乌拉尔甘草化感自毒活性的研究
时间：2023-02-11 09:00:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
赵智龙，马淼
(新疆植物药资源利用教育部重点实验室，石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003)
化感作用(Allelopathy)是指植物通过根系分泌[1]、残体和凋落物的降解[2]、体外挥发[3]以及雨水淋溶[4]等途径向外界环境释放某些化学物质，从而对其他植物或自身产生直接或间接影响的生态学效应[5]，此类化学物质被称为化感物质。当化感物质的供体和受体是同一种植物并且对该植物的生长和发育产生抑制作用时，这种现象称为自毒作用(Autotoxicity)，自毒作用是化感作用的一种特殊形式[6-7]。在同一农田中连续多年栽培同种或同科作物后，会导致作物根系附近的土壤中累积多种自毒物质，并形成高浓度的微环境[8-9]，即使处于正常的栽培管理模式，也会使作物出现长势变弱、产量降低、品质下降、病害增加等现象[10]。因此，作物的自毒作用被认为是导致农业生产连作障碍的重要诱因之一[11-12]。
乌拉尔甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)多年生草本植物，其干燥的根与根状茎是我国的传统大宗中药材[13]，具有消炎[14]、止咳[15]、抗氧化[16]、清除自由基[17]和抑制肿瘤细胞增殖[18]等多种功效。过去由于过度利用致使野生甘草资源濒临枯竭，因此，栽培甘草正在成为该药材供应的主要来源[19]。但是在同一农田中连续种植多年后，甘草种子的萌发率、幼苗的生长状态以及药材的产量和品质均明显下降，已经成为制约甘草产业健康发展的限制因素，并且目前对其原因却知之甚少。植物体的各个器官几乎都存在化感物质，其中以根、茎和叶所含化感物质最多[20]。
综上所述，本文利用乌拉尔甘草根与根状茎以及茎和叶的水浸提液模拟根系分泌和雨水淋溶物，通过在盆土中添加上述器官的粉末以模拟乌拉尔甘草的残茬和凋落物，研究其对自身种子萌发和幼苗生长的影响，旨在为揭示乌拉尔甘草的化感自毒活性提供实验依据。
1.1 试验材料
乌拉尔甘草的营养器官及种子均来自新疆联强公司昌吉农场的3年生栽培甘草。随机选取5个1 m×1 m的样方，收获地上及地下的所有营养器官，并计算每个样方土壤里根与根状茎的质量，以及每个样方上茎和叶的质量。将其根、茎、叶和根状茎置于室内通风条件下阴干，粉碎，过50目筛，备用。
1.2 方法
1.2.1 水浸提液的制备
分别称取200 g根、茎、叶和根状茎的粉末放入玻璃烧杯中，加入2 L蒸馏水，烧杯用保鲜膜封口，防止水分流失，将其置于4 ℃冰箱中24 h，然后过滤得到浓度为0.1 g/mL的各器官水浸提液。取部分浸提液，用蒸馏水稀释到0.025 g/mL的浓度。
1.2.2 种子萌发试验
挑选健康饱满、大小一致的乌拉尔甘草种子，用浓度为98%的H2SO4溶液浸泡30 min，自来水冲洗干净，在直径为9 cm培养皿中垫入2层滤纸，分别加入2 mL 0.025、0.1 g/mL浓度的根、茎、叶和根状茎水浸提液，以添加2 mL蒸馏水作为对照，将30粒种子均匀摆放在滤纸上，盖上玻璃盖，置于25 ℃光照培养箱(光暗周期为12/12 h，光照强度为4 000 lx)内进行培养，每天及时补充水浸提液和蒸馏水，使滤纸保持湿润。每个处理设置3个重复。以胚根露出种皮至少1 mm作为种子萌发的标准，每24 h观察一次并记录萌发种子的个数，持续记录7 d，计算种子萌发指数、累积萌发率和化感效应指数，计算公式分别如下：
萌发指数=∑(Gt/Dt),Gt为t天种子萌发数，Dt为萌发天数。
萌发率=(种子数萌发/供试种子总数)×100%。
化感效应指数RI=1-C/T(T≥C)，或者RI=T/C-1(T 1.2.3 盆栽试验 2019年5月1日在直径20 cm、高25 cm的花盆中添加河沙作为培养基质，按照农田中每平方米土壤中所统计的残茬与凋落物的质量，在盆土中分别添加66、61.2、16、63.1 g的根、茎、叶和根状茎粉末充分混合，以不添加甘草器官粉末的盆土作为对照，每个处理设置10个重复，每个花盆中均匀播种10粒乌拉尔甘草种子，播种深度为1 cm，并一次性施加尿素1 g、过磷酸钙1.6 g和硫酸钾0.5 g作为底肥。盆栽试验采用完全随机排列方式，将所有花盆随机摆放在石河子大学校园的开阔地，每周随机调换一次花盆的位置，以确保其所接受的光照条件一致。利用称重法每天补充水分，使土壤相对湿度维持在70%，待幼苗出土后，拔除多余的幼苗，每盆中只保留3株长势一致的个体，培养90天后收获。 (1)根系形态学参数与根瘤数量的测定。将植株地下部分小心清洗，清除表面浮土，利用Expression 1100 XL(Epson company，Japan)扫描仪对幼苗根系进行扫描，采用根系分析系统软件(WinRHIZO Pro 2013)测量总根长、根总表面积和根总体积，并统计每株个体的根瘤数量。 (2)地上与地下生物量的测定。将植株的地上部分与地下部分置于75 ℃的烘箱中烘干至恒重，用分析天平称量其干重。 (3)地下器官甘草酸含量的测定。参照文献[22]中方法用Agilent 1100液相色谱仪(Agilent 1100泵系统，二极管阵列检测器DAD)检测甘草酸的含量。分离柱采用ODS-C18柱(250 mm×2.1 mm，5 μm)，检测波长为254 nm，柱温30 ℃，进样量为5 μL，流动相为甲醇∶水∶36%冰乙酸=71∶28∶1，流速1 mL/min。 精确称取甘草酸标准品3 mg，加入3 mL甲醇充分溶解，作为标准品原液，分别取0、25、50、100、200 μL原液，用流动相定容至1 mL，于254 nm波长下测定出峰时间和峰面积大小，每个样品测定3次求平均值。根据峰面积获得标准曲线，回归方程为Y=4.745 8X-8.002，R2=0.999 1。 将烘干的根及根状茎粉碎后过50目筛，精确称取0.05 g粉末，加入3 mL流动相，于室温下超声提取1 h，取上清液，并用0.45 μm微膜过滤。用HPLC法测定其中甘草酸的峰面积，每个样品测定3次，求平均值，计算甘草酸含量。 (4)总黄酮含量的测定。参照文献[23]中方法精确称取甘草苷标准品3 mg，加入3 mL甲醇充分溶解，作为标准品原液，然后分别取0、50、100、200、400 μL甘草苷原液，加入250 μL 10%氢氧化钾显色5 min，用甲醇定容至5 mL，摇匀，用紫外可见分光光度仪(岛津UV-2600，日本)于334 nm波长下测定吸光度，每个样品测定3次，计算平均值。以相应的浓度绘制标准曲线，回归方程为Y=0.057 4X+0.046 9，R2=0.999 6。 精确称取根及根状茎粉末0.5 g于试管中，加入甲醇5 mL，于室温下超声提取70 min，以5 000 r/min的转速离心15 min，取上清液100 μL，加入1 mL 10%氢氧化钾显色剂，显色5 min，然后用甲醇定容至5 mL，摇匀，用紫外可见分光光度仪于334 nm波长处测定吸光度。每个处理重复测定3次，计算平均值。 选用SPSS 20.0软件进行数据的统计分析，利用Duncan多重比较检测不同处理间的差异显著性，并利用Origin9.0绘图。 不同浓度的各器官水浸提液对乌拉尔甘草种子萌发指数影响的结果(图1)显示：对照组的萌发指数最高，所有器官的水浸提液均显著地降低了甘草种子的萌发指数，并且表现出了显著的浓度依赖效应，即随着水浸提液浓度的升高，水浸提液对甘草种子萌发指数的抑制效应就愈加强烈。其中，根、茎、叶和根状茎低浓度水浸提液(0.025 g/mL)处理组的种子萌发指数分别为对照的82.7%、77.4%、76.5%和77.3%(P=0.023、P=0.006、P=0.005、P=0.006)，高浓度水浸提液(0.1 g/mL)处理组的种子萌发指数分别为对照的74%、59.5%、61.4%和72.7%(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)。 不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图1 乌拉尔甘草各器官水浸提液对其种子的萌发指数的影响 不同浓度的各器官水浸提液对乌拉尔甘草种子累积萌发率影响的结果(图2)显示可见：对照组种子的萌发速度最快，其第2天的萌发率就达到了35%，并于第4天达到了最终萌发率。而各器官水浸提液处理组中均存在不同程度的萌发延迟现象，其中在茎的高浓度水浸提液(0.1 g/mL)的处理下，甘草种子萌发的迟滞现象最为明显，在处理后的第3天才开始萌发。茎、叶和根状茎的高浓度水浸提液(0.1 g/mL)处理组的种子最终萌发率均显著低于对照组，较对照组分别降低了11.1%、17.3%和11.1%(P=0.019、P=0.003、P=0.019)，根和根状茎低浓度水浸提液(0.025 g/mL)处理组的种子最终萌发率较对照组分别降低了9.9%和12.3%(P=0.022、P=0.015)。其中茎和叶水浸提液处理组中种子的最终萌发率均表现出显著的浓度依赖效应，即种子的最终萌发率随着水浸提液浓度的升高而显著下降。 不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图2 乌拉尔甘草各器官水浸提液对其种子累积萌发率的影响 不同浓度的各器官水浸提液对乌拉尔甘草种子萌发的化感效应指数影响的结果(图3)显示：各器官的水浸提液对乌拉尔甘草种子萌发的化感作用在处理2天后均达到最强抑制效应，且根、茎、叶和根状茎的高浓度水浸提液(0.1 g/mL)对甘草种子萌发的化感抑制效应显著高于低浓度水浸提液(0.025 g/mL)(P<0.001、P=0.036、P=0.046、P=0.046)。随着时间的延续各处理的化感抑制作用均呈逐渐减弱趋势，在第7天时各组处理对乌拉尔甘草种子萌发的抑制效应已经完全消失。 不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图3 乌拉尔甘草各器官水浸提液对其种子的化感效应指数随时间的变化 土壤中不同器官粉末的添加对乌拉尔甘草幼苗生长影响的结果(表1)表明：添加根与根状茎粉末的处理在所有幼苗生长指标上均显著低于对照组，上述两种处理与对照组相比，地上生物量分别降低了74.9%和54.6%(P<0.001、P<0.001)，根干重分别降低了88.5%和83.8%(P<0.001、P<0.001)，根瘤数量分别降低了85.1%和42.1%(P<0.001、P<0.001)。添加根粉末处理的甘草幼苗的总根长、根总体积和根总表面积分别仅为对照组的15.6%、20.3%和19.7%(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，添加根状茎粉末处理的甘草幼苗的总根长、根总体积和根总表面积分别仅为对照组的39.2%、31.2%和30.3%(P<0.001、P<0.001、P<0.001)，添加茎粉末处理的甘草幼苗的根总体积和根总表面积显著低于对照组，分别降低了33.2%和17%(P<0.001、P=0.001)，而添加叶粉末处理的甘草幼苗仅在总根长和根瘤数量指标上显著低于对照组，分别降低了29.1%和34.5%(P=0.001、P<0.001)，说明添加根、茎和根状茎粉末的处理完全抑制了幼苗根状茎的发育。因此，添加根与根状茎粉末的处理对乌拉尔甘草幼苗生长的抑制效应最为强烈，且其余各处理对甘草幼苗生长指标的抑制强度各不相同。 表1 土壤中不同器官粉末的添加对乌拉尔甘草幼苗生长的影响 土壤中不同器官粉末的添加对幼苗根系甘草酸和总黄酮含量影响的结果(图4)表明：各处理均在不同程度上显著抑制了乌拉尔甘草幼苗地下器官甘草酸和总黄酮含量的累积。与对照组相比，添加根、茎、叶和根状茎粉末处理的幼苗地下器官甘草酸含量分别降低了70.9%、21.5%、49.3%和62.5%(P<0.001、P<0.001、P<0.001、P<0.001)，总黄酮含量分别降低了46.4%、34.9%、30.7%和35.1%(P<0.001、P<0.001、P=0.001、P<0.001)。可见，土壤中添加了根和根状茎粉末的处理对甘草酸及黄酮类物质的形成与累积的抑制效应最强。 不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。图4 土壤中不同器官粉末的添加对幼苗根系甘草酸和总黄酮含量的影响 种子萌发对植物后期生长繁育极为重要，种子成功萌发是种群建立的前提和基础，因此，揭示连茬后甘草地中甘草种子萌发受抑制的原因具有十分重要的意义。本研究表明，经过不同器官的水浸提液处理的甘草种子萌发指数均显著地低于对照组，并表现出明显的浓度依赖效应(图1)； 不同植物及其不同发育时期对化感作用的敏感性不同，通常认为幼苗生长期比种子萌发期更敏感[29]。本研究发现添加根或根状茎粉末的处理对幼苗的自毒作用最为强烈，强烈抑制了营养器官生物量的累积、根系发育、根瘤数量以及药用成分的累积(表1、图4)，其中添加根、茎和根状茎粉末的处理完全抑制了幼苗根状茎的发育，而根状茎具有克隆繁殖的能力，根状茎的生长受到抑制无疑会极大的削弱了其自身的无性繁殖能力，但添加茎粉末的处理在地上生物量、根干重、总根长和根瘤数量的指标上相比于对照组无显著差异，添加叶粉末处理的地下生物量、根总体积和根总表面积与对照无显著差异，这说明同一植株不同器官之间的化感作用存在一定差异，这可能与不同器官中次生代谢产物的种类和含量存在差异有关。周凯等研究表明菊花不同器官所表现出的化感作用强度各不相同，其中茎和叶的水浸提液强烈的抑制了菊花的幼苗生长，而根的水浸提液对幼苗生长的影响相对较小[30]； 由此可见，不同种类植物或者同一植物不同器官的水浸液对其幼苗生长的化感作用的强度效应是不同的，并且可以确定农田中甘草种植达到一定年限后土壤中所累积的化感物质确实会对自身的种子和幼苗产生抑制效应。 种子萌发实验中，所有器官的水浸提液均致使甘草种子的萌发指数和最终萌发率降低，并且随着浸提液浓度的提高，种子延迟萌发的现象越明显。盆栽实验中，各器官粉末的添加均抑制了甘草幼苗的生长和药用成分的累积，其中以添加根和根状茎粉末的处理抑制效应最强烈。因此，每年入冬之前应及时收获乌拉尔甘草正枯死的茎和叶，并及时运走以防其掉落到农田中；1.3 统计方法
2.1 不同器官水浸提液对乌拉尔甘草种子萌发的影响
2.2 土壤中不同器官粉末的添加对乌拉尔甘草幼苗生长和药用成分含量的影响
3.1 各器官水浸提液对甘草种子萌发过程的化感自毒效应
累积萌发率和化感效应指数RI统计结果显示，与对照组相比，所有处理组中甘草种子的萌发时间都存在迟滞现象，并且延迟萌发现象和化感抑制效应均会随着水浸提液浓度的提高而更为明显(图2、图3)。这与前人的研究结果基本一致，如杨广超等研究表明，西瓜的根、茎和叶的水浸提液处理显著降低了其种子的发芽率、根长、胚轴长和根系活力，并且具有明显的浓度效应，抑制作用的强度与水浸提液的浓度呈正比[24]；
黄闽敏等研究认为天山云杉的水浸提液对自身的种子萌发具有浓度依赖性的自毒效应，即随着水浸提液浓度的升高，对其种子萌发的抑制效果随之增强，而在较低的水浸提液浓度时抑制效应相对较弱[25]；
李金鑫等研究发现随着巴茅草水浸提液浓度的升高，白菜、生菜和水稻种子的萌发速度随之减慢[26]。本研究表明甘草种子受自毒作用影响的程度因水浸提液的浓度而异，水浸提液浓度越高，化感抑制效应越强，并且乌拉尔甘草的自毒作用在种子萌发阶段主要体现在推迟种子的萌发时间。发芽时间延长、出苗延后将严重影响出土后的幼苗对地上和地下资源的竞争能力[27]；
另外，春天播种时土壤湿度高、温度低、种子萌发时间的推迟很容易造成种子霉烂，势必会造成种子活力的下降和病害的发生[28]。3.2 添加各器官粉末对甘草幼苗生长的化感自毒效应
鲍红春等研究了沙芥不同部位的水浸提液对白菜幼苗的化感作用，其中沙芥叶片的化感效应最强而沙芥枝条对白菜幼苗则有轻微的促进效应[31]。
在采挖根及根状茎时务必要收获彻底，以免残茬遗留在土壤中而对下一轮的甘草种子萌发和幼苗生长产生化感自毒效应，并在甘草播种前增加一次灌溉，使得土壤中的自毒物质能够随水下渗到深层，从而减轻其对甘草种子和幼苗的抑制效应。
