金桂根际土壤解磷菌对金桂幼苗生长及其内源激素的影响

王晓念，甘丽萍，陈代平，唐 恒，袁 莹，江润珍

（重庆三峡学院 a. 生物与食品工程学院；
b. 体育与健康学院；
c. 财经学院，重庆 万州 404100）

金桂Osmanthus fragransLour. 属于木犀科Oleaceae 木犀属Osmanthus，是集绿化、美化、香化为一体的经济物种。金桂具有极高的经济价值和观赏价值：其花、果和根都可入药，其花还可用来制作糕点和花茶；
金桂枝叶浓密，花香色艳。金桂抗逆性强，适生范围广，还是山体造林和水土涵养的优良树种。

植物的整个生命周期都离不开磷元素。土壤中的磷元素主要以有机磷和无机磷两种形式存在。在其被施入土壤中的当季，磷肥的利用率约为25%；
残留的磷元素在酸性土壤中易被螯合固定，以难溶性的矿石或有机物的形式存在，植物难以吸收利用[1-3]。而土壤中存在的解磷菌（Phosphate solubilizing bacteria，PSB）能将磷转化为可吸收利用的形态[4]。解磷细菌能分泌一些植物生长素，促进植物的生长与代谢，改善植物的多种农艺性状并促进植物的生长发育，还能提高部分农作物的产量。根际细菌和菌根真菌的相互作用可以促进植物生长，改善植物与其根际土壤的养分状况，影响根际土壤的微生物环境[5]。PSB 对小麦[6]、高粱[7]等多种农作物生长量与产量的增加和提高都有促进作用。在木本植物中，解磷微生物不仅能够增加土壤中可溶性磷的含量，其自身也能在林木根际周围形成优势种群，可以增强林木的抗病能力[8]。在微生物生长过程中加入适量生长调节剂，能够促进其细胞的新陈代谢，促进微生物的分裂与增殖，提高菌体的生长速度和产酶能力[9]。生长调节剂影响着菌体的生长、发育与成熟等，也将直接影响着甾体转化酶的活性和甾体底物的转化。因此，筛选出适合不同植物生长所需的PSB，构建并完善解磷微生物的菌种资源库，可以有效提高磷的转化利用率，还能缓解我国磷肥资源紧缺及生态环境被破坏的问题[10]，推动国家关于农药化肥双减双控政策的实施，提高环保高效的生物菌肥的利用效率，减少农药用量，促进绿色农业、生态农业、环保农业的发展。

目前，对土壤解磷菌的研究主要集中在无机磷菌株的筛选[11]，所研究的作物主要为小麦[7]、高粱[8]等，且所研究的生物菌肥多用于豆科、茄科等作物的生产中[12-13]。但是，有关经济植物和观赏植物根际解有机磷细菌的研究报道均较少，且相关研究内容主要为解磷能力与菌株基因功能[14]、菌株产生有机酸等代谢途径的改变进而促进植物生长[15]及钝化重金属[16]等方面，这严重制约着经济植物和观赏植物生物菌肥的开发与利用。而生长调节剂已经广泛应用于植物和动物的生长发育与调控之中，如发酵菌种黑根酶催化甾体微生物的转化反应[17]，该复合型生长调节剂的添加，可以促进菌体的生长，提高底物的转化效果。然而，有关解磷细菌对桂树生长发育的影响及其与植物体中激素的关系以及植物生长调节剂（生长素类）对PSB 是否有影响等问题的研究尚未见诸报道。为了获得适合金桂生长的高效解有机磷细菌，提高土壤磷素利用率，为微生物磷肥的开发提供高效的菌种资源，本研究从金桂根系土壤中分离纯化解有机磷细菌，并将其制成菌液添加到金桂插穗与移栽苗的培养土壤中，观察解有机磷细菌对金桂插穗与移栽苗生长的影响情况，分析PSB 对金桂树体内源激素含量的影响情况和外源激素对PSB 生长繁殖的影响情况，以明确PSB 促进金桂插穗和移栽苗生长的作用机理。

1.1 材 料

1.1.1 金桂材料的采集

供试树种为重庆三峡学院校园内栽培的金桂O. fragransLour，2020 年5 月采集其种子并沙藏以备用。2020 年9 月上旬，以棋盘式随机取样法选取7 年生的金桂样树9 株，采集其上部1 年生枝条以备扦插之用。

1.1.2 土壤样品的采集

以选定的金桂样树树冠投影边线为界线，除去土壤表层的枯枝落叶和灌木草本植被等杂物，采用掘根抖落的方法，挖取深度为 10 ～20 cm 的毛细根，收集金桂样树根际土壤样品并装入无菌袋中，每株样树各收集1 份土壤样品，每份土壤样品各100 g，共收集9 份土壤样品，其编号分别为#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#8、#9。将 采集的土壤样品带回实验室保存于4 ℃的冰箱中，以用于后续PSB 的分离与筛选。

1.1.3 试 剂

生根粉（ABT-1），购自中国林业科学研究院，将其浓度分别配制为100、150、200 mg·L-1以备用。

1.1.4 培养基

有机磷液体培养基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·2H2O 0.03 g，KCl 0.3 g，CaCO3卵磷脂0.2 g，酵母膏0.4 g，双蒸水1 000 mL，pH值为7.0。

有机磷固体培养基：在有机磷固体培养基里加入20 g 琼脂。

细菌基础培养基（LB 培养基）：参照有关文献中的配方[18]配制而成。

1.2 方 法

1.2.1 PSB 的分离纯化、复筛与鉴定

分别称取10 g 土样放入装有90 mL 无菌水的灭菌三角瓶中，置于摇床中以200 r·min-1的转速振荡40 min，即得到0.1 倍的土壤稀释液，并依次稀释至合适的倍数。静置2 min 后，移取0.1 mL的土壤稀释液，将其均匀地涂布于已灭菌的有机磷固体培养基上，置于28 ℃的恒温培养箱中培养48 h。挑取有透明圈的单菌落，纯化3 代后，将纯化的菌株接种到LB 培养基上，然后将其置于4 ℃的冰箱中保存以备用。采用溶磷圈法，将待测菌株点接于有机磷培养基上，于28 ℃的恒温培养箱中培养72 h 后，再将其接种于LB 培养基上，接种48 h 后，观察并记录菌落的形状、大小、边缘特征等，然后对纯化的菌株进行革兰氏染色处理，观察其形态，并进行生理生化试验。选取5 个长势较好、解磷能力较强的菌株培养72 h，调查其生长时长。

1.2.2 PSB 对金桂插穗生长及其内源激素的影响的试验设计

选取金桂当年新生枝条，剪成长度约为8 cm、带有2 ～3 个叶芽的茎段，保留上部2 片叶，剪去叶片总长度的一半，将已剪好的金桂插穗用0.5%的高锰酸钾溶液浸泡24 h 后再用清水冲洗5 min以备用。采用4 份河沙＋3 份腐叶土＋3 份珍珠岩的配方配制所用基质，将配制好的基质置于阳光直射下暴晒消毒后装入上口径为15 cm、下直径为10 cm、高为8 cm 的塑料花盆中，再将浸泡好的插穗插入基质中，插入深度为3 ～4 cm，每个花盆各插入2 段插穗，然后将其置于正常的生长环境下培养，共培养100 盆。

利用有机磷液体培养基培养PSB，培养完成后加入无菌水洗脱，并用脱脂棉过滤，制备成PSB 菌液，将其浓度分别稀释为103、106、109CFU·mL-1，其处理组编号分别为A、B、C。扦插7 d 后，每盆中各加入不同浓度的PSB 菌液150 mL，以加入清水的为对照（CK）组。A、B、C 组及对照组各重复25 盆，分别于培养7、15、25、35、45、55 d 时取样，清洗处理后的插穗，并于距离基部2 cm 处切片，将其保存于-70 ℃的超低温冰箱中以备用。采用HPLC 分析法测定插穗中生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）这3 种内源激素的含量[19]，重复3 次。于扦插60 d 后统计金桂插穗的成活率及生根数。

1.2.3 PSB 对金桂移栽苗生长的影响的试验设计

采用上述方法，将稀释好的3 种浓度（103、106、109CFU·mL-1）的PSB 菌液分别接种于金桂移栽苗的培养土中，然后将已接种PSB 菌液的栽培土装入花盆中（每个花盆各装土壤5 kg），再将株高为（300±50）mm 的金桂移栽苗栽入花盆中，每盆分别浇水1 000 mL，在每个花盆中再加入已配好的PSB 菌液150 mL，每个处理组重复栽培25 盆，分别于盆栽30 、60 、90、180 d 时测量移栽苗的根系数量。待金桂移栽苗在接种了PSB 的土壤中生长180 d 后，挖出移栽苗，测量其地上部分和地下部分的总鲜质量、总干质量和叶片中的全磷含量。用H2SO4-H2O2消煮法处理金桂移栽苗叶片，采用钼锑抗比色法[19]测定叶片中的磷含量。

1.2.4 PSB 与外源激素的协同作用对金桂插穗的影响的试验设计

选取最能促进金桂插穗和移栽苗生长的浓度为106CFU·mL-1的 PSB 菌液1 mL，将其添加到牛肉膏蛋白胨培养基中，然后加入浓度分别为100、150、200 mg·L-1的生根粉1 号（ABT-1）溶液，每组各设3 次重复，以加入无菌水的为对照。扦插方法同1.2.3 段所述，每组重复试验25 盆，扦插前将插穗浸泡3 h，以清水浸泡插穗为对照。待插穗生长60 d 后调查其成活率与根数量。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 软件进行数据统计与分析，采用Photoshop 2021 软件制图。

2.1 金桂根际土壤中PSB 的分离纯化结果

从9 份金桂样树根际土壤样本中共分离得到PSB 菌 株19 株，分 别 编 号 为YB1、YB2、YB3……YB19，各个菌株的菌体形态和菌落特征见表1。选取5 个长势较好的菌株，将其置于平板上培养，结果如图1 所示。

图1 平板培养的5株PSB菌株的菌落形态Fig. 1 Colony morphology of five PSB strains cultured on plate

表1 金桂样树根际土壤样本中分离出的PSB菌株的菌体形态和菌落特征Table 1 Morphology and colony characteristics of PSB strains isolated from rhizosphere soil samples of O. fragrans

由表1可知，菌体的形态分别呈杆状和椭圆形，菌落周边规则或不规则，菌落颜色为乳白色或白色，菌落表面都湿润，解磷圈的颜色为无色或者乳白色。将菌株进行革兰氏染色后，菌株的菌体多呈椭圆状、长杆状、短杆状这3 种形状，仅有1 株菌体呈球形。

对选取的5 个菌株的生长速度进行调查，结果如图2 所示。由图2 可知，随着菌株生长时间的增加，菌落的数量均有增加；
当其生长时间为0 ～16 h 时，其菌落数的增长速度均较缓慢；
当其生长时间为16 ～40 h 时，其增长速度均最快；
当其生长时间为40 ～56 h 时，其增长速度均变缓；
当其生长时间为56 h 时，其PSB 菌落的数量均达到最大值；
在其生长时间为56 h 后，其PSB菌落的数量基本保持不变。

图2 金桂样树根际土壤中分离出的5株PSB菌株的生长速度Fig. 2 Growth rate of 5 PSB strains in rhizosphere soil of O. fragrans

2.2 PSB 浓度对金桂插穗成活与生根的影响

在金桂插穗培养土壤中添加一定浓度（103～106CFU·mL-1）的PSB 菌液，对金桂插穗的成活率与根数量都有一定程度的影响，试验结果如图3所示。由图3 可知，当PSB 浓度为106CFU·mL-1时，插穗成活率达到了78%，较其对照组提升了37%左右，此时根的数量也增加了83%，不同浓度处理组的成活率与根系数量均存在显著性差异；
当其浓度上升到109CFU·mL-1时，不同浓度处理组的成活率与根系数量均迅速下降，金桂插穗的成活率均不到50%，其根系数量均下降了50%，说明高浓度的PSB对金桂插穗反而会起到抑制作用。

图3 解磷菌浓度对金桂插穗成活率和根系数量的影响Fig. 3 Effects of concentration of phosphate solubilizing bacteria on survival rate of cuttings and number of roots of O. fragrans

2.3 PSB 浓度对金桂插穗中3 种内源激素含量的影响

接种到培养土壤中的解磷菌的浓度对金桂插穗中的生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）这3 种内源激素含量的影响情况如图4 所示。

由图4 可知，扦插初期，插穗中IAA 的含量，对照CK（未添加PSB 菌液）组与处理组的都在增加；
扦插0 ～25 d，A（PSB 浓度为103CFU·mL-1）、B（PSB 浓度为106CFU·mL-1）、C（PSB 浓度为109CFU·mL-1）组插穗中IAA 的含量均呈上升趋势，但 CK 与C 组的IAA 含量均明显低于A、B 组的；
且CK、C 组与A、B 组之间插穗中IAA 的含量差异较大，A、B 两组插穗的基部均明显膨大。扦插25 d 后，A、B 组插穗中IAA的含量均先呈下降趋势而后却一直保持上升趋势，而CK 与C 组插穗中IAA 的含量始终均无明显的上升趋势。A 与B 两组插穗的成活率和生根率均明显高于CK 与C 组的。由此可知，在培养土壤中接种一定浓度的PSB，能提高插穗中IAA 的含量。

图4 接种不同浓度的解磷菌对金桂插穗中3种内源激素含量的影响Fig. 4 Effects of different concentrations of phosphate solubilizing bacteria on the content of endogenous hormones in O. fragrans cuttings

插穗中ABA 的含量，C 组明显高于其他3 组，C 组与A、B、CK 组之间插穗中ABA 的含量差异均较大，说明C 组插穗的存活数与生根数都是最少的，表明浓度过高的PSB 会影响ABA 的合成，对插穗生根起着抑制作用；
而B 组插穗中ABA 的含量始终低于其他3 组的，C 组插穗中ABA 的含量略低于CK 组的，说明浓度为103～106CFU·mL-1的PSB 在一定程度上抑制了ABA 的合成。

插穗中GA 的含量，A、B、C 组均呈现出先增加后减少的变化趋势，扦插15 d 后其含量均达到最高值，随后一直减少，此时正是插穗大量形成不定根的时候。A、B 组插穗中GA 的含量始终低于CK 组的，且B 组与CK、A、C 组的相比差异明显；
而C 组插穗中GA 的含量始终高于CK 组的。这一结果与前文所述C 组插穗的存活率与生根数均不及CK 组的结果一致，说明较低水平的GA对其生根具有一定的促进作用，而浓度为103～106CFU·mL-1的PSB 在一定程度上抑制了插穗生根时GA 的合成。

2.4 PSB 浓度对金桂移栽苗根系生长与各项生理指标的影响

分别在金桂移栽苗生长30、60、90 和180 d时测定每组移栽苗的根系数量，结果如图5a 所示。由图5a 可知，在金桂移栽苗生长30 和60 d后，与CK（未添加PSB 菌液）组相比，A（PSB 浓度为103CFU·mL-1）、B（PSB 浓度为106CFU·mL-1）、C（PSB 浓度为109CFU·mL-1）组移栽苗根系数的差异都没有达到显著水平；
在移栽苗生长90 d 时，B、C 组的根系数量与CK、A 组的根系数量的差异均达到了显著水平（P＜0.05）；
到移栽苗生长180 d 时，B、C 组与CK、A 组的根系生长均保持着与之前相同的变化趋势，PSB 浓度分别为109与106CFU·mL-1的处理组间其根系数的差异也达到了显著水平（P＜0.05），表明浓度越高，PSB 对金桂移栽苗根系生长的促进作用越大，且能持续促进金桂根系的生长。

在金桂移栽苗接种解磷菌180 d 后，4 个组的金桂移栽苗的生长状态如图5b 所示。从图5b中可以看出，金桂移栽苗接种解磷菌后，解磷菌对移栽苗根系的生长起到了一定的促进作用，当PSB 浓度为109CFU·mL-1时，移栽苗的根部生长更为旺盛、增粗明显，新生根的数量更多，说明接种PSB 对金桂移栽苗的生长极其有益，且PSB的浓度在适宜范围内越高越好。随着金桂插穗的生长发育，所需PSB 浓度也在逐渐增加，但移栽苗在不同生长时期所需PSB 的浓度有差异。

图5 不同浓度的PSB菌液对金桂移栽苗生长的影响Fig. 5 Effects of different concentrations of PSB on the growth of transplanted seedlings of O. fragrans

在金桂移栽苗接种解磷菌180 d时对金桂移栽苗的各项生长与生理指标进行了测定，结果如图6 所示。由图6 可知，A（PSB 浓度为103CFU·mL-1）、B（PSB 浓度为106CFU·mL-1）、C（PSB 浓度为109CFU·mL-1）组金桂移栽苗地上部分和地下部分的总鲜质量较对照（未接种解磷菌，CK）组的分别高出1.5%、15.8%、28.6%，且B、C 组与CK组间其差异均达到了显著水平（P＜0.05）；
A、B、C 组移栽苗地上部分和地下部分的总干质量较对照（CK）组的分别高出2.2%、18.3%、38.9%，且B、C 组与CK 组间其差异达到了显著水平（P＜0.05）。A、B、C 组移栽苗叶片中的全磷含量较对照（CK）组的分别高出3.1%、28.1%、46.9%，且B、C 组与CK 组之间其差异均达到了显著水平（P＜0.05）。同时，B 组和C 组的移栽苗在其地上部分和地下部分的总鲜质量、总干质量和叶片中全磷含量的差异也都达到了显著水平（P＜0.05）。

图6 不同浓度的PSB菌液对金桂移栽苗各项生长与生理指标的影响Fig. 6 Effects of different concentrations of PSB bacteria on growth and physiological indexes of transplanted seedlings of O. fragrans

2.5 外源激素ABT-1 与PSB 的协同作用对金桂插穗成活与生根的影响

浓 度 为106CFU·mL-1的PSB 与 不 同 浓 度 的ABT-1 的协同作用对金桂插穗成活率和生根数都有一定程度的影响，试验结果如图7 所示。从图7中可以看出，ABT-1（150 mg·L-1）+PSB 处理组合的插穗成活率显著高于其他处理组合的；
从根系数量来看，ABT-1（100 mg·L-1）+PSB 处理组合的插穗根系数显著高于其他处理组合的。这一试验结果说明，浓度为100 ～150 mg·L-1的ABT-1 与浓度为106CFU·mL-1的PSB 的协同作用能够有效促进插穗的成活与生根。

图7 不同浓度的外源激素ABT-1和浓度为106CFU·mL-1的PSB的不同处理组合对金桂插穗成活率和根系数的影响Fig. 7 Effects of different combinations of exogenous hormone ABT-1 and PSB with concentration of 106 CFU·mL-1on cuttings survival rate and root number of O. fragrans

本研究从金桂根际土壤中共分离得到19 个PSB 菌株，将其配制成菌液，然后用PSB 菌液来处理金桂插穗，结果提高了插穗的成活率和根系数量。在栽培土壤中添加浓度为109CFU·mL-1的PSB 菌液，这对金桂移栽苗的生长有着较大的促进作用，其根系数量也明显地增多；
但是，浓度为109CFU·mL-1的PSB 菌液对金桂插穗的生长却有一定程度的抑制作用。可见，在金桂幼苗（包括插穗和移栽苗）生长的不同阶段其所需PSB 的有效浓度不同。浓度为100 ～150 mg·L-1的外源激素ABT-1 和浓度为106CFU·mL-1的PSB 的协同作用能有效促进金桂插穗的成活和生根。

许多研究者认为，PSB 通过改善土壤磷元素的营养状况而促进植物的生长；
也有研究者认为，PSB 分泌的生长调节物质，促进了植物根系的生长，PSB 可能具有解磷和促进植物生长的双重作用[20]。植物根际溶磷菌可以提高植物对土壤磷元素的利用效率，对根瘤菌的结瘤和固氮具有促进作用，还有分泌IAA 的特性[21]。PSB 分泌的植物激素能调节植物的生长发育，还能促使植物对各种营养元素的吸收[22]。

植物不定根的发生受多种因素的影响，而内源激素及外源激素在根原基的形成中起着关键作用[23]。在通常情况下，ABA 被认为是扦插生根的抑制剂，高浓度的内源激素GA 与ABA 会抑制不定根的形成[24]。测定结果表明，在栽培土壤中添加浓度为106CFU·mL-1的PSB 菌液后，能在一定程度上促进金桂根系的发育，且插穗中GA 与ABA 的含量始终保持在较低的水平上，这对其不定根的形成能起到一定程度的促进作用；
而IAA是促进插穗生根、形成愈伤组织的主要内源激素，新根的生成促使金桂插穗体内合成IAA，以PSB菌液处理插穗后，其体内的IAA 含量从扦插初期直到试验结束时始终保持在一个较高水准上，这一结果表明，适宜浓度的PSB 对金桂插穗中的激素水平具有较好的调节作用，能促使插穗合成更多的IAA，抑制ABA 与GA 的合成，从而促进插穗的生根发育。

俞新玲[25]将从桉树根际土壤中提取出的PSB接种到桉树苗木上，结果表明，不同处理的PSB菌株对桉树生长均有一定的促进作用；
王莉晶[26]分析了小麦根际土壤中的PSB 对小麦生长的影响情况，结果发现，PSB 的添加对小麦幼苗生长也有一定的促进作用，但是，浓度过高的PSB 反而会抑制小麦的生长，这一研究结果与本研究结果一致。根际PSB 除了对金桂插穗及移栽苗的生长都有促进作用之外，其对金桂的开花及其种子的形成是否也有作用，对此问题还需要进一步的调查与探究。

外源激素对插穗生根的影响途径，可能不是直接改变某种内源激素的含量，而是通过促使各种内源激素之间达到一定程度的平衡，从而促进插穗生根的[27-28]；
外源激素能影响微生物菌体的生长、发育与成熟。已有研究者报道，在豆科植物中，植物激素对根瘤菌的形成和发育起着调控作用[29]。研究发现，植物激素和PSB 的协同作用能够促进植物生长，后期将深入探究其协同作用产生的机理。我国研究人员已从杉木等林木根际土壤中筛选和分离到多种具有高效解磷能力的优质菌株，并利用这些菌株开发出了生物有机肥，用于改善经济林木所需磷素的养分状况以促进林木的生长，这类生物有机肥具有较大的应用潜力[30]。

然而，本研究还未完成主要PSB 菌种的分子鉴定，接下来将对主要菌种进行鉴定。同时，将在金桂大田栽培生产中探索具体的PSB 的添加浓度和添加方法，为金桂解磷微生物的发现及其生物肥料的开发开展更加深入的研究，以期开发出更为高效的微生物菌肥。

猜你喜欢 金桂解磷菌液 解磷菌、解钾菌和固氮菌的分离筛选与鉴定生物灾害科学(2022年2期)2022-10-15解磷微生物及其在盐碱土中的应用研究进展①土壤(2021年6期)2022-01-24多糖微生物菌液对油菜吸收养分和土壤氮磷淋失的影响中国土壤与肥料(2021年5期)2021-12-02一株土壤解磷细菌发酵条件的优化泉州师范学院学报(2021年2期)2021-05-27单细胞拉曼光谱在环境解磷微生物中的应用研究磷肥与复肥(2021年2期)2021-03-03金桂飘香作文小学中年级(2020年9期)2020-09-29Bonfire Night疯狂英语·新悦读(2020年7期)2020-07-30鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验中通过吸光度值测定菌液浓度的方法研究癌变·畸变·突变(2020年1期)2020-02-12探究金桂栽植及养护技术财讯(2019年33期)2019-08-04“金桂，你等等我！”作文周刊·高二版(2016年32期)2017-04-13