5株H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA基因的序列分析
时间：2023-02-09 08:35:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
侯娟娟，王 艳，高亚东，李春秀，李山峰，孙景昱，张 越，尹建华
(青岛汇丰动物保健品有限公司，山东青岛 266109)
禽流感(avian influenza，AI)俗称“鸡瘟”，从1878年意大利暴发高致病性禽流感以来[1]，人类对禽流感的认识不断增加，1955年，schäfer[2]证实“鸡瘟”是由A型流感引起的。低致病性禽流感H9N2亚型毒株自1966年被分离发现至今已有50余年，1994年在我国广东首次分离到，临床表现为产蛋下降，并造成一定的死亡，实验室复制出典型的临床症状，但不致鸡死亡[3]。近年来，禽流感在我国部分地区时有发生，对我国养殖业造成严重损失,根据流感病毒囊膜表面有许多糖蛋白凸起，一类为由血凝素(HA)分子的三聚体构成；
另一类为由神经氨酸酶(NA)分子的四聚体构成。根据HA和NA的不同，可以分为HA(H1～H16)16种，NA(N1～N10)10种。HA是禽流感病毒表面的糖蛋白,是重要的保护性抗原，其裂解位点的序列可影响AIV致病性的强弱[4]。禽流感病毒会随着流行和发病时间的延长，同一病毒可能会从低致病性向高致病性改变，也可能出现因宿主同时感染多种亚型病毒而发生不同亚型禽流感病毒间的遗传重组，形成新的禽流感亚型病毒[5]。笔者将山东部分地区分离的5份疑似H9亚型禽流感的病死鸡解剖采集病料，并进行病原分离和鉴定，通过RT-PCR进行HA基因扩增、测序，结合查阅文献资料[6-7]，从美国国家生物信息中心(NCBI)下载参考株等序列进行基因序列分析，进一步了解所分离的毒株变异情况。
1.1 试验材料
1.1.1样品与毒株。青岛汇丰动物保健品有限公司于2020—2021年在山东部分地区养殖场采集疑似H9亚型禽流感发病鸡群病料5份，分别为HFA9-1WF、HFA9-2CY、HFA9-3XT、HFA9-4LW、HFA9-5LC。
1.1.2试剂及引物。
H9亚型禽流感病毒特异性血清、禽流感(H5、H7亚型)阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清购自中国兽医药品检查所；
病毒核酸提取试剂盒购自北京索莱宝公司；
RandomPrimer[nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9]、Recombinant RNase Inhibitor、dNTP Mixture、M-MLV、5×Buffer、PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye) 购自Takara公司；
引物由青岛汇丰动物保健品有限公司提供。
1.1.3SPF蛋、SPF鸡。购自济南赛斯家禽科技有限公司。
1.2 仪器超净工作台，购自苏州净化设备有限公司；
台式高速离心机，购自德国 Sigma公司；
涡旋器，购自其林贝尔仪器制造有限公司；
梯度 PCR 仪，购自美国 ABI公司；
化学发光凝胶成像系统，购自法国 Vilber Lourmat公司；
琼脂糖水平电泳槽，购自北京六一仪器厂；
恒温恒湿培养箱，购自天津市莱玻特瑞设备有限公司；
金属浴，购自杭州博日科技股份有限公司；
各种量程移液枪，购自 Eppendorf 公司。
1.3 方法
1.3.1病料采集与处理。从发病鸡群中挑出有典型临床症状的鸡,解剖采集病鸡气管、肝脏、肺脏等病变严重的部位，用灭菌生理盐水冲洗，再剪碎，以1∶5(W/V)加入灭菌生理盐水,用研磨器研磨匀浆后，反复冻融3次,6 000 r/min离心10 min,取上清过滤除菌后加双抗,于-20 ℃保存备用。
1.3.2病毒分离-鸡胚接种。将“1.3.1”中制备的组织液分别经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚，每份组织液接种5枚鸡胚，接后于37 ℃恒温培养箱内继续孵化，将24 h内死亡的鸡胚弃去，收获24～96 h死亡的鸡胚，测定其HA效价，并通过PCR方法进行鉴定。
1.4 血凝试验
1.4.1红细胞悬液制备。选2～4只2～6月龄公鸡，将血液采集到含有抗凝剂的溶液中混合均匀，以1 500 r/min离心5 min，吸弃上清，再加入原体积生理盐水悬浮红细胞并离心洗涤，共离心洗涤3～4次，直至上清液无色清亮。最后一次离心以2 000 r/min离心5 min。吸弃上清液，将沉淀的红细胞摇匀后吸取1 mL加入99 mL生理盐水摇匀配制成1%红细胞悬液。
1.4.2红细胞凝集价(HA)。将“1.3.1”中收取的尿囊液分别进行血凝试验，在96孔微量板上每孔加入25 μL生理盐水，再用加样器吸取25 μL待检样品加入第1孔中，吹打混匀后吸取25 μL加入第2孔中依次作倍比稀释直至所需倍数孔，并吸弃25 μL，最后孔留作阴性对照。稀释完成后，每孔加入25 μL 1%红细胞悬液，并振荡混匀，于37 ℃ 15 min观察结果。
1.5 血凝抑制试验将分离株分别与抗H9亚型禽流感病毒特异性血清、禽流感(H5、H7亚型)阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清反应。
1.5.1四单位配制。4个100%血凝单位(即4HAU)血凝素的配制根据现行《中国兽药典》附录方法。
1.5.2血凝抑制试验(HI)。用生理盐水将被检血清2倍比稀释，吹吸7±2次混匀，加入含4HAU的血凝素液，并设立生理盐水(即红细胞)和血凝素对照，充分振荡后在37 ℃作用15 min；
再加入1%红细胞悬液，静置室温40 min或37 ℃ 15 min，判定结果,以100%红细胞凝集抑制的血清最高稀释度作为判定终点(即血清凝集抑制价)。
1.6 样品病毒RNA提取用索莱宝总RNA提取试剂盒(Total RNA Extraction Kit)提取样品RNA。
1.7 病毒RNA反转录(RT)和PCR扩增
1.7.1反转录体系。总体积 20 μL:2.0 μL dNTP Mixture、4.0 μL 5×Buffer、0.5 μL M-MLV、1.0 μL RandomPrimer(nonadeoxyribonucleotide mixture;pd(N)9)、0.5 μL Recombinant RNase Inhibitor、12.0 μL RNA。反转录程序:30 ℃ 10 min 、42 ℃ 1 h。
1.7.2PCR扩增体系。总体积 25 μL:9.5 μL ddH2O、12.5 μL PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 plus dye)、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物、2.0 μL DNA。PCR程序:95 ℃ 5 min；
95 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 40 s，30个循环；
72 ℃ 10 min。
1.8 电泳鉴定配制浓度为1%的琼脂糖凝胶，在电泳槽中加入TAE溶液，分别在凝胶孔中加入PCR扩增样品、DNA Marker 2 000 bp、对照，电泳30 min后，通过紫外凝胶成像仪观察结果。
1.9 基因序列测定与Blast分析将扩增并经电泳鉴定后的PCR产物送往擎科生物科技有限公司测序，将测序结果拼接后在美国国家生物技术信息中心(NCBI)在线Blast系统比对序列。
1.10 序列分析在美国国家生物信息中心(NCBI)网站下载H9亚型毒株参考株和疫苗株的HA基因序列，同分离株样品测序结果用MegAlign进行HA基因序列分析，绘制进化树，并进行核苷酸同源性比较。
2.1 病料在鸡胚上的分离结果将采集于各地的5份病料组织液经尿囊腔接种于10日龄SPF鸡胚，连续观察72 h，结果发现5份样品在60～72 h出现不同数量的死亡，分别收取各组鸡胚尿囊液进行鉴定，结果见表1 。
表1 5份病料在鸡胚上的分离结果
2.2 血凝抑制试验结果5份尿囊液样品HA效价均在1∶128～1∶256，各组样品对H9亚型禽流感病毒特异性血清的HI效价在1∶102 4～1∶512 0，对禽流感(H5、H7亚型)阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清HI效价均为0(表2)。
表2 血凝抑制(HI)试验结果
2.3 PCR扩增与电泳结果将5份尿囊液样品提取RNA，经反转录、PCR扩增后，结果见图1。从图1可以看出，5份样品均在1 600 bp处出现目的条带，与预期片段大小相符，并无其他杂带，说明扩增的目的基因产物特异性较高。
2.4 测序与Blast结果将扩增的PCR产物送至青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序，5份样品均测序成功。分别将基因序列经Seqman软件拼接后，在美国国家生物技术信息中心NCBI上进行Blast分析，结果显示，与5份样品同源性最高的均为H9N2 亚型禽流感病毒。
2.5HA基因核苷酸序列分析根据相关研究报道[8],H9亚型禽流感分为欧亚系、北美系两大分支，北美系的代表株是A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)，欧亚系分支分为 Ⅰ 群、Ⅱ 群和Ⅲ群3个亚系，分别以A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)、A/Quail/HongKong/G1/97 (H9N2)、A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)为代表株。将分离的6个毒株的HA基因序列与从GenBank 中选出并下载的H9亚型毒株参考株和疫苗株的HA基因序列进行比对(表3)，并绘制进化树。经过序列比对分析，结果显示，分离的6个毒株之间的H9 亚型禽流感病毒HA基因核苷酸同源性为 93.3%～97.2%，并且它们处于同一分支，与参考株A/chicken/Beijing/1/1994(H9N2)的核苷酸同源性在85.9%～87.1%，与A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性较高，在89.2%～89.8%，与北美系代表株A/turkey/Wisconsin/66(H9N2)的同源性较低，在74.7%～76.2%；
与疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的核苷酸同源性最高，在92.1%～93.5%，与A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)的同源性在90.3%～91.7%。由图2可知，A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)、A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)与欧亚系 Ⅰ 群的A/Duck/Hong Kong/Y280/97(H9N2)在同一分支，A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)是欧亚系Ⅰ群h9.4.2.5的代表株，而6个分离株与A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)在同一支，且同源性较高，因此该试验所分离的5个毒株均属于欧亚系Ⅰ 群h9.4.2.5分支。
注：M.DL 2000D Marker;1.HFA9-1WF;2.HFA9-2CY;3.HFA9-3XT;4.HFA9-4LW;5.HFA9-5LC;A.阳性对照；
B.阴性对照；
C.空白对照Note:M.DL 2000D Marker; 1.HFA9-1WF; 2.HFA9-2CY; 3.HFA9-3XT; 4.HFA9-4LW; 5.HFA9-5LC; A.Positive control; B.Negative control; C.Blank control图1 5份分离株PCR电泳结果Fig.1 PCR electrophoresis results of 5 isolates
表3 选取的H9亚型AIV参考株和疫苗株的情况
图2 5株H9N2亚型AIV分离株HA基因进化树分析Fig.2 Analysis of HA gene evolution tree of 5 H9N2 subtype AIV isolates
(1)该研究对5份疑似H9亚型禽流感病料进行分离、鉴定，确定所分离的5份毒株均为H9N2亚型禽流感，并对5个毒株进行测序，与从美国国家生物信息中心(NCBI)下载的序列进行比对分析，并绘制进化树，通过分析显示，所分离的5个毒株均属于欧亚系 Ⅰ 群h9.4.2.5分支，5个毒株的H9 亚型禽流感病毒HA基因核苷酸同源性为 93.3%～97.2%，分离株与参考株A/chicken/Henan/G19/2011(H9N2)的同源性在89.2%～89.8%，与其亲缘关系最近的疫苗株A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012(H9N2)的同源性在92.1%～93.5%，说明分离株与参考株和传统的疫苗株产生了一定的遗传距离，出现了抗原差异。
(2)对于H9亚型禽流感病毒的防控，免疫接种仍是有效的防控措施，然而随着疫苗的长期使用，免疫压力的出现，使H9N2亚型禽流感毒株发生变异和重组[9-10]，如果疫苗株与流行株匹配度不高，就会导致疫苗株的保护率下降。因此，对于H9N2亚型禽流感的流行、变异情况的持续跟踪和监测，对筛选疫苗候选株有重要意义，今后可继续推进疫苗的研发，使H9N2亚型禽流感得到更有效的防控，这对了解该地区的H9亚型禽流感流行的变异情况及疫情防控对策具有重要意义。
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