海南桥头地瓜硒多糖的提取、分离和分析①
时间：2023-01-25 09:45:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
郭利芳 苏鹏 周树权
（1 海南职业技术学院 海南海口 570216；
2 海南省商业学校 海南海口 570100）
19世纪初瑞典化学家发现硒后，有关研究经历漫长发展。20世纪50年代初首次证明硒的营养作用，发现硒是机体正常生命活动的必要元素，可以发挥抗癌等生理作用。硒的研究从无机硒到植物硒不断丰富。1990年后国内外开发诸多硒产品，研究方向转变为提取有机硒，带动富硒产业的发展。硒多糖避免无机硒毒性，逐渐引起人们的关注。研究发现硒多糖对高血脂与病毒具有抑制作用，充分认识硒多糖结构用于医药研制具有巨大价值。地瓜在世界食品贸易中占据重要地位，是重要的农业经济作物。地瓜具有增强神经兴奋等功能，海南澄迈县桥头镇土壤富含硒元素，沙土瓜皮色红，青脆可口，全镇种植面积达666.67 hm2，被誉为海南富硒之乡。随着饮食结构的改变，当前人们对食物营养价值日益关注，桥头地瓜风味独特，具有药用保健功效，其开发应用前景广阔。研究桥头地瓜硒多糖提取分离，对打造桥头地瓜品牌，带动当地农业产业经济发展具有重要意义。
多糖广泛分布于多种生物体中，是构成生命四大基本物质之一，根据来源分为动植物多糖与微生物多糖。多糖在食品行业广泛应用，多糖生物资源开发研究成为天然药物与生命科学研究热点。硒是生物体必需的微量元素，可以保护细胞膜结构功能，对生育视力等具有重要影响。低毒硒化合物研发日益受到重视［1］。自然界中硒以多种形式存在，无机硒主要有亚硒酸、硒酸钠等。硒多糖是生物体对无机硒生物有机化形式，硒多糖研究具有开发价值。
植物硒多糖来源于根茎叶皮种花，目前已有300多种多糖类化合物从天然产物中分离。植物细胞壁较为牢固，要去除组织表面脂肪释放多糖。通常将原料捣碎加入甲醇进行脱脂，稀酸中提取多糖。酸碱性引起多糖降解，可以用超声波处理加速多糖释放。纯化是多糖研究的关键，植物多糖纯化分为分离与分级纯化，分离纯化是去除粗多糖中的无机盐与小分子有机物等杂质，分离纯化步骤包括脱色、除蛋白等；
分级纯化是多糖混合物分离为单一多糖，分级纯化需要结合多种方法纯化［2］。常用的方法包括柱层析法与沉淀法。其他纯化方法有超过滤法、活性炭柱色谱等。国外采用紫外检测多糖，分离效果良好。
植物多糖表征鉴定方法有糖含量测定，纯度鉴定等。多糖含量测定通常采用比色法，利用多糖在强酸下水解后脱水生成糖醛，与酚类等化合物缩合生成物质进行测定。多糖纯度标准不能用小分子化合物衡量，其纯度代表某多糖相似链长平均分布，多糖纯度鉴定方法有超离心法、凝胶过滤法等。需要多种方法鉴定多糖均一性。多糖分子量分布较为分散，以往常用测定方法有粘度法等，目前常用方法有高效液相色谱法等。组成多糖单糖品种繁多，连接方式不同造成多糖结构测定困难［3］。通常研究仅限于多糖一级结构，多糖一级结构分析方法分为理化生方法。化学分析法有高碘酸氧化、甲基化反应等。仪器分析法是研究多糖结构特性，具有快速灵敏等优点，目前应用较多的有UV，GC等。现代分析仪器出现促进多糖链结构研究工作发展。
植物多糖化合物由于其独特功能显示广阔的应用前景，在提高免疫，降血糖血脂等方面具有良好效果。多糖抗肿瘤分为具有细胞毒性的多糖杀死肿瘤细胞，生物免疫反应调节剂间接抑制肿瘤细胞。自由基是人体衰老的原因，人体自由基产生过多会攻击各种细胞器官。研究表明灌喂枸杞多糖提高衰老小鼠体内超氧化物岐化酶活性，降低脂质过氧化物丙二醛含量。多糖降血糖活性通过影像糖代谢酶硒活性抑制糖的异生。经过多年发展，多糖研究发现许多具有重要生物活性植物多糖，随着多糖制备结构及临床研究深入，其低毒效应在临床应用中显示巨大潜力［4］。低含量植物中分离提取技术，结构鉴定等方面研究是未来方向。
1817年，瑞典化学家Berzelius在生产硫酸尾矿中发现硒。1957年，美国科学家Foltz发现硒可防治大鼠肝坏死。常见的无机硒有硒酸钠，无机硒具有蓄积毒性作用，有机硒毒性低，可以更好地发挥硒的作用，多糖具有多种生物功能，硒多糖结合转化可以优化硒多糖的生理药理功能。很多研究者在植物中发现硒多糖存在，近年来研究者不断创新技术，使得硒多糖日益受到关注［5］。硒多糖来源分为化学合成法、从富硒植物中提取。人工方法获取硒多糖是讲无机硒添加到培养基中，对硒进行富集获得硒多糖。
硒多糖提取分离纯化与多糖方法类似，包括去除大分子，对蛋白质等大分子需通过特定手段去除。脱蛋白后组分需进行纯化，硒多糖纯化法主要参考沉淀法、柱层析法等。结构是决定生物大分子生理活性的基础，需要探索硒多糖结构了解硒多糖生理活性。硒多糖结构分析法包括红紫外分析法、高效液气相色谱法，核磁共振等。硒多糖硒含量测定常用DAN荧光法，随着分析手段的发展，很多分析方法用于硒的分析测定，如电感耦合等离子体等，硒多糖中多糖含量可用硫酸法测定。硒多糖分子量可用HPLC等方法测定，薄层色谱、高效液相色谱等方法分析单糖组成。硒多糖中羟基取代情况可用甲基化反应等方法分析。硒参与多种酶的组成代谢，具有延缓衰老等生理功能，多糖是具有广谱的免疫促进剂，具有抗感染、抗凝血等作用。硒多糖是有机硒化合物，是生物体将无机硒转化为有机硒有效形式。
硒多糖具有增强机体免疫功能，抗氧化损伤作用，降低某学有毒元素毒性等效果。研究表明硒可调节免疫功能，T淋巴细胞特异性增殖作用降低，国产新药硒酸酯多糖临床研究表明，药物延长荷瘤鼠的生存时间［6］。化放疗患者口服硒酸酯多糖后免疫球蛋白G含量上升。服用硒酸酯多糖组患者巨噬细胞吞噬率高于对照组。研究表明许多疾病发生与脂质过氧化反应有关。产生脂质过氧化产物是损害机体主要途径，硒是人体必需微量元素，研究发现硒云芝多糖提高机体组织谷胱甘肽过氧化物酶的活性，有效提高机体抗氧化能力。近年来研究了解硒多糖一些功能，但其生化特性尚不清楚，硒多糖构效关系等方面直接证据不足。通过实验分析纯化深入研究硒多糖结构功能对药品保健品开发具有重要社会经济效益。
硒是人体维持生命活动必要元素，硒有益于某些植物生长发育。目前人们未从植物中得到明确结构的硒化合物。硒在世界上分布不均匀，海南澄迈县桥头镇是著名高硒区，境内地瓜产业蓬勃发展［7］。硒在疾病防治方面具有多种功能，缺硒导致多种疾病发生。通过实验研究桥头地瓜硒多糖结构生化功能，有助于全面了解桥头地瓜营养价值，促进当地地瓜农产品产业发展，提高社会经济效益。本文通过对湖南澄迈县桥头镇地瓜硒多糖提取分离分析，研究地瓜硒多糖初步结构，为产品开发提供参考价值，充分利用桥头镇特产资源，带动地方经济社会发展。
研究发现缺乏维E饮食中添加硒可防止营养性肝坏死，近年来有关硒的生物医学作用研究转向有机硒化合物。海南省澄迈县桥头镇是我国高硒区，具有富硒之乡称号，一些区域植物含硒量比一般地区高数十倍，专家建议对富硒植物有机硒应用研究。天然产物研究具有一定难度，大分子间的分离纯化较为困难。桥头地瓜硒多糖获得要经过原料粉碎等步骤，提取中采取溶剂浸提法。常用的提取液法是有机试剂沉淀法，脱蛋白是硒多糖分离纯化的重要环节。
高温浸提植物多糖可提高多糖溶出率，以桥头地瓜甘薯进行不同条件预实验，发现高温下对实验田种植地瓜多糖浸提不可取，高温下非功能性多糖溶出率较高。由于淀粉存在使得脱出淀粉家中后续脱蛋白负担。对预实验部分调整，从试验田中地瓜提取硒多糖选择良好块茎，切片后鼓风干燥，过80目晒干燥器备用，硒多糖提取后获取上清液，乙醇沉淀分离，乙醇分离洗涤后透析干燥。操作中烘干50℃干燥至恒重；
沉淀遵循快叫慢加原则，封闭后4℃静置24 h。硒含量测定参考国标，将样品置于消化管后加入5.0 mL硝酸混匀消化。将消化管置于200℃加热板加入5 L 6 mol/L的盐酸，消化管底部剩余1 mL消解液取放置室室温下冷却。取6支离心管加入硒标准溶液，以去离子水定容至5 mL，加入0.5 g铁氰化钾测定原子荧光。
测定多糖含量试剂包括葡萄糖标准溶液，质量分数5%苯酚溶液。取对应具塞试管取样，室温静置30 min于490 nm波长处测定吸光度。吸光度为纵坐标绘制标准曲线。将样品配制成溶液在规定时间内测吸光度。测定蛋白质试剂标准液取牛血清蛋白100 mg，定容至100 mL，取储备液10 mL定容至100 mL。测定溶液蛋白质含量取干净试管，加入超纯水0.5 mL混匀，在5～20 min内于波长595 mm处测定吸光度。酶解法对硒多糖脱蛋白具有良好效果。实验以木瓜蛋白酶进行脱蛋白，取1 mg/mL样品溶液5份，进行酶解效果实验70 min，灭酶时间10 min，取上清液蛋白质。将醇沉后经真空孔干燥样品用超纯水溶解，振荡后离心弃沉淀后取上清液。进行振荡时间，V氯仿：V正丁醇影响单因素实验。确定各因素单因素后进行正交试验。
研究酶解温度60℃下酶底对比蛋白质的影响。随着酶底比增多，多糖吸光度变化不明显。酶底比为0.1%时酶解效果较好，由于引入过多外源酶蛋白导致蛋白质吸光度增大。蛋白质含量降幅不大，由于地瓜酶解蛋白机理蛋白脱出率较低。进行操作条件对硒多糖结构无影响的Sevag法脱蛋白实验。考虑Sevag法脱蛋白后进行酶解实验，酶底按0.5%，0.65%进行酶解。酶底变化时蛋白质吸光度变化。由于Sevag法脱蛋白只能除掉部分提取液蛋白质含量增加。多糖吸光度变化小。酶底比为0.575%，多糖保留率为85.88%。
海南桥头地瓜经脱蛋白等初步纯化后需继续纯化，硒多糖通过离子交换柱层析法纯化（图2）。根据硒多糖带电荷性质纯化，采用色谱技术进行分离。由于离子交换柱层析具有重复性高等优点，硒多糖初步分析包括硒的存在方式，糖苷键的种类等方面内容，通过化学法对硒多糖进行分析。本文对海南桥头地瓜硒多糖进行银离子交换柱层析纯化，以HPLC等手段对硒多糖初步分析。地瓜硒多糖柱层析纯化实验包括填料预处理，装柱平衡与样品透析等环节。
地瓜硒多糖物理性质检验观察颜色气味，化学性质包括多糖显色，还原糖显色等。采用直接观察法对Se-Sp-P2，Se-Sp-P4物理性质进行判定，将样品溶于水及有机试剂中观察溶解度。多糖定性检验以苯酚-硫酸法进行实验。地瓜多糖蛋白质定性检测取干燥后样品溶解于超纯水中，观察波长范围内紫外吸收变化。取干燥后样品1 mg在4000～450 cm-1进行红外光谱扫描。植物多糖单糖组成分析以气象色谱测定，由于具有前处理过程复杂等缺陷，分析单糖组成易出现色谱峰异构化分裂等现象。考虑单糖中不存在发色基团，对样品进行PMP柱前衍生化处理。采用离子溅射制备扫描电镜样品，观察硒多糖表面形态。
实验以不同浓度NaCl溶液为洗脱剂脱洗，根据洗脱曲线吸光度变化趋势，表明洗脱曲线亿欧很大的反应现象明显峰。0.1 mol/L NaCl溶液为脱洗剂时脱洗曲线有糖反应较弱的峰。0.15 mol/L NaCl溶液为洗脱剂脱洗曲线15～20管存在糖反应较弱的峰。0.2 mol/L NaCl溶液为脱洗剂脱洗曲线出现3个峰，根据脱洗管数将组分Se-Sp-P2收集透析冻干备用。0.25 mol/L NaCl溶液为脱洗剂脱洗曲线出现4个峰，根据脱管数将组分Se-Sp-P3收集透析冻干备用。0.3 mol/L Nacl溶液为脱洗剂脱洗曲线有2组峰，15管后有糖反映较弱的峰。根据不同浓度洗脱液脱洗曲线，0.1、0.2、0.3 mol/LNaCI溶液可脱洗处多糖组分。本文对洗脱曲线进行0.2 mol/L、0.3 mol/L NaCI溶液洗脱组分分析。
桥头地瓜纯化分析实验表明4种硒多糖为白色粉末，Se-Sp-P1，Se-Sp-P3水溶性好。Se-Sp-P1是水溶性较好的硒多糖，推测柱层析纯化导致Se-Sp-P4空间结构变化导致硒多糖溶解变化。4种硒多糖硫酸-苯酚显色呈阳性，碘-碘化钾显色反应呈阴性。4种硒多糖Fehling试剂显色反应呈阴性。4种硒多糖硫酸-咔唑显色中Se-Sp-P1呈阴性。推断Se-Sp-P1是不含淀粉中性硒多糖，P2，P3，P4为还原糖硒多糖。地瓜粗硒多糖在200 nm附近有多糖吸收峰，硒多糖粗品中存在蛋白等杂志，DEAE-cellulose52对地瓜多糖纯化取得一定效果，4种硒多糖样品无蛋白质等杂质成分，色素含量少。4种组分中无蛋白质等杂质成分，4种成分为多糖，Se-Sp-P1不含糖醛酸结构，Se-Sp-P3，P4含有糖醛酸结构。
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