小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白及其mRNA的动态变化
时间：2023-01-26 11:15:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
孙亚婷，贾瑶，朱爱珍
(运城市中心医院生殖医学科，运城 044000)
随着辅助生殖技术的发展，卵母细胞体外成熟技术取得了一定进展。周团萍等[1]的研究表明卵母细胞体内或体外成熟过程中线粒体相关凋亡因子2(AIFM2)和铁氧化还原蛋白1(FDX1)都参与了卵母细胞成熟过程，且体内和体外成熟的卵丘细胞AIFM2和FDX1表达水平无显著差异，但体外成熟的卵母细胞发育潜能仍不理想。有研究表明，体外培养的卵母细胞减数分裂成熟率、受精率和囊胚形成率均低于体内成熟的卵母细胞[2]。体外成熟还影响人卵母细胞的基因表达谱，涉及转录调控、胚胎发生、表观遗传学、发育和细胞周期的几个基因[3]，体外成熟还有待进一步优化。因此为深入理解卵母细胞成熟的分子机制，本研究选用体内成熟各阶段的卵母细胞为研究对象。
卵母细胞成熟是指从生发泡(GV)阶段到第2次减数分裂中期的减数分裂过程[4]。该过程的首要表现是在光镜下观察到生发泡的消失，称为生发泡破裂(GVBD)。GVBD后，卵母细胞通过第1次减数分裂中期(MⅠ)，随后第一极体排出进入第2次减数分裂并停滞在第2次减数分中期(MⅡ)直到受精发生。GVBD的启动受卵细胞成熟促进因子(MPF)的激活调控。MPF是异二聚体，由催化亚单位——细胞周期蛋白依赖性激酶-1(CDK1，又被称为cdc2或p34cdc2)和调节亚单位——细胞周期调节蛋白B(cyclinB)组成[5]。CDK1的分子量是34 kDa，通过与cyclin B结合形成MPF，诱导卵母细胞的减数分裂成熟[6-8]，在未成熟卵母细胞减数分裂恢复中起重要作用[9]。但是卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白和mRNA表达水平的变化及其相关性尚不清楚。本研究通过分别检测GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞CDK1蛋白及其mRNA的表达，阐明CDK1蛋白和CDK1 mRNA在小鼠卵母细胞体内成熟过程中的变化趋势和相关性，为进一步深入探讨卵母细胞成熟机制奠定一定基础。
一、实验动物
二、实验试剂及仪器
孕马血清促性腺激素(PMSG，M2620)、人绒毛膜促性腺激素(HCG，M2520)、M2培养基(M1250)和即用型透明质酸酶(M2215)均购自南京爱贝生物；
放射免疫沉淀法缓冲液(RIPA裂解液，P0013B)、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，ST447)、Tris缓冲盐溶液(TBS，ST667)、含聚山醇脂-20的TBS(TBSTw，ST673)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6×，P0015F)、100 mmol/L苯甲基硫酰氟(PMSF，ST506)、Tris-硼酸-EDTA缓冲液(TBE，ST723)、InstantViewTM红色荧光DNA ladder(D0117S)和InstantViewTM红色荧光DNA上样缓冲液(D0081)均购自上海碧云天生物；
BCA法蛋白定量试剂盒(PQ0012)购自杭州联科生物；
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(AR0138)和Tris-glycine-SDS电泳缓冲液(AR0139)均购自武汉博士德生物；
Meilunbiofg超灵敏ECL发光试剂(MA0186-1)购自大连美仑生物；
兔抗小鼠CDK1抗体(77055S)和HRP-山羊抗兔IgG抗体(7074)购自美国Cell Signaling Technology公司；
兔抗小鼠β-Actin多克隆抗体(20536-1-AP)购自美国Proteintech公司；
蛋白marker(26616)购自美国赛默飞世尔；
PVDF膜(R0BB30223)购自美国Merck Millipore公司；
2M DTT(B645939)、CDK1引物和β-actin引物(B661202)购自上海生工生物；
RNeasy Plus Micro试剂盒(Qiagen，74034)购自德国Qiagen公司；
PrimeScriptTMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(RR047A)和TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(RR820A)试剂盒均购自日本Takara公司；
倒置显微镜(DMI3000 B)和体式显微镜(S6D)购自德国Leica公司；
电泳仪(1645050)、高压电泳仪(POWER PACTM HC)、半干转膜仪(1703940)、全能成像系统(chemidoc MP)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测系统(CFX96 Deepwell)购自美国BIO-RAD公司。
三、实验方法
1.实验分组：将68只小鼠随机分成4组，根据获取卵母细胞的时期分为GV组、GVBD组、MⅠ组和MⅡ组，每组17只。每组11只小鼠获取的卵母细胞用于Western blot实验，剩余6只小鼠获取的卵母细胞用于qRT-PCR实验。
2.GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞的获取：参考之前文献的给药剂量[10]，给予6～8周龄SPF级ICR雌性小鼠腹腔注射PMSG 10 U。(1)GV期卵母细胞获取方法：腹腔注射PMSG 48 h后，小鼠颈椎脱臼处死。无菌条件下暴露卵巢，将整个卵巢置于预热的M2培养基(M1250)，冲洗两次，用1 ml无菌注射器针头撕成1 mm×1 mm×1 mm以下小块。在立体显微镜下选择大小适中、形状规则的GV期卵母细胞。机械去除颗粒细胞等杂质后将GV期卵母细胞收集到1.5 ml无菌离心管。(2)GVBD和MⅠ期卵母细胞获取方法：小鼠腹腔注射PMSG 48 h后，注射HCG 10 U，4 h后卵巢获取GVBD期卵母细胞，8 h后卵巢获取MⅠ卵母细胞。(3)MⅡ期卵母细胞获取：小鼠腹腔注射PMSG 48 h后，注射10 U HCG。12 h后，脱臼处死，无菌条件下暴露输卵管，放入预热的M2培养基，漂洗两次，用1 ml无菌注射器针头撕开，在立体显微镜下选择MⅡ期卵母细胞。颗粒细胞等杂质用透明质酸酶(M2215)去除，将MⅡ期卵母细胞收集于1.5 ml无菌离心管中。
3.Western blot实验：使用含有1 mmol/L PMSF的150 μl RIPA裂解液分别从200个GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞中提取总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒检测每个蛋白样品的浓度，各样本上样10 μg的总蛋白进行10%的SDS-PAGE电泳分离条带，然后将蛋白条带转移到PVDF膜中。将PVDF膜在含5%脱脂牛奶的TBST中室温封闭1 h后与TBST稀释的兔抗小鼠CDK1一抗(1∶1 500)或兔抗小鼠β-Actin一抗(1∶7 500)在4℃过夜孵育后再与TBST稀释的HRP-山羊抗兔IgG二抗(1∶4 500)室温下孵育30 min。采用Meilunbiofg超灵敏ECL发光试剂进行化学发光信号检测。使用ChemiDocTM成像系统获取图像，使用ImageJ 1.8.0软件对条带强度进行量化，β-actin作为内参对照。每个实验使用不同的生物标本重复3次。
4.RNA提取、逆转录和qRT-PCR：每50～100个GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞分别加入含有2 mmol/L DTT和4 ng/μl载体RNA的350 μl Buffer RLT Plus进行裂解。然后按照RNeasy Plus Micro试剂盒说明书提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒将总RNA反转录成cDNA。CDK1和β-actin的逆转录引物为RT Primer Mix。没有逆转录酶的逆转录反应作为阴性对照，以确认cDNA中没有基因组DNA污染。使用CFX96 Real-time PCR检测系统，按照TB GreenPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒进行qRT-PCR。CDK1引物序列为，F：5’-AGTTCATGGATTCTTCACTCGT-3’，R：5’-GTGTGTACACTCGTATCGGTAT-3’。循环程序设置为：95℃，30 s(预变性)；
95℃，5 s，60℃，30 s，40个循环。将β-actin作为内参，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，重复3次实验。qRT-PCR扩增产物中加入InstantViewTM红色荧光DNA上样缓冲液后2%琼脂糖凝胶电泳扩增条带，以确认特异性。
四、统计学分析
一、小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白的表达
分别收集200个GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞来研究CDK1蛋白表达，β-actin作为内参。Western blot结果显示，CDK1蛋白在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期均有表达(图1A)；
随着卵母细胞的体内成熟，CDK1蛋白表达量持续增加(P<0.05)(图1B)。
A：Western blot PAGE电泳图；
B：蛋白电泳灰度值定量统计图：与GV组比较，*P<0.05；
与GVBD组比较，#P<0.05；
与MⅠ组比较，▲P<0.05。图1 小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白的变化
二、小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1 mRNA的表达
分别收集50～100个GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞，采用qRT-PCR分析CDK1 mRNA表达水平，以β-actin作为内参。CDK1 mRNA在GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期均有表达；
与GV期比较，GVBD期和MⅠ期CDK1 mRNA表达水平均显著下调(P<0.05)，而MⅡ期CDK1 mRNA表达水平显著上调(P<0.05)(图2)。
A：qRT-PCR产物电泳图；
B：CDK1 mRNA相对定量统计图：与GV组比较，*P<0.05；
与GVBD组比较，#P<0.05；
与MⅠ组比较，▲P<0.05。图2 小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1 mRNA的表达
三、小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白及其mRNA表达的相关性
采用Spearman相关分析确定CDK1蛋白与mRNA变化的相关性。结果表明，小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白表达与CDK1 mRNA表达相关性较差(R=0.200，P=0.800，图3)。
图3 小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白和mRNA表达的相关性分析
体外受精周期的未成熟卵母细胞较多可能影响受精及胚胎发育潜能，导致可供移植的胚胎数减少[11]，妊娠率下降[12]。而哺乳动物卵母细胞的成熟是一个复杂的生物学过程[13]。未成熟的卵母细胞不具备受精能力，因为它们缺乏足够数量的细胞周期调节蛋白，特别是CDK1[14]。在牛GV期卵母细胞生长过程中，其CDK1蛋白逐渐积累[15]。CDK1蛋白含量限制了山羊GV期卵母细胞减数分裂能力的获得[16]。青春期前山羊GV期卵母细胞在体外培养27 h后其CDK1蛋白表达增加[17]。Chesnel等[18]的研究表明，小鼠体内卵母细胞生长到有能力完成GVBD的时候p34cdc2(CDK1)的合成和积累增加。而不管卵母细胞是否具备减数分裂能力，CDK1 mRNA的浓度都没有明显变化[7，14]。但现有研究几乎都局限于体外培养的或从不同大小卵泡液中获取的卵母细胞。目前尚无卵母细胞体内成熟不同时期CDK1表达情况的相关报道。
本研究从促排卵小鼠体内分别收集GV、GVBD、MⅠ和MⅡ期卵母细胞，Western blot结果表明，在GV期向GVBD转变过程中CDK1蛋白表达增加了近1倍，在GVBD向MⅠ期转变过程中CDK1蛋白表达增加了30%左右。而de Vant’ery等[19]通过Western blot实验证实小鼠GV期卵母细胞在体外发生GVBD后CDK1蛋白含量增加了4倍左右，这可能是体外培养上调了GV期向GVBD转化过程中卵母细胞CDK1蛋白表达谱。本研究通过qRT-PCR分析显示GV期向GVBD转变过程中CDK1 mRNA表达下调约20%，在GVBD向MⅠ期转变过程中CDK1 mRNA表达继续下调了近1倍，这与Firmani等[14]的体外研究结论不相符，也许是因为目前体外培养条件尚不能完全模拟体内环境，体外成熟改变了卵母细胞成熟相关的CDK1 mRNA的表达谱。由此，我们推测体内卵母细胞从GV期到GVBD、GVBD到MⅠ期转变过程中CDK1蛋白表达的增加并不是mRNA的表达量增加引起的，可能是由于其它机制使得mRNA翻译效率提高所致。本研究结果还显示，从MⅠ到MⅡ期，卵母细胞CDK1蛋白表达增加了近50%，CDK1 mRNA表达增加了4倍多，且MⅡ期卵母细胞的CDK1蛋白和mRNA的积累量达到最大值，这表明小鼠卵母细胞在MⅡ期储存了足够的母源CDK1 mRNA和蛋白质，为维持卵母细胞早期卵裂期胚胎的正常发育提供了保障[20]。
进一步的Spearman相关分析表明，小鼠卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白与其mRNA表达相关性较差，因此可见卵母细胞体内成熟过程中CDK1蛋白的增加并不完全是由转录水平的变化引起的，我们推测在转录后水平上可能还有其他机制影响CDK1蛋白的翻译。但还需要进行广泛而深入的研究，这对阐明人胚胎发育特征以及认识不孕不育等疾病发病机制具有一定的参考意义。
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