卵巢运输及保存的重要影响因素
时间：2023-01-25 09:30:08 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
兰可心 ，张学炜 ，郑璐璐 ，王 敏 ，崔茂盛
（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300380；
2.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381）
哺乳动物卵巢内含有大量的原始卵泡，是当前科研上获取卵母细胞的重要原材料。随着转基因、克隆等胚胎工程技术日渐成熟，对卵母细胞的需求也在不断增加。体内成熟技术（in vitro maturation，IVM）和超数排卵技术所获得的卵母细胞数量有限，实际操作复杂且成本高。而屠宰场所提供的卵巢数量大、所获得卵母细胞充足且成本低廉。各研究所现在更趋向于选择屠宰场的废弃卵巢用来作为体外成熟卵母细胞的原材料。但因屠宰场和实验室之间距离以及工作时间因素的影响，卵巢从离体到实验对其进行处理使用的时间是不定的。导致采集卵母细胞的时间不可控，有时需要较长的时间。因此，为了合理安排实验的同时节省运输费用，需要对离体卵巢进行一定时间的保存。目前已有对常见家畜（猪、牛、绵羊、山羊等）以及一些特种动物（家猫、犬、野生梅花鹿、伊比利亚红鹿、羊驼、兔、鼠、牦牛、驴等）的相关报道。将卵巢从动物死亡那一刻起直至到实验人员取卵母细胞为止的保存条件是维持卵母细胞活力的重要因素，不适当的保存条件会对后续实验造成不利影响，可见如何在卵巢保存的过程中维持组织内卵泡的活力对于后续的研究工作是十分重要的。
当离体卵巢所处的环境发生变化时，会对卵泡及卵母细胞造成负面影响。温血动物体内存在的酶在正常体温的温度时活性最强，细胞的新陈代谢与酶的活性有关，而酶的活性与温度呈现依赖性。细胞代谢会消耗细胞内能量，紧接着消耗保存介质中的营养和氧气。所以，即使在很短的保存时间（例如2 h或4 h）内，也可能会启动颗粒细胞以及卵母细胞凋亡导致较高的滤泡闭锁率。据相关研究报道，在卵泡内的卵母细胞因为受到了卵泡内环境的保护避免了温度变化对其的损伤，相较于生发泡阶段分离的卵母细胞对于冷刺激的表现较弱。对于短时间内（3～4 h）保存山羊、蒙古牛、绵羊、牦牛、奶牛卵巢的研究结果显示，在接近于室温时（20～25℃），更有利于保持卵巢细胞的活性。王锋等研究发现，牛卵巢保存在接近牛正常体温的溶液内2～4 h可以维持正常代谢，对卵巢保存更有利。造成结果存在差异性的原因可能与所取卵巢母牛的品种、年龄、饲养环境等有关。对于猪卵巢，猪卵母细胞对冷却非常敏感，当温度冷却到16℃以下时，会失去细胞膜的完整性。25～35℃是保持猪卵母细胞质量、减数分裂能力和体外受精率的最佳温度条件。石金月等报道，将兔卵巢保存在25-30℃ 0.9%NaCl（含双抗）中，4 h内送回实验室，更有利于卵母细胞的成熟培养。这可能与不同物种间卵巢对于温度敏感度不同有关。在较低温度下保存的卵巢的卵裂率和囊胚率明显低于其他处理，可能是因为在收集卵母细胞前，长期暴露在低温下的卵巢对胚胎发育能力有负面影响。当采用较高温度保存时，卵母细胞会因受到热应激从而影响成熟质量。会使卵母细胞成熟加快，使卵泡中产生的有害物质不断集聚，对细胞产生负影响。将卵巢保存在较低的温度下时，细胞代谢率随之也降低，使其可以用最小限度的代谢来抵抗因为缺少营养和氧气所导致的能量减少。在低温环境下保存卵巢，对酸中毒以及细胞凋亡过程会有所缓解。
据相关研究表明，从屠宰场收集的卵巢到采集卵母细胞的时间与卵母细胞的质量呈正比。但实际上会受到各种因素影响。1）运输时间。根据当地相关法规要求，屠宰场大多位于远离城市的郊区，导致屠宰场与实验室有一定的距离的情况存在。在一些国家因为研究物种的特殊性，也会跨地区运输。2）工作时间。屠宰场的工作时间会根据当地法规规定而不同，有些地区屠宰工作需要在下午或者晚间进行。当卵巢运到实验室时，有时会与实验室工作人员的工作时间发生冲突。3）卵巢数量。因研究物种不同，对于一些特种动物的研究，当需要获得足够的实验材料时需要在多个不同的屠宰点进行采集。受以上因素影响，需要对卵巢进行一定时间的保存。Anna Rita Piras等报道，家猫卵巢保存在4℃时，当储存长达24 h时，只会引起少量的腔前卵泡和卵母细胞的改变。但当贮存时间超过24 h，随着贮存时间延长会导致卵泡结构逐渐受损，影响体外成熟卵母细胞的氧化状态和体外受精后的发育能力。库尔班·吐拉克对野生梅花鹿保存卵巢实验报道，细胞成熟率以及卵子变形率会随着时间的延长而不断增加。Pimprapar、Matías Nicolás Tellado等报道，将猪卵巢保存在35℃，随着贮存时间的延长，卵泡液的pH、葡萄糖浓度、生发泡期未成熟卵母细胞的存活率、氧化活性和成熟率均呈下降趋势，细胞核DNA片段化的卵母细胞比例增加。Alicia Martín-Maestro等报道，绵羊卵巢保存时间为5 h时是对维持绵羊卵母细胞质量和发育能力的最适宜。颗粒细胞在贮存时大于7 h会活力降低导致氧化还原状态和线粒体活性受损，失去对卵母细胞的支撑和保护作用。随着保存时间的延长，由于离体卵巢缺乏氧气以及营养的供应导致毒素累积，在不同物种中对卵巢中卵母细胞的质量会造成不同程度的影响。这可能是因为长期暴露在低温下将不可避免地导致离子浓度失衡、代谢停滞和温度依赖性膜功能失衡。
保存溶液的组成成分是影响卵巢保存效果的重要因素之一。而找到对卵巢毒性及损伤最小的保存溶液的最佳成分至关重要。但确定保存溶液中缺少的有效成分是很难的。同时，对于保存溶液的选择不仅要兼顾成本和可用性，也要考虑卵巢到达实验室所需要的时间。对于这种情况，许多研究评估了不同溶液对卵巢运输过程中保存效果及卵泡健康状态的影响。生理盐水和磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffered Saline,PBS）价格低廉且使用率较高。0.9%生理盐水具有成本低且已有商品化产品的优点，使用便捷。虽然仅由水和氯化钠组成，已经是大多数实验室低温（4℃）运输卵巢的主要选择。
研究人员尝试使用不同溶液对保存效果进行改善。发现使用Braun-Collins溶液、椰子水、最低基本培养基（Minimum Essential Medium，MEM）和组织培养基199（Medium199，M199）等营养物质更丰富的保存溶液来保存卵巢能更好地保证卵母细胞的活性。Braun-Collins溶液是高渗溶液，当其用于卵巢组织运输时，不仅可以促进细胞脱水，同时可以避免细胞肿胀。而椰子水富含丰富的氨基酸、能量、维生素以及矿物质等。在反刍动物牛和山羊的卵巢组织保存运输后，可以有效地保持卵泡的良好形态及超微结构。椰子水中的生长素3-吲哚乙酸（IAA）添加到M199中时，有益于山羊腔前卵泡的保存。可能是因为IAA与卵巢组织中的生长因子相加作用，同时加强了生长因子在卵母细胞中的作用，维持细胞通透性及呼吸模式。
为了防止卵母细胞受到氧化应激进而导致DNA损伤，也可以添加其他促进细胞生长或抗氧化类添加剂，如胰岛素、转铁蛋白、硒、谷氨酰胺、次黄嘌呤和牛血清白蛋白等。商业培养基成本高昂，现阶段已有研究人员推荐是用价格更合理的药用植物提取物作为保存介质。龙涎草和桑树乙醇提取物对于保存山羊和绵羊卵巢组织已有相关研究，研究表明，将羊卵巢于4℃保存6 h，与对照组的正常腔前卵泡的百分比和凋亡率相比其正常腔前卵泡的百分比和凋亡率无显著差异。天然植物提取物中含有天然抗氧化剂，可减少不同细胞类型中的氧化应激和DNA损伤。
有研究表明，将卵巢组织切割为3 mm×3 mm×1 mm的组织块，更有利于培养基渗透进组织。相较来说，运输整个卵巢或较大块的卵巢组织，因为操作简便所需时间更少，其可行性更高。而且，在收集过程中操作越繁琐越容易导致组织污染。同时，随着组织块的大小变化，会对剩余组织内的营养成分以及氧气消耗相对加快，进而影响体外保存卵巢皮质的卵泡代谢速率。在评估整个卵巢、一半卵巢或较小器官碎片对卵泡存活效果的研究中，结果也不尽相同，而导致结果差异的原因可能与研究物种或保存溶液成分相关。卵巢保存受到多因素影响。包括器官或组织碎片大小、温度和可用性大小。也有研究提供了将温度保存在接近生理体温的保存方式，如水浴、便携式培养箱或卵母细胞转运箱。不同物种的卵巢所处的生殖周期阶段以及生殖道部分是否存在等因素也会影响卵巢运输质量以及进一步的卵母细胞质量。在犬类中，保存在4℃的卵巢中获得的卵母细胞的成熟率最高，最低的试验组是37℃。此外，不同运输温度对从黄体或卵泡期卵巢收集的卵母细胞的成熟率没有显著影响。重要的是，仍需要进一步研究以评估不同因素（发情周期阶段、身体状况、年龄等）对卵巢组织运输的影响。通过简单有效的保存程序，已经做出了许多努力来优化运输条件。
卵巢离体后环境改变缺乏氧气以及营养的供应，导致毒素累积，对卵泡内的卵母细胞造成了负面影响。卵巢的保存条件会引起卵泡的代谢变化从而改变卵泡液的PH，卵泡液PH随着温度的提高不断下降。葡萄糖是卵泡内卵母细胞成熟过程中关键的能量来源，随着时间延长，卵泡液内的葡萄糖不断被消耗，含量减少。缺氧也会引起代谢途径的改变，由有氧代谢转变到无氧糖酵解，其产物主要是乳酸。以上因素使乳酸在细胞内浓度不断升高，卵泡液逐渐偏向酸性环境造成酸中毒，从而影响卵母细胞的后续发育潜能。卵母细胞会随着生存环境不同而选择不同的死亡途径。缺血条件下的酸中毒、复氧和再灌注的作用强烈刺激细胞进行程序性细胞死亡。缺氧导致ROS生成，引起氧化应激，使卵巢内卵泡发生自噬、凋亡、坏死等多种细胞死亡途径以及退行性变化。当保存时间超过24 h时，氧化应激（OS）是阻碍卵母细胞体外成熟（IVM）的因素之一。随着时间的延长，卵母细胞周围颗粒细胞的死亡导致营养供应的中断，导致ROS的产生。可以通过卵母细胞活性氧水平、相关凋亡指标和基因表达来评估卵母细胞的质量。
考虑到卵母细胞的质量决定了受精后胚胎的发育潜力，从动物死亡的那一刻起直到卵巢被加工完成，卵母细胞的完整性是至关重要的。当保存时间小于6 h时，保存温度接近于室温（20～25℃）是比较好的选择。当保存时间大于12 h，低温保存更有利于卵巢保存。有研究表明，在体内和体外培养条件下，采用酶和非酶氧化剂，可以降低ROS水平，抑制caspase活性，可通过内源性凋亡途径调节细胞凋亡程度，改善卵巢活性以及卵母细胞质量。当卵巢经过保存后在体外培养液内添加能量物质（葡萄糖）、抗氧化剂（白藜芦醇）等可以对卵母细胞的发育潜能形成正面影响。需要强调的是，物种和卵泡种类（腔前或腔内）对贮藏温度的反应是不同的。腔前卵泡因环境变化，发生氧化应激、代谢途径变化、毒素积累等都会诱导细胞凋亡。针对目前各实验室研究物种、时间间隔、温度变化不同，以及体外培养条件差异等因素影响，导致各实验室研究结果并不统一。加强对于长距离运输卵巢的研究可以拓展远距离卵巢资源的应用。目前大多数研究仅对成熟率和极体率进行了对比，缺少对卵母细胞分子水平的研究，所以有必要在细胞和分子水平阐明发生在卵母细胞内的时间，以便采取适当的措施来减少这种损害，有助于人为调节或干预卵泡发育。
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