钙敏感受体在高血压大鼠心肌重塑和视网膜血管病变中的作用研究

赵佳琪，刘薇，唐娜，王腊梅，屈媛媛，席冬梅，钟华，何芳*

高血压是一种常见的心血管疾病，高血压的持续进展可引起心、脑、全身血管系统多个靶器官损害［1］，因此血压的监测对高血压的防控具有重要意义。视网膜血管作为全身唯一可以直接通过肉眼观察的血管，关注其变化对高血压的进展评估具有一定的价值［2］。

钙敏感受体（calcium-sensing receptor，CaSR）是G蛋白偶联受体C家族的成员之一，存在于甲状旁腺、肾脏、肠道、骨骼等组织中［3］，在感知细胞外Ca2+和维持细胞内外Ca2+稳态的信号通路中起关键作用［4］。本课题组前期研究发现，CaSR激动剂可有效降低血压，改善心肌重塑［5］。2018年CaSR首次在大鼠视网膜中被发现，并证明CaSR的表达降低与糖尿病视网膜病变发生有关［6］，但CaSR在高血压视网膜血管中的影响鲜见报道。

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是诱导血管生成的重要细胞因子，与高血压有着密切联系［7］。哺乳动物的VEGF家族由五种糖蛋白组成：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD和胎盘生长因子［8］，其中VEGFA是血管生成的关键媒介，通过与血管内皮细胞上表达的VEGF受体1（VEGFR-1）和VEGF受体2（VEGFR-2）结合，影响血管通透性和血管新生［9］。在多项研究中发现，CaSR可与VEGF共同参与心血管疾病的发展［10-11］。故本研究通过探究CaSR在高血压大鼠心脏与视网膜血管中的作用，分析CaSR与VEGF在高血压视网膜血管病变中的关系，以期对高血压及高血压靶器官损害的防治提供新思路。

1.1 实验动物 本研究时间为2021年5—12月。从北京维通利华实验动物有限责任公司购买（许可证编号：SCXK京2021-0006）7周龄清洁级健康雄性自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）及同源相同周龄正常血压大鼠（wistar-kyoto rats，WKY），体质量约180 g，饲养于石河子大学医学院动物房，普通饮食饲养，保证饲养环境安静整洁，避免嘈杂。实验经石河子大学医学院第一附属医院医学伦理委员会批准（批准号：A2020-164-01）。

1.2 主要试剂和仪器 NPS2143（美国R&D公司），CaSR单克隆抗体（武汉三鹰公司），VEGFA单克隆抗体（武汉博士德公司），苏木素-伊红（HE）染液（江苏碧云天公司），DAB显色剂（北京中山金桥公司），聚合酶链式反应（PCR）引物（上海生工生物工程有限公司），逆转录试剂盒（北京全式金公司），PCR绿色荧光染料（上海赛默飞世尔科技公司），DNA marker II（上海赛默飞世尔科技公司），RNA提取液（美国Invitrogen公司），PCR核酸扩增仪（日本Takara 公司），低温超速离心机（美国Thermo 公司），奥林巴斯TH4-200倒置显微镜（日本SANYO公司）。

1.3 方法

1.3.1 分组 7周龄雄性WKY大鼠10只及同源相同周龄SHR大鼠20只，适应性饲养1周以适应环境，将SHR大鼠随机分为SHR组（n=10）和抑制剂（SHR+NPS2143）组（n=10）；
WKY大鼠归为WKY组（n=10）。SHR+NPS2143组 以 4.5 mg·kg-1·d-1剂量腹腔注射CaSR抑制剂NPS2143，WKY组和SHR组注射等量0.9%氯化钠溶液，共注射16周至大鼠周龄24周。将所有大鼠分组饲养。

1.3.2 血压测量 分别在持续干预0周（8周龄）和干预16周（24周龄）时每组选取5只大鼠，用Softron BP-98A（SOFTRON，日本）大鼠尾部无创血压计测量各组大鼠尾部动脉的收缩压（systolic blood pressure，SBP）和舒张压（diastolic blood pressure，DBP），用公式计算平均动脉压（mean arterial pressure，MAP），MAP=1/3 SBP+2/3 DBP。室温下，将大鼠固定在大鼠箱中，尾根放置并固定在血压计的充气尾套中，每只大鼠重复测量3次，并取平均值。

1.3.3 取材 眼球：干预0周（8周龄）时每组选取5只大鼠，干预16周（24周龄）时每组选取剩余5只大鼠，称重并根据体质量给予麻醉剂，麻醉后处死大鼠，快速摘出左眼并于1×PBS缓冲液中稍加清洗，浸没于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃保存用于制作病理切片。摘出右眼于1×PBS缓冲液清洗后，置于装有4%多聚甲醛溶液的培养皿中固定90 min后，1×PBS缓冲液反复清洗后，移至立式显微镜下。眼科有齿镊夹住视神经断端，固定眼球，用角膜剪沿角巩膜缘剪下角膜。用镊子将晶状体挑出后，用1×PBS缓冲液冲洗剩余眼球内壁，去除残留玻璃体后，用镊子将视网膜完整剥离下来后转移至EP管，标记后-80 ℃冰箱保存。

心脏：分别在持续干预0周（8周龄）和干预16周（24周龄）时将已取眼球的5只大鼠用组织剪剪开胸骨，露出心脏。迅速取出心脏，分离出左心室，称重并记录，计算心脏/体质量（HW/BW%）和左心室/体质量（LVW/BW%）。将心肌组织洗净后包裹在锡箔纸中，储存在-80 ℃冰箱中，以便日后检测目标蛋白。

1.3.4 马松（Masson）染色 心肌组织于4%多聚甲醛缓冲液中固定24 h。梯度酒精脱水后石蜡包埋切片，切片厚5μm。采用Masson染色，显微镜下观察。随机选取每个组织的3个显微镜视野并摄片（×400），使用Image-Pro Plus 6.0软件分析计算心肌细胞胶原沉积面积，并计算心肌组织胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF），CVF=心肌细胞胶原沉积面积/心肌细胞总面积×100%。

1.3.5 HE染色 摘除的各组大鼠眼球于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后，石蜡包埋切片，切片厚5μm。用HE染色，显微镜下观察视网膜结构变化，随机选取每个组织的3个显微镜视野并摄片（×400），用Image J软件测量视网膜各层厚度。

1.3.6 免疫组织化学染色 将WKY组和SHR组干预0周的视网膜切片去石蜡后，高压抗原修复10 min，内源性过氧化物酶抑制剂覆盖切片，室温孵育10 min，而后将视网膜切片与抗CaSR的一级大鼠单克隆抗体（1∶50）、抗VEGFA的一级大鼠单克隆抗体（1∶50）在4 ℃下孵育过夜。次日PBS缓冲液冲洗3遍后，将切片与辣根过氧化物酶结合的二抗在37 ℃下孵育30 min。冲洗后滴加DAB溶液显色，紫木苏复染，脱水封片。显微镜下观察CaSR、VEGFA免疫阳性产物并摄片（×400）。

1.3.7 实时荧光定量PCT（qRT-PCR） 从干预16周3组的视网膜组织中提取总RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度计测量总RNA的浓度和纯度。并根据制造商的操作手册将3 mg总RNA逆转录为cDNA。20 μl的荧光定量PCR体系包括：2×Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix 10 μl、上、下游引物各 1 μl、模板cDNA 1 μl、RNase-free water 7 μl。PCR 条 件：94 ℃预变性30 s；
94 ℃变性5 s，60 ℃退火34 s，共38个循环；
65～95 ℃制作融解曲线。基因的相对表达量与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（内部参考基因）进行了归一化。采用ABI7500实时PCR系统进行操作。CaSR、VEGFA和GAPDH的引物来自上海生工生物工程有限公司，引物序列如表1所示。使用Image J软件对各组CaSR、VEGFA、GAPDH灰度值进行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences for GAPDH，VEGFA and CaSR

1.4 统计学分析 采用SPSS 24.0软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，组内比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 3组大鼠干预0周、16周血压比较 3组大鼠干预0周、16周SBP、DBP、MAP比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
其中SHR组干预0周、16周SBP、DBP、MAP高于WKY组，SHR组干预16周SBP、DBP、MAP低于SHR+NPS2143组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。SHR组、SHR+NPS2143组干预16周SBP、DBP、MAP高于干预0周，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3组大鼠干预0周、16周血压比较（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of blood pressure in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表2 3组大鼠干预0周、16周血压比较（±s，mm Hg）Table 2 Comparison of blood pressure in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

注：SBP=收缩压，DBP=舒张压，MAP=平均动脉压，WKY组=正常血压大鼠组，SHR组=自发性高血压大鼠组，SHR+NPS2143组=NPS2143抵制剂干预自发性高血压大鼠组；
1 mm Hg=0.133 kPa；
a表示与同周龄WKY组比较P＜0.05；
b表示与同周龄SHR+NPS2143组比较P＜0.05

组别 只数 SBP DBP MAP干预0周 干预16周 t配对值 P值 干预0周 干预16周 t配对值 P值 干预0周 干预16周 t配对值 P值WKY 组 5 107±1 108±1 0.260 0.999 92±6 101±10 1.744 0.575 95±3 103±6 1.973 0.479 SHR组 5 116±1a 170±6ab 22.610 ＜0.001 108±5a 141±10ab 5.610 0.002 111±3a 150±9ab 8.959 ＜0.001 SHR+NPS2143组 5 116±4 184±1 25.280 ＜0.001 109±2 169±6 9.332 ＜0.001 112±1 174±4 12.950 ＜0.001 F值 124.500 259.300 12.910 30.420 30.220 57.880 P值 ＜0.001 ＜0.001 0.007 0.010 0.004 0.004

2.2 3组大鼠心肌重塑情况比较 3组大鼠干预16周HW/BW%、LVW/BW%、CVF比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
其中SHR组干预16周HW/BW%、LVW/BW%、CVF高于WKY组，低于SHR+NPS2143组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。SHR组、SHR+NPS2143组干预16周HW/BW%、LVW/BW%、CVF高于干预0周，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3，图1。

表3 3组大鼠干预0周、16周心肌重塑情况比较（±s，%）Table 3 Comparison of HW/BW%，LVW/BW%，and myocardial collagen volume fraction in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表3 3组大鼠干预0周、16周心肌重塑情况比较（±s，%）Table 3 Comparison of HW/BW%，LVW/BW%，and myocardial collagen volume fraction in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

注：a表示与同周龄WKY组比较P＜0.05，b表示与同周龄SHR+NPS2143组比较P＜0.05；
HW/BW%=心脏/体质量，LVW/BW%=左心室/体质量，CVF=心肌组织胶原容积分数

组别 只数 HW/BW% LVW/BW% CVF干预0周 干预16周 t配对值 P值 干预0周 干预16周 t配对值 P值 干预0周 干预16周 t配对值 P值WKY 组 5 0.320±0.006 0.340±0.006 2.909 0.094 0.230±0.010 0.240±0.003 1.401 0.644 3.06±0.52 3.06±0.04 0.001 0.999 SHR组 5 0.330±0.002 0.370±0.001ab 6.898 0.001 0.220±0.011 0.280±0.008ab 6.672 ＜0.001 2.93±0.64 7.41±0.54ab 3.834 0.032 SHR+NPS2143组 5 0.330±0.003 0.390±0.008 3.803 0.026 0.240±0.011 0.310±0.005 4.880 0.002 2.74±0.37 9.90±0.03 4.577 0.013 F值 3.610 2.235 1.065 58.590 0.097 122.600 P值 0.159 0.002 0.447 ＜0.001 0.910 0.001

图1 3组大鼠干预0周、16周心肌组织（Masson染色，×400）Figure 1 Myocardial tissue in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

2.3 3组大鼠视网膜结构变化 SHR组干预0周、16周视网膜各层排列不规则，其中内界膜不规则较为明显，神经纤维层疏松，SHR+NPS2143组干预16周以上改变更加明显，见图2。3组大鼠干预0周、16周视网膜总厚度、内丛状层厚度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
其中SHR组干预0周、16周视网膜总厚度、内丛状层厚度高于WKY组，SHR组干预16周视网膜总厚度、内丛状层厚度低于SHR+NPS2143组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组大鼠干预16周视网膜内核层厚度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
其中SHR组干预16周视网膜内核层厚度高于WKY组，低于SHR+NPS2143组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。3组大鼠干预16周视网膜总厚度、内丛状层厚度、内核层厚度高于干预0周，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

图2 3组大鼠干预0周、16周视网膜结构（HE染色，×400）Figure 2 Retinal structure in three groups of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表4 3组大鼠干预0周、16周视网膜各层厚度比较（±s，μm）Table 4 Comparison of total retinal thickness in three group of rats at baseline and 16 weeks of intervention

表4 3组大鼠干预0周、16周视网膜各层厚度比较（±s，μm）Table 4 Comparison of total retinal thickness in three group of rats at baseline and 16 weeks of intervention

注：a表示与同周龄WKY组比较P＜0.05，b表示与同周龄SHR+NPS2143组比较P＜0.05

组别 只数 视网膜总厚度 视网膜内丛状层厚度 视网膜内核层厚度干预0周 干预16周 t配对值 P值 干预0周 干预16周 t配对值 P值 干预0周 干预16周 t配对值 P值WKY组 5 56.08±4.69 95.01±1.36 14.430 ＜0.001 12.59±1.99 22.23±1.69 4.544 0.002 5.81±0.63 12.09±1.21 6.650 ＜0.001 SHR组 5 72.18±9.02a 112.89±8.69ab 12.290 ＜0.001 19.76±0.51a33.94±3.16ab 6.744 ＜0.001 7.45±0.57 15.59±1.05ab 11.180 ＜0.001 SHR+NPS2143组 5 70.63±2.63 193.24±29.15 36.670 ＜0.001 19.33±0.58 55.33±9.95 17.120 ＜0.001 7.87±0.96 25.27±2.46 22.810 ＜0.001 F值 9.796 222.700 138.700 45.340 1.062 84.190 P值 0.029 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.413 0.001

2.4 CaSR、VEGFA定位与表达 免疫组化结果可见，干预0周，WKY组CaSR免疫阳性产物主要分布于内界膜及神经节细胞层，胞质呈深棕黄色，阳性产物表达较强，SHR组CaSR免疫阳性产物主要分布于少数神经节细胞的胞浆中，阳性产物表达较弱；
WKY组VEGFA免疫阳性产物主要分布于少数神经节细胞的胞浆中，阳性产物表达较弱，SHR组VEGFA免疫阳性产物主要分布于神经节细胞层、内核层及外丛状层，胞质呈深棕黄色，阳性产物表达较强（图3）。qRT-PCR检测结果可见，干预16周，3组大鼠视网膜中CaSR、VEGFA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；
其中SHR组视网膜中CaSR表达低于WKY组、高于SHR+NPS2143组，SHR组视网膜中VEGFA水平高于WKY组、低于SHR+NPS2143组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 3组大鼠干预16周视网膜中CaSR、VEGFA表达比较（±s）Table 5 Expression of CaSR and VEGFA in retinal tissues in three groups of rats at 16 weeks of intervention

表5 3组大鼠干预16周视网膜中CaSR、VEGFA表达比较（±s）Table 5 Expression of CaSR and VEGFA in retinal tissues in three groups of rats at 16 weeks of intervention

注：a表示SHR组与同周龄WKY组比较P＜0.05；
b表示与SHR+NPS2143组比较P＜0.05

组别 CaSR VEGFA WKY组 1±0 1±0 SHR 组 0.35±0.03ab 3.82±0.53ab SHR+NPS2143组 0.13±0.02 11.48±0.56 t值 1223 383 P 值 ＜0.001 ＜0.001

图3 WKY组和SHR组干预0周视网膜组织中CaSR、VEGFA定位Figure 3 Localization of CaSR and VEGFA in retinal tissues in rats of WKY group and SHR group at baseline

长期高血压控制不良可造成心脏结构、功能发生变化，包括左心室舒张功能障碍、左心室肥厚、心肌收缩功能障碍，最终引发心力衰竭。相较于血压正常的患者，光学相干断层扫描（OCT）检查观察到高血压患者的视网膜多层结构反射不平整，厚度增厚［12］。临床上对于高血压引起的靶器官损害治疗主要为全身降压、营养神经、辅以局部注药，但疗效并不显著。

CaSR通过调节多种信号途径发挥生物学效应，参与高血压的发生、发展［13-15］。激活CaSR，可以抑制肾素的分泌，进而降低血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）和醛固酮的水平，使血压降低［16］。而CaSR介导的多种功能主要与亲水的细胞外结构（ECD）有关，其除了能与多价阳离子（如Ca2+，Mg2+，Gd3+等）［17］、多胺类（如精胺等）及某些抗生素（如新霉素等）直接结合外，也受到别构激动剂（西那卡塞、calindol）和别构抑制剂（NPS2143和Calhex-231）的影响［18］。为了探究CaSR在高血压心肌重塑及视网膜血管病变的作用，本研究结果发现SHR组大鼠血压高于WKY组，视网膜结构紊乱，视网膜总厚度高于WKY组，视网膜中CaSR表达水平低于WKY组，SHR+NPS2143组血压高于SHR组，视网膜结构紊乱明显，视网膜中CaSR表达水平低于SHR组，提示高血压引起的视网膜血管病变可能与CaSR表达降低有关。而在未干预时，SHR组大鼠与WKY组大鼠的HW/BW%、LVW/BW%比较未见明显差异，也无明显心肌胶原沉积，干预16周 后，SHR组 大 鼠HW/BW%、LVW/BW%、CVF高于WKY组，SHR+NPS2143组大鼠心肌细胞CVF高于SHR组，这表明高血压心肌重塑主要发生在高血压后期，应用CaSR抑制剂加重了这一过程的发生、发展。由于心肌肥厚早期的可逆转性，高血压患者发现左心室肥厚之后，积极有效的降压治疗可以最大限度地延缓病情进展，降低并发症的发生率［2］。本研究结果发现，干预0周SHR大鼠视网膜厚度高于WKY组，而心肌HW/BW%、LVW/BW%、CVF比较未见明显差异，这表明高血压视网膜结构改变早于心肌病变，提示可以通过视网膜血管检查评估高血压心肌重塑状态，且视网膜检查相较心脏检查更为简单易行，便于基层及社区医院开展，也极大提高了患者尤其是高龄患者的依从性，有助于高血压的筛查及早期防控，延缓高血压引起的心功能不全，降低意外风险与病死率。

早期研究发现，当患者发生高血压时，血清中VEGF表达水平升高［19］。研究指出VEGF可通过提高电压依赖性钙通道的激活电压，减少细胞外Ca2+进入细胞内［20］，可刺激血管生成［21］。临床上局部注射抗VEGF药物（如雷珠单抗，阿柏西普），可减少高血压性视网膜新生血管的生成。但大多数人对此治疗会产生抵抗力，治疗效果不佳，同时抗VEGF药物也可引起血管收缩与舒张功能失衡，导致全身血压升高［22］。本研究发现，干预16周SHR组大鼠视网膜中VEGFA表达增加。临床上将抗VEGF单克隆抗体作为血管生成抑制剂，通过阻断VEGF改善视网膜缺血和缺氧，抗VEGF治疗已被推荐为视网膜静脉阻塞（RVO）的一线治疗方法［23-24］。然而大多数人最终会对目前的血管生成抑制剂疗法产生抵抗，减弱治疗效果，因此提出通过应用G蛋白偶联受体可以降低VEGF抑制剂的耐受性［25］。在使用了CaSR抑制剂NPS2143处理后，SHR+NPS2143组大鼠视网膜中CaSR进一步减少，VEGFA表达明显增加。提示CaSR抑制剂通过减少CaSR活化增强VEGF在视网膜中的作用，临床中可通过拟钙剂与VEGF抑制剂的联合应用，在降低血压的同时，降低机体对VEGF抑制剂的耐受性，增强药物在高血压中的治疗效果。

综上所述，应用CaSR抑制剂，可减少CaSR活化，促进视网膜中VEGFA表达增加，加剧高血压引起的心肌重塑与视网膜血管病变的发展，且视网膜血管病变发生早于心脏，这也为临床高血压及其引起的靶器官损害的早期防控提供了新思路。但本研究也存在一定的不足，CaSR激活后可能会降低VEGFA表达，但其对眼压的作用因实验仪器的局限未能加以证明，有待后续研究。因实验仪器的局限未能对眼底进行检查或拍照，也有待后续研究验证。

作者贡献：赵佳琪提出研究选题方向，进行文章的构思与设计，负责数据收集和统计学分析；
赵佳琪、刘薇、唐娜、王腊梅负责撰写论文和论文修订；
刘薇、唐娜、屈媛媛、席冬梅负责数据收集、统计学分析、绘制图表；
钟华、何芳进行数据复核，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责；
所有作者确认了论文的最终稿。

本文无利益冲突。

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