粗糠柴毒素上调微小RNA-204-5p对脂多糖所致心肌损伤的保护机制研究

于兆海，于悦

作者单位：1青岛市黄岛区人民医院药剂科，山东 青岛 266400；
2山东第一医科大学公共管理学院公共事业管理专业，山东 泰安 271000

心肌损伤是导致多种心血管疾病的重要原因，也是脓毒症［1］和糖尿病［2］常见的并发症。因此，保护心肌细胞免受损伤对相关疾病的防治具有重要意义。革兰阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖（LPS）是引起细胞感染的主要成分，LPS可以增加心肌细胞NADH氧化酶（NADH oxidase，NOX）的表达及过氧化物的增殖，造成活性氧的增加，进而造成心肌细胞损伤或者直接导致心肌细胞凋亡［3］。粗糠柴毒素（Rottlerin）是从传统药物粗糠柴中提取的小分子物质［4］，研究报道其有促凋亡和抑制凋亡的双重作用［5］。Rottlerin可抑制活性氧产生，清除氧自由基［6］。研究表明，Rottlerin可通过抑制蛋白激酶Cδ（PKC-δ）的活性减少肾小管上皮细胞凋亡［7］。Rot⁃tlerin可抑制碘帕醇诱导的NRK-52E细胞凋亡［8］。miRNAs是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，多种miRNAs在心肌缺血缺氧时显著差异表达，对心血管疾病的发生和发展起着重要作用，参与心肌损伤等病理生理过程［9］。选择性上调或下调特定miRNA表达可作为未来治疗心肌I/RI的新工具和诊断心血管疾病的敏感生物标志物［10］。自2018年9月至2019年4月研究了粗糠柴毒素对LPS所致心肌损伤的影响及其可能的作用机制，为尿毒症、心功能衰竭等疾病的临床治疗提供新的靶向药物和研究思路。

1.1 材料HCM、AC16心肌细胞购于中国科学院上海细胞库；
粗糠柴毒素购于Abcam公司；
Lipo⁃fectamineTM2S购于Sigma公司；
RPMI-1640培养基购于美国Gibico公司；
荧光定量试剂盒、反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司；
双荧光素酶报告基因检测试剂盒、Trizol均购于Solarbio（北京）公司；
RIPA蛋白裂解液、膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin VFITC）和碘化丙啶（PI）试剂盒均购于碧云天（上海）生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下，HCM、AC16细胞用RPMI-1640培养基培养，待细胞融合至60%~70%左右时，使用胰蛋白酶消化并传代。收集对数生长期的HCM、AC16细胞进行下一步实验。

1.2.2 药物处理与分组 参考李晓宁等［8］和刘丹等［11］所用的粗糠柴毒素和LPS浓度；
用终浓度为10 mg/L的LPS刺激心肌细胞6 h，分别加入终浓度为0.5μmol/L、1.0μmol/L、1.5μmol/L、2.0μmol/L粗糠柴毒素再处理12 h后分别记为LPS+0.5μmol/L Rot⁃tlerin组、LPS+1.0μmol/L Rottlerin组、LPS+1.5μmol/L Rottlerin组、LPS+2.0μmol/L Rottlerin组，以单纯10 mg/L LPS处理的为LPS组，以未经粗糠柴毒素和LPS处理的为对照组。采用LipofectamineTM2 000转染试剂盒在未经处理的HCM细胞中依次转染模拟物阴性对照（miR-NC），miR-204-5p模拟物（miR-204-5p）、抑制剂阴性对照（anti-miR-NC）、miR-204-5p抑制剂（anti-miR-204-5p），标记为miR-NC组，miR-204-5p组、anti-miR-NC组、anti-miR-204-5p组。在10 mg/L LPS处理的HCM细胞中转染miR-NC，miR-204-5p，标记为LPS+miR-NC组，LPS+miR-204-5p组。将anti-miR-NC、anti-miR-204-5p、过表达空载体（pcDNA3.1）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）过表达载体（pcDNA3.1-HMGB1）转染至2.0μmol/L粗糠柴毒素和10 mg/L LPS处理HCM细胞中，记为LPS+Rottlerin+anti-miR-NC组、LPS+Rottlerin+antimiR-204-5p组、LPS+Rottlerin+pcDNA3.1组、LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1组。

1.2.3 MTT法检测HCM、AC16细胞增殖 各组HCM、AC16细胞分别培养24 h、48 h、72 h时，加入5 g/L MTT溶液20μL，4 h后，弃去多余培养基，添加二甲基亚砜（DMSO）150μL，振荡10 min，然后用酶标仪在490 nm处检测光密度（OD）值。抑制率（%）=（1-OD实验组/OD空白对照组）×100%。

1.2.4 流式细胞术检测HCM、AC16细胞凋亡 离心收集各组经胰酶（不含乙二胺四乙酸）消化的HCM、AC16细胞，PBS漂洗5 min×2，接着加入结合缓冲液重悬HCM、AC16细胞。依据Annexin V-FITC和PI试剂盒说明书对HCM、AC16细胞进行避光孵育。最后使用流式细胞仪检测488 nm（激发波长）和530 nm（发射波长）处的荧光强度。

1.2.5 实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRTPCR）测定miR-204-5p和HMGB1 mRNA水平 用Trizol试剂提取HCM、AC16细胞总RNA，测得RNA纯度和浓度后，采用反转录试剂盒将其逆转录成互补DNA（cDNA）。按照荧光定量试剂盒的制造商说明制备PCR反应体系。在PCR仪上进行扩增。循环条件（40个）为95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，60℃延长5 min。以β肌动蛋白（β-actin）为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.2.6 蛋白质印迹法检测HMGB1及凋亡相关蛋白表达RIPA裂解液裂解各组HCM、AC16细胞，在4℃离心机中离心15 min（12 000g），收集蛋白上清液，并用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，转移至聚偏二氟乙烯膜下用5%脱脂奶粉封闭1 h。分别加入HMGB1、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜；
加入相应的1∶2 000稀释的二抗，室温下反应2 h，后遮光显影、定影后，用Quantity One凝胶分析软件分析胶片，以目的条带和β-actin条带的光密度比值作为蛋白表达水平。

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验证实miR-204-5p与HMGB1的靶向关系TargetScan数据库显示HMGB1 3′非翻译区（3′UTR）和miR-204-5p有互补的核苷酸序列。构建HMGB1 3′UTR野生型和突变型基因靶点的荧光素酶表达载体（WT-HMGB1和MUT-HMGB1），将HCM细胞以5×104个/孔的浓度接种至24孔板，用LipofectamineTM2 000将miR-NC和miR-204-5p分别转染至WT-HMGB1和MUTHMGB1组细胞。使用荧光素酶报告基因检测仪进行酶活测定。以荧光素酶和Renilla活性的比值作为最终的实验结果。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.00软件进行统计分析。计量资料以xˉ±s表示，两组比较行成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2.1 Rottlerin对miR-204-5p、HMGB1的表达及对LPS作用的心肌细胞HCM、AC16增殖凋亡的影响 相较于对照组，LPS组心肌细胞HCM、AC16的抑制率显著升高，miR-204-5p的表达水平显著降低，Bcl-2表达显著下降，Bax、HMGB1表达显著增高，凋亡率显著升高（P<0.05）；
相较于LPS组，不同浓度Rottlerin处理心肌细胞HCM、AC16细胞后，抑制率显著降低，miR-204-5p的表达水平显著增高，Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，Bax、HMGB1蛋白的表达水平显著降低，凋亡率显著降低（P<0.05），呈浓度依赖型。见表1，2；
图1。选用对Rottlerin较为敏感的HCM细胞做后续实验。

图1 粗糠柴毒素（Rottlerin）对各组心肌细胞HCM中HMGB1和凋亡相关蛋白表达的影响

表1 Rottlerin对LPS作用的各组心肌细胞HCM、AC16增殖的影响/（%，xˉ±s）

2.2 过表达miR-204-5p对LPS处理的HCM心肌细胞增殖、凋亡的影响LPS+miR-NC组与对照组相比，HCM细胞中miR-204-5p和Bcl-2表达下降，Bax表达升高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率升高（P<0.05）；
LPS+miR-204-5p组与LPS+miR-NC组相比，HCM细胞中miR-204-5p表达升高，Bcl-2表达升高，Bax表达降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率降低（P<0.05）。见表3，图2。

表3 过表达miR-204-5p对LPS作用的各组细胞HCM增殖、凋亡的影响/±s

表3 过表达miR-204-5p对LPS作用的各组细胞HCM增殖、凋亡的影响/±s

注：miR-204-5p为微小RNA-204-5p，LPS为脂多糖，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白。①与对照组比较，P<0.05。②与LPS+miR-NC组比较，P<0.05。

组别对照LPS+miR-NC LPS+miR-204-5p F值P值重复次数666 miR-204-5p 1.00±0.07 0.42±0.03①0.86±0.07②154.09<0.001 Bcl-2蛋白0.87±0.03 0.22±0.02①0.71±0.05②543.32<0.001 Bax蛋白0.31±0.01 0.96±0.06①0.43±0.02②525.22<0.001抑制率/%24 h 1.02±0.02 74.06±5.07①52.21±4.08②597.33<0.001 48 h 2.41±0.02 80.75±6.06①59.98±5.13②470.31<0.001 72 h 4.52±0.06 88.48±8.04①64.57±5.67②347.97<0.001凋亡率/%6.34±0.11 27.26±2.25①15.76±1.32②289.85<0.001

图2 过表达微小RNA-204-5p对脂多糖（LPS）作用的各组心肌细胞HCM增殖、凋亡的影响

2.3 抑制miR-204-5p表达能逆转Rottlerin对LPS作用的心肌细胞HCM增殖、凋亡的作用qRTPCR检测结果显示，与LPS组相比，LPS+Rottlerin组心肌细胞HCM中miR-204-5p和Bcl-2蛋白的表达水平显著升高，Bax蛋白的表达水平显著降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率显著降低（P<0.05）；
与LPS+Rottlerin+anti-miR-NC组相比，LPS+Rottlerin+anti-miR-204-5p组 心 肌 细 胞HCM中miR-204-5p和Bcl-2蛋白的表达水平显著降低，Bax蛋白的表达水平显著增高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05）。见表4，图3。

表4 抑制miR-204-5p表达能逆转Rottlerin对各组心肌细胞增殖、凋亡的作用/±s

表4 抑制miR-204-5p表达能逆转Rottlerin对各组心肌细胞增殖、凋亡的作用/±s

注：miR-204-5p为微小RNA-204-5p，Rottlerin为粗糠柴毒素，LPS为脂多糖，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白。①与LPS组比较，P<0.05。②与LPS+Rottlerin+anti-miR-NC组比较，P<0.05。

组别LPS LPS+Rottlerin LPS+Rottlerin+anti-miR-NC LPS+Rottlerin+anti-miR-204-5p F值P值重复次数66 6 6 miR-204-5p 0.43±0.03 0.73±0.06①0.71±0.05 0.59±0.05②48.08<0.001 Bcl-2蛋白0.25±0.02 0.69±0.05①0.72±0.06 0.53±0.01②168.33<0.001 Bax蛋白0.99±0.06 0.24±0.02①0.26±0.02 0.77±0.06②421.30<0.001抑制率/%24 h 74.06±5.07 54.21±4.08①55.33±4.25 66.07±5.19②24.41<0.001 48 h 81.35±6.06 59.98±5.13①60.24±5.37 71.19±6.04②19.50<0.001 72 h 89.94±8.14 64.57±5.67①66.81±4.02 78.67±6.12②21.71<0.001凋亡率/%26.26±2.13 11.06±1.09①12.16±1.12 18.37±1.54②125.19<0.001

图3 抑制微小RNA-204-5p表达能逆转粗糠柴毒素（Rottlerin）对各组心肌细胞增殖、凋亡的作用

表2 Rottlerin对LPS作用的各组心肌细胞HCM凋亡及miR-204-5p、HMGB1表达的影响/±s

表2 Rottlerin对LPS作用的各组心肌细胞HCM凋亡及miR-204-5p、HMGB1表达的影响/±s

注：Rottlerin为粗糠柴毒素，LPS为脂多糖，miR-204-5p为微小RNA-204-5p，HMGB1为高迁移率族蛋白B1，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白。①与对照组比较，P<0.05。②与LPS组比较，P<0.05。③与LPS+Rottlerin 0.5μmol/L组比较，P<0.05。④与LPS+Rottlerin 1.0μmol/L组比较，P<0.05。⑤与LPS+Rottlerin 1.5μmol/L组比较，P<0.05。

组别对照LPS LPS+Rottlerin 0.5μmol/L LPS+Rottlerin 1.0μmol/L LPS+Rottlerin 1.5μmol/L LPS+Rottlerin 2.0μmol/L F值P值重复次数6 6 6 6 6 6 miR-204-5p 1.99±0.08 0.30±0.03①0.46±0.04①②0.54±0.05①②③0.76±0.04①②③④0.88±0.07①②③④⑤745.94<0.001 HMGB1蛋白0.26±0.02 1.04±0.10①0.93±0.09①②0.80±0.08①②③0.62±0.06①②③④0.53±0.05①②③④⑤94.61<0.001 Bcl-2蛋白0.94±0.08 0.16±0.03①0.31±0.03①②0.56±0.04①②③0.69±0.04①②③④0.86±0.04①②③④⑤260.05<0.001 Bax蛋白0.33±0.02 1.06±0.08①0.97±0.06①②0.89±0.07①②③0.66±0.04①②③④0.54±0.05①②③④⑤145.59<0.001凋亡率/%5.61±0.05 27.79±2.23①22.61±2.14①②20.06±1.94①②③11.71±1.01①②③④9.16±1.00①②③④⑤174.70<0.001

2.4 miR-204-5p靶向HMGB1TargetScan预测结果显示HMGB1和miR-204-5p存在相互结合的核苷酸位点。转染WT-HMGB1后，miR-204-5p组荧光素酶活性（0.33±0.02）明显低于miR-NC组（1.01±0.05）（t=30.93，P<0.001）；
而转染MUT-HMGB1后，miR-204-5p组荧光素酶活性（1.08±0.05）与miR-NC组（1.06±0.04）比较，差异无统计学意义（t=0.77，P=0.462）。miR-204-5p组HMGB1 mRNA和蛋白表达明显比miR-NC组低（P<0.05），anti-miR-204-5p组HMGB1 mRNA和蛋白表达明显比anti-miR-NC组高（P<0.05），见表5。

表5 miR-204-5p对HMGB1表达的影响/±s

表5 miR-204-5p对HMGB1表达的影响/±s

注：miR-204-5p为微小RNA-204-5p，HMGB1为高迁移率族蛋白B1。①与miR-NC组比较，P<0.05。②与anti-miR-NC组比较，P<0.05。

组别miR-NC miR-204-5p anti-miR-NC anti-miR-204-5p F值P值重复次数6666 HMGB1 mRNA 0.38±0.02 0.10±0.01①0.43±0.05 1.22±0.11②367.40<0.001 HMGB1蛋白0.41±0.03 0.09±0.01①0.44±0.03 1.18±0.11②364.91<0.001

2.5 过表达HMGB1能逆转Rottlerin对LPS作用的心肌细胞HCM增殖、凋亡的作用与LPS组相比，LPS+Rottlerin组心肌细胞HCM中Bcl-2表达升高，Bax、HMGB1表达降低，24、48、72 h的抑制率和凋亡率降低（P<0.05）；
与LPS+Rottlerin+pcDNA3.1组相比，LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1组心肌细胞HCM中Bcl-2表达降低，Bax、HMGB1表达升高，24、48、72 h的抑制率和凋亡率升高（P<0.05）。见表6。

表6 过表达HMGB1能逆转Rottlerin对心肌细胞HCM增殖、凋亡的作用/±s

表6 过表达HMGB1能逆转Rottlerin对心肌细胞HCM增殖、凋亡的作用/±s

注：HMGB1为高迁移率族蛋白B1，Rottlerin为粗糠柴毒素，LPS为脂多糖，Bcl-2为B淋巴细胞瘤-2，Bax为Bcl-2相关X蛋白。①与LPS组比较，P<0.05。②LPS+Rottlerin+pcDNA3.1组比较，P<0.05。

组别LPS LPS+Rottlerin LPS+Rottlerin+pcDNA3.1 LPS+Rottlerin+pcDNA3.1-HMGB1 F值P值重复次数6666 HMGB1蛋白1.45±0.11 0.76±0.07①0.77±0.07 1.08±0.09②84.93<0.001 Bcl-2蛋白0.24±0.02 0.57±0.04①0.59±0.05 0.41±0.04②104.49<0.001 Bax蛋白0.89±0.06 0.24±0.02①0.22±0.02 0.64±0.04②423.57<0.001抑制率/%24 h 75.06±5.07 54.21±4.08①53.33±4.06 68.77±6.02②29.40<0.001 48 h 80.95±6.16 59.98±5.13①57.24±4.87 72.19±6.74②21.87<0.001 72 h 91.14±8.36 64.57±5.67①62.81±4.62 81.67±7.12②25.84<0.001凋亡率/%27.26±2.33 12.06±1.09①11.46±1.12 15.37±1.24②137.88<0.001

LPS进入血液中会引起急性全身免疫系统反应，其中急性心肌炎症会使心脏收缩力下降、心率加快、射血分数减少，导致心功能不全；
严重时会导致心功能衰竭甚至死亡，对人类生命健康危害极大［12］。研究表明中药具有减少炎性细胞浸润、抑制心肌细胞凋亡、清除自由基、减轻钙超载、抗脂质过氧化等作用［13］。粗糠柴毒素是中药粗糠柴的重要成分，Rottlerin可显著提升缺血-再灌注心肌的AL⁃DH2磷酸化水平，减轻I/R引起的心肌细胞死亡，起到心脏保护的作用［14］。Rottlerin可通过抑制PKCδ-ERK1/2通路减轻6-羟基多巴胺所致多巴胺能细胞凋亡［15］。Rottlerin通过改善心肌细胞收缩和冠状动脉灌注，显著改善心脏停搏后的心脏功能［16］。Rot⁃tlerin可显著减轻细胞缺氧损伤形态改变，增强缺氧损伤后的细胞活力［17］。本实验结果显示，Rottlerin可保护LPS所致的心肌细胞损伤，且呈浓度依赖性。

研究表明，miRNA可通过控制心肌的细胞凋亡，降低心血管疾病的发生［18］，其还可调节血管损伤、血管重塑过程［19］。研究发现，抑制miR-204-5p的表达能通过调控Sirt1促进糖尿病角膜上皮的损伤修复［20］。miR-204-5p过表达能抑制结直肠癌细胞的上皮细胞-间充质转化进程，并降低细胞增殖、侵袭、迁移能力［21］。miR-204-5p通过调节SIX1表达抑制肝细胞癌增殖［22］。miR-204-5p可以通过靶基因CCND1抑制肺癌细胞的增殖能力［23］。miR-204-5p通过抑制IGFBP5抑制乳头状甲状腺癌中细胞增殖［24］。miR-204-5p通过抑制CXCR4的表达来调节口腔鳞状细胞癌中细胞的增殖和转移［25］。miR-204-5p通过下调USP47和RAB22A抑制胃癌细胞增殖［26］。衰老心肌细胞缺氧处理后miR-204下调表达，且缺氧后处理对缺氧复氧所致的衰老心肌细胞损伤的保护作用减弱与miR-204有很大关系［27］。本研究结果显示，过表达miR-204-5p可保护LPS所致的心肌细胞损伤。且Rottlerin可上调miR-204-5p的表达，抑制miR-204-5p表达能逆转Rottlerin对LPS作用的心肌细胞HCM的保护作用，提示Rottlerin可能通过调控miR-204-5p保护心肌细胞免受损伤。

HMGB1是HMG蛋白家族成员之一，一种重要的损伤相关的分子识别模式［28］；
在众多的心血管疾病如急性冠脉综合征、缺血再灌注损伤、糖尿病心肌病中有重要的促炎作用［29］。研究发现，HMGB1在损伤心肌细胞中高表达，CORM-2通过下调HMGB1的表达可减轻心肌细胞缺氧损伤［30］。缺氧复氧诱导心肌细胞合成HMGB1，敲低HMGB1可以减弱缺氧复氧诱导的心肌细胞凋亡，减轻氧化损伤［31］。GLP-1受体激动剂通过抑制HMGB1的表达保护高糖诱导的心肌损伤［32］。抑制HMGB1可降低机体各种炎症因子水平，调控脓毒症的失控性炎症效应，减轻脓毒症心肌损害［33］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的激活介导HMGB1减轻心肌缺血再灌注损伤，对心肌产生保护作用，其保护机制或是抑制炎症反应、减轻氧化应激、抑制心肌细胞凋亡［34］。上调miR-451通过抑制HMGB1 mRNA表达保护心肌细胞缺氧再复氧损伤［35］。本研究结果显示，HMGB1受miR-204-5p的调控，过表达HMGB1能逆转Rottlerin对LPS作用的心肌细胞HCM的保护作用。

综上所述，粗糠柴毒素对LPS所致的心肌细胞损伤有保护作用，其机制可能是通过上调miR-204-5p的表达，进而抑制HMGB1的表达而发挥作用。粗糠柴毒素在治疗心肌损伤方面具有一定的治疗潜力，miR-204-5p和HMGB1可能是心肌损伤治疗的潜在靶点。

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