA 培养基上，置于(25±1) ℃培养箱中培养；
12 h 后，用无菌针头将萌发孢子挑出，进一步纯化培养；
7 d 后，将病原菌转至1.8 mL 冻存管，存放于4 ℃冰箱，备用。

1.2.3 芹菜根腐病病原菌的形态学鉴定

将纯化后的病原菌接种于PDA 培养基上，置于(25±1) ℃下暗培养。培养4 d 时测量菌落直径；
7 d 后观察其在PDA 培养基上的菌丝形状和色素产生情况等特征，并拍照记录。将纯化的菌株接种至CLA 培养基上，诱导产生分生孢子，15 d 后于显微镜下观察分生孢子形态。参考LESLIE 等[14]和王拱辰等[15]的方法进行形态学鉴定。

1.2.4 芹菜根腐病病原菌的分子生物学鉴定

(1) 病原菌DNA 提取

采用植物真菌基因组DNA 试剂盒提取病原菌DNA，试验步骤参照试剂盒说明书。根据形态学鉴定结果，每种菌选取3 株代表菌株活化培养，7 d 后提取菌株DNA，提取的DNA 模板于-20 ℃保存，备用。

(2) PCR 引物的选择

利用rDNA-ITS 序列引物ITS1 和ITS4 以及翻译延长因子TEF-1α 序列引物EF-1H 和EF-2T(表1)进行PCR 扩增，引物委托擎科生物技术有限公司(西安)合成。

表1 芹菜根腐病鉴定所用引物序列Tab.1 Primer sequence for identification of celery root rot

(3) 目的基因的扩增及系统发育分析

扩增体系25 μL，包括：PCRTaqMix 13 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各2 μL，DNA 2 μL。扩增条件：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环；
72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以ddH2O 为阴性对照，扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳30 min，于凝胶成像系统中确认目的片段后，将PCR 产物送至擎科生物技术有限公司(西安)进行基因测序。测序结果在NCBI GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)数据库中进行同源性检索，下载与目标序列相似度99%以上的序列，使用BioEdit 7.0.5 进行比对分析，使用MEGA 6.06 构建系统发育树。

1.2.5 病原菌致病性的测定

于2021 年7 月，在智能人工气候箱内进行致病性测定，试验采用根部刺伤接种法接种。于PDA 培养7 d 后，加无菌水洗脱孢子，制成孢子密度为1×106mL-1的悬浮液[16]；
待芹菜长至4～5 叶时，用无菌针头刺伤芹菜主根，每株芹菜注入孢子悬浮液10 mL，以等量无菌水作为对照，2 周后观察发病情况。分离发病植株病原物，提取病原菌DNA，扩增后测序进行鉴定。

1.3 数据分析

试验数据采用Excel 2007 与SPSS 19.0 软件进行统计分析，应用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验。

2.1 芹菜根腐病田间症状及发病情况

2.1.1 田间症状

根腐病致使芹菜长势不良(图1a)，达不到商用标准；
或导致根部腐烂，植株大面积死亡，引起田间缺苗断垄(图1b)。调查发现芹菜根腐病有2 种症状：(1) 植株茎基部出现褐色水渍状病斑，茎基部缢缩，病斑由外向内侵入维管束(图1c)；
(2) 发病始于根尖，病斑自下而上延伸，整个主根腐烂坏死，病原菌继续向上侵染新叶与茎秆，直至死亡；
或芹菜主根部分腐烂，未腐烂处增生大量须根，但长势较矮小或下部叶片偏黄，部分芹菜出现维管束变色、空心(图1d～f)。

图1 定西市芹菜根腐病田间症状Fig.1 Field symptoms of celery root rot in Dingxi City

2.1.2 发病情况

共调查139 个芹菜种植地，除陇西县马河镇陇海线旁1 个田块未发病外，其余调查地块均有根腐病发生，平均病田率为63.54%，但各地发病率存在差异。由表2 可知：田块病株率在0%～67.50%之间，平均每个地块病株率为24.45%。马河镇化家川的病株率最高，为67.50%，发病最普遍；
西巩驿南河仅次于马河镇化家川，病株率为48.75%；
内官镇万崖村与团结镇马家寺村的病株率最低。

表2 定西市芹菜产区根腐病发生情况调查Tab.2 Investigation of root rot disease in celery of Dingxi City %

2.2 芹菜根腐病真菌的分离和形态观察

经组织分离和纯化，从定西市芹菜主要种植区采集的病样中获得78 株镰孢菌(Fusariumspp.)菌株。根据菌落形态、菌丝生长状态、色素颜色和孢子形态，将78 株镰孢菌初步分为19 组，每组类型选取1 株代表菌株，用于形态学与分子生物学鉴定。

2.2.1 芹菜根腐病原菌形态学鉴定

代表菌株C33 的形态特征见图2。菌株在PDA 上培养时易发生突变，部分菌株不产生气生菌丝，产生“湿”状菌丝体，中心呈浅紫色，边缘白色。培养4 d 后，菌落直径为45.00～48.00 mm，背面中间为浅紫色、边缘为白色，基物不变色，气生菌丝呈棉絮状，颜色为淡紫色到白色。大分生孢子数量少，月牙形稍弯，多数3 隔，向两端逐渐均匀变尖，大小为11.18～27.60 μm×3.83～3.96 μm；
小分生孢子数量多，圆形或卵圆形，假头状着生在分生孢子梗上，大小为6.14～10.42 μm×2.35～3.58 μm；
厚垣孢子易产生，单生对生或串生，球形，一般位于气生菌丝末端或中间。依据上述形态特征，将编号为C33、B4、B16、C8、C16、C29、B1 和D4 的菌株归为一种，初步鉴定为尖孢镰孢菌(F.oxysporum)。

图2 尖孢镰孢菌培养性状与形态特征Fig.2 Culture and morphological characteristics of Fusarium oxysporum

代表菌株A11 的形态特征见图3。在PDA平板上培养4 d 后，菌落直径为43.50～56.50 mm，分布均匀，菌丝茂密且致密，气生菌丝白色棉絮状，菌落背面白色，基物不变色。菌丝光滑有隔膜、分枝，大分生孢子为无色镰刀型、较宽、粗壮、直或弯曲，0～4 隔膜，多数3 个隔膜。顶端细胞钝圆形，有的基胞有足跟，有的几乎圆柱形。大分生孢子通过分生孢子座产生，大小为24.93～35.56 μm×3.72～4.63 μm，单瓶梗产孢；
小分生孢子卵圆形、椭圆形或肾形，有隔或无隔，大小为6.45～9.34 μm×2.42～3.56 μm；
厚垣孢子单生或串生，多在菌丝中间或短的侧枝上形成，无色，壁厚。依据上述形态特征，将编号为A11、D16、D17 和A7 的菌株归为一种，初步鉴定为茄病镰孢菌(F.solani)。

图3 茄病镰孢菌培养性状与形态特征Fig.3 Culture and morphological characteristics of F.solani

代表菌株D8 的形态特征见图4。在PDA 上培养4 d 后，菌落直径为29.50～30.00 mm，初期菌落边缘白色，气生菌丝棉絮状桃红色，生长后期菌落从中间开始变黄，菌落中间有明显的黄色同心轮纹，从菌落边缘到中间桃红色逐渐加深。PDA 上未观察到大分生孢子，CLA 上大分生孢子弯曲呈纺锤状，顶胞渐细，基胞足跟明显，1～4个隔膜，大小为12.43～19.85 μm×2.62～4.33 μm，单瓶梗产孢；
小分生孢子椭圆形或卵圆形，0～1个隔膜，大小为8.09～14.03 μm×2.23～ 3.11 μm，厚垣孢子球形单生、对生或串生。依据上述形态特征，将标号为A1、A2、A5、A6、A9、A12 和D8 的菌株归为一种，初步鉴定为锐顶镰孢菌(F.acuminatum)。

图4 锐顶镰孢菌培养性状与形态特征Fig.4 Culture and morphological characteristics of F.acuminatum

2.2.2 芹菜根腐病原菌代表菌株的分子生物学鉴定

(1) rDNA-ITS 序列分析

采用通用引物ITS1/ITS4 扩增后，获得大小约为700 bp 的片段，经NCBI 比对和MEGA 系统发育树(图5)分析可知：19 个株菌聚为3 类。第I 类包括菌株B1、B4、B16、C8、C16、C29、C33和D4，与尖孢镰孢菌的遗传距离为0，置信度为99%，与形态鉴定结果一致，将其鉴定为尖孢镰孢菌；
第II 类包括菌株A7、A11、D17 和D16，该类与茄病镰孢菌遗传距离为0，置信度为99%，与形态鉴定结果一致，将其鉴定为茄病镰孢菌；
第III 类包括菌株A1、A2、A5、A6、A9、A12和D8，该类与锐顶镰孢菌遗传距离为0，置信度为99%，与形态鉴定结果一致，将其鉴定锐顶镰孢菌。

图5 基于rDNA-ITS 序列构建3 种病原菌与相关菌株的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree of three pathogens and other related strains based on the rDNA-ITS sequence

(2) EF-1α 序列分析

基于EF-1α 序列的系统发育树(图6)与rDNAITS 序列分析结果相似，将病原菌聚为3 类，第1 类包括菌株C8、C16、C29 和C33 等，这些代表菌株与尖孢镰孢菌聚为1 个分支，与形态鉴定结果一致，将其鉴定为尖孢镰孢菌；
第2 类包括菌株D8、A2、A6 和A9 等，与锐顶镰孢菌聚在一起，与初步形态鉴定结果相符，将其鉴定为锐顶镰孢菌；
第3 类包括菌株D16、D17 和A11等，该类与茄病镰孢菌聚为1 个分支，与形态鉴定结果一致，将其鉴定为茄病镰孢菌。

图6 基于EF-1α 序列构建3 种病原菌与相关菌株的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of three pathogens and other related strains based on the EF-1α sequence

结合形态学和分子生物学鉴定，分离纯化得到的78 株镰孢菌中，有尖孢镰孢菌62 株、锐顶镰孢菌11 株和茄病镰孢菌5 株，分离频率分别为79.49%、14.10%和6.41%。

2.3 芹菜根腐病分离物的致病性测定

分别将尖孢镰孢菌、锐顶镰孢菌和茄病镰孢菌3 种病原菌代表菌株接种至健康芹菜植株上，7 d后尖孢镰孢菌最先从茎基部发病，其他菌株14 d后才出现病症。从发病植株部位分离到病原菌，纯化培养后，经形态鉴定与分子鉴定确定该病原菌与接种病原菌一致，表明这3 种菌均为定西市田间芹菜根腐病致病菌。

尖孢镰孢菌致病性最强，发病情况最严重，发病率为91.66%，病情指数为78.33；
茄病镰孢菌发病率为77.78%，病情指数为24.44，症状表现为茎基部腐烂或主根下部腐烂，植株萎蔫；
锐顶镰孢菌发病率为22.22%，病情指数为11.11，多表现为茎基部维管束中间出现病斑，植株矮小，须根增多。尖孢镰孢菌在田间能引起芹菜根与茎基部腐烂，盆栽中芹菜也出现该症状，植株枯死，盆栽试验与大田症状相符；
锐顶镰孢菌在田间引起芹菜根部腐烂，盆栽试验与田间症状相比发病较轻；
茄病镰孢菌在田间能引起根与芹菜茎基部发病，盆栽试验发病与田间症状相符(图7)。试验结果表明：尖孢镰孢菌致病性最强，是甘肃省定西市芹菜种植地优势病原菌。

图7 3 种镰孢菌对芹菜幼苗的致病性测定Fig.7 Pathogenicity test of three kinds of Fusarium spp.on celery seedling

镰孢菌类根腐病是一类重要的真菌性病害，可危害马铃薯[17]、苜蓿[9]、青稞[18]、缸豆[19]、棉花[20]和芹菜[5]等作物。由镰孢菌引起的根腐病在芹菜苗期与生长期均可发生，是全周期型病害。本研究利用形态学方法与分子生物学方法，将引起甘肃省定西市芹菜根腐病的病原菌鉴定为尖孢镰孢菌、茄病镰孢菌和锐顶镰孢菌，明确了甘肃省芹菜根腐病病原种类，并首次发现锐顶镰孢菌能引起芹菜根腐病。尖孢镰孢菌从茎基部、根和茎基部维管束分离得到，茄病镰孢菌主要分离自茎基部和根，锐顶镰孢菌在根、茎基部与茎秆处均可分离到。尖孢镰孢菌分离频率最高，盆栽试验发病也最严重，表明尖孢镰孢菌是定西市芹菜根腐病的优势病原。

不同地区芹菜根腐病原菌有差异。王玲娜[21]报道内蒙古芹菜根腐致病菌包括接骨木镰孢菌(F.sambucinum)、链格孢(Alternaria alternata)、尖孢镰刀萎蔫专化型(F.oxysporumf.sp.Vasinfectum)、芬芳镰孢菌(F.redolen)、黄瓜萎蔫病菌(Plectosphaerella cucumerina)和尖孢镰孢菌(F.oxysporum)；
扈顺等[4]在内蒙古商都的西芹根腐病样分离出茄病镰孢菌(F.solani)；
郝永娟等[22]发现天津芹菜的主要致病菌为茄病镰孢菌；
石延霞等[23]和晋知文[24]调查发现：北京地区芹菜根腐病主要病原是茄病镰孢菌、侧雄腐霉菌(Pythium paroecandrum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum)；
王国荣等[25]报道引起浙江省芹菜茎基腐病的病原菌为尖孢镰刀菌。各地病原菌的差异可能与作物品种和种植环境有关。

镰孢菌的形态复杂，在生长过程中形态变异较大，形态鉴定很难准确地将其鉴定到种[26]。研究发现：ITS、mtSSU、β 微管蛋白和TEF-1α 能准确鉴定镰孢菌[19]。ITS被广泛运用于真菌鉴定，但对于镰孢菌亲缘关系较近的种或复合种，ITS 单一基因片段区分度不高，很难准确鉴定，因此，需挖掘更多的基因片段或多基因联合才能准确地鉴定[26]。TEF-1α基因因其位点核苷酸的替换率高，对亲缘关系较近的镰孢菌有较高分辨力，常作为镰孢菌属真菌鉴定的有效方法[27]，如：张祥丽等[28]通过ITS 与TEF-1α基因鉴定出铁皮石斛镰刀菌根腐病病原菌为变红—木贼镰刀菌复合种群(F.incarnatum-equisetispecies complex)；
李雪萍等[10]利用TEF-1α基因鉴定青稞根腐病病菌为尖孢镰孢菌、木贼镰孢菌(F.equiseti)与锐顶镰孢菌。本研究在形态学观察的基础上，通过分子生物学手段选择特异基因片段ITS 与TEF-1α序列对芹菜根腐病病原菌进行鉴定，结果更加准确、可靠。

从茎基部发病的芹菜植株在短时间内死亡；
从主根发病的芹菜，植株须根化严重，芹菜勉强生长，须根少的植株遇高温后出现萎蔫，发病后期新长出的须根也会腐烂，最终导致芹菜心叶和茎秆发病。须根化严重的芹菜没有主根或主根腐烂，推测是芹菜须根充当主根为芹菜提供营养物质，这可能是一种补偿作用[29]。同一病株可分离出多种病原菌，说明田间存在多种病原复合侵染的现象。王家和等[30]发现：3 种镰刀菌混合接种可加重蚕豆枯萎病；
姚天明等[31]证实尖孢镰刀菌及欧文氏杆菌复合侵染可引起半夏腐烂；
张德珍等[32]研究表明：镰孢菌与多种病原菌复合侵染共同导致小麦根腐病。由此推测，芹菜根腐病田间可能存在复合侵染，从而加重发病，对于复合侵染病菌的种类和侵染程度还需进一步开展研究。

定西市芹菜根腐病病田率为63.54%、病株率为24.45%，田间发病有2 种症状，分别是芹菜主根腐烂和茎基部缢缩腐烂。分离纯化得到78 株镰孢菌，其中尖孢镰孢菌 (F.oxysporum)、锐顶镰孢菌(F.acuminatum)和茄病镰孢菌(F.solani)的分离频率分别为79.49%、14.10%和6.41%。尖孢镰孢菌的致病性最强，是定西市芹菜根腐病的优势病原菌，锐顶镰孢菌引起芹菜根腐病为国内首次报道。

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