番茄红素的提取及抑菌作用研究
时间：2023-01-24 22:50:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
赵建英，张迎昭，李 祥，白 建
（吕梁学院生命科学系，山西吕梁 033001）
圣女果又称樱桃番茄，含有多种营养素，可以促进消化，刺激食欲，治疗厌食和食欲不振（白建等，2021）。番茄红素是番茄里的主要色素，容易被氧化降解，可以作为抗氧化剂使用，清除并杀死自由基，而且番茄红素还具有补气生血、延缓衰老和抗肥胖功能。因此成为最受人们欢迎的营养保健品之一（曾敬等，2020）。金炳熔等（2020）通过小鼠试验发现，番茄红素能够改善哮喘小鼠肺组织病理学，得到番茄红素具有抗哮喘作用的结论。王维等（2020）发现，番茄红素可以预防心脑血管疾病。李童等（2020）通过试验用番茄红素提取物制作面膜，所制得的面膜容易涂抹、气味宜人、并且具有抗衰老能力。Paul等（2020）发现，番茄红素能有效地帮助恢复与神经退行性疾病、癫痫病、衰老、亚拉克诺德出血、脊髓损伤和神经病变相关的典型行为和病理生理变化。Mirahmadi等（2020）发现，番茄红素可以调节信号通路及其蛋白质，用于治疗或预防前列腺癌。Stice等（2018）发现，番茄红素能预防酒精性脂肪肝病和肝细胞癌发展。Kilany等（2020）发现，番茄红素具有抗肥胖潜力。Ladole等（2018）研究了超声波和共固定酶对番茄皮的协同效应，用于番茄红素提取。陈俊杰等（2020）研究了超临界CO2技术来萃取番茄红素，并对这种技术进行了优化。赵芳等（2020）探索了超微粉碎协同微波技术对番茄中的番茄红素进行提取，并得到了比较好的结果。
本研究以新鲜圣女果为原料，采用乙酸乙酯萃取法，通过单因素试验，确定最优参数范围，再通过设计正交试验，对试验数据进行分析，得到最适的提取条件，并对所提取的番茄红素进行抑菌试验，研究番茄红素的抑菌效果稳定性，为圣女果的开发利用提供理论依据和实践参考。
1.1 材料和试剂 圣女果购于吕梁市家家利超市；
大肠杆菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌由吕梁学院生命科学系微生物实验室提供；
0.5%山梨酸钾溶液（分析纯），乙酸乙酯（分析纯），氢氧化钠（分析纯），无水乙醇（分析纯），盐酸（分析纯）。琼脂（天津市光复精细化工研究所），牛肉膏（天津市光复精细化工研究所），蛋白胨（天津市光复精细化工研究所），氯化钠（济南坤丰化工有限公司）。
1.2 主要仪器pH计（FE20K）：梅特勒-托利多仪器有限公司；
生化培养箱（SPX-250）：上海跃进医疗器械有限公司；
HH系列数显恒温水浴锅：山东博科生物产业有限公司；
紫外可见光分光度计（UV-1601）：北京瑞利分析仪器有限公司；
立式压力蒸汽灭菌器（LDZX-50KBS）：上海申安医疗器械厂。
1.3 试验方法
1.3.1 标准曲线的测定 番茄红素标准曲线的制作参考王海红等（2017）的结论，首先使用苏丹Ⅰ和无水乙醇以适当比例混合，配制出质量浓度为2、4、6、8、10、12 μg/mL的番茄红素的标准溶液，在473 nm处测定番茄红素标准溶液的吸光度，通过所记录的数据来制作并绘制番茄红素标准曲线。
1.3.2 番茄红素提取率测定 将番茄红素提取液进行稀释，使用分光光度计测定稀释后的番茄红素提取液的吸光度，利用线性回归方程计算提取率。番茄红素提取率计算公式为：
式中：C为通过线性回归方程求得的番茄红素的浓度，μg/mL；
V为定容后的体积，mL；
N为定容后稀释的倍数；
m为圣女果糊状物的质量，g。
1.3.3 番茄红素提取 （1）清洗去皮：将新鲜圣女果进行清洗，去除外表皮和果蒂。（2）打糊：将处理后的圣女果放入榨汁机中打成糊状。（3）浸提：称取5 g圣女果糊，加入乙酸乙酯，置于恒温水浴锅中浸提。（4）过滤：浸提完成后，用滤纸进行过滤。（5）稀释：取过滤后的提取液5 mL，稀释10倍，在473 nm处测量吸光度。。
1.3.4 番茄红素抑菌作用 （1）制作培养基：取牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl若干制作培养基。（2）灭菌：将经过高温煮沸的培养基装入锥形瓶中，用棉花堵口，放入灭菌锅，进行灭菌。（3）倒平板：将经过湿热高温灭菌的琼脂培养基倒入经过高温蒸汽灭菌的平板中。（4）制菌悬液：分别刮取试管斜面上的菌种入无菌生理盐水中，并将其稀释成菌悬液备用。（5）接种：等平板凝固后进行接种。（6）平板划线：进行平板划线，标明不同滤纸片在平板中所在的位置。（7）放滤纸片：将浸泡了不同溶液的滤纸片放入平板中，并相隔一定距离。（8）培养：将放入滤纸片的平板放入恒温箱中培养24 h。（9）测量抑菌圈直径：观察滤纸片周边的情况，对抑菌圈直径的数据进行记录。
1.4 单因素试验 预试验：设定圣女果与乙酸乙酯料液比为1:3，提取温度45℃，提取时间3 h，浸提pH为4，对番茄红素的提取进行预试验。分别研究不同料液比（1:1、1:2、1:3、1:4、1:5 g/mL），不同提取温度（25、35、45、55、65℃），不同浸提时间（1、2、3、4、5 h），不同浸提pH（2、4、6、8、10）对番茄红素提取率的影响。
1.5 正交试验设计 利用单因素试验得出的数据，进行BBD响应面法试验（张环宇等，2020），以A提取时间、B提取温度、C料液比、D浸提pH作为四个影响因素，以番茄红素提取率为考察指标。正交试验设计因素水平见表1。
表1 正交试验设计因素水平
1.6 抑菌试验
1.6.1 番茄红素的抑菌试验 （1）配制培养基：按照标准配方称取制作培养基的材料，加热煮沸后将培养基倒入锥形瓶中，先用棉花封口，再用报纸进行包扎。（2）灭菌与倒平板：将装有处理过的培养基的锥形瓶放入灭菌锅，进行灭菌操作，灭菌完成后，在无菌操作台上进行倒平板操作。（3）制菌悬液：在无菌条件下制作菌悬液，吸取5 mL无菌水，将无菌水放到菌种斜面，用接种环慢慢刮下菌苔，塞上棉塞，并振荡片刻。（4）取最佳提取条件提取所得的番茄红素溶液备用。（5）取直径6 mm的圆形滤纸片若干，取4个圆形滤纸片放入番茄红素溶液中，取另外4个圆形滤纸片放入乙酸乙酯中，再取4个圆形滤纸片放入无菌水中，最后取4个圆形滤纸片放入山梨酸钾溶液中。（6）待平板凝固后进行接种，取一个平板不进行接种，做空白对照，编号为1，另外分别取0.3 mL不同菌的菌悬液倒入另外3个平板中，用涂布棒抹匀，并将接种了大肠杆菌的平板编号为2，将接种了金黄色葡萄球的平板编号为3，将接种了枯草芽孢杆菌的平板编号为4。（7）在编号为1、2、3、4的平板中分别放入1个含有番茄红素溶液的圆形滤纸片，1个含有乙酸乙酯的圆形滤纸片，1个含有无菌水的圆形滤纸片，1个含有山梨酸钾溶液的圆形滤纸片，每个纸片间相隔较大距离。（8）将上述4个平板放入37℃恒温培养箱中，间隔一定距离并培养24 h。每组做三个平行试验。（9）测量抑菌圈直径：观察滤纸片周边抑菌圈的情况，对抑菌圈直径的数据进行记录。
1.6.2 番茄红素抑菌稳定性试验
1.6.2.1 不同温度对番茄红素抑菌效果的影响选用滤纸片法，将番茄红素溶液分别于20、40、60、80、100℃下，加热0.5 h，而后放入平板中进行恒温培养，选择未处理的番茄红素溶液作为对照，观察滤纸片周围透明抑菌圈情况，记录数据。
1.6.2.2 不同pH对番茄红素抑菌效果的影响 选用滤纸片法，使用0.5 mol/L的NaOH或HCl溶液将番茄红素溶液（pH）分别调节为2、4、6、8、10，以对应未经处理的番茄红素溶液和对应pH的NaOH或HCl溶液作为对照，常温1 h后，进行恒温培养，观察滤纸片周围透明抑菌圈情况，记录数据。
1.7 数据处理 使用Office Excel 2019整理数据，使用Graphpad Prism 8制图。用SPSS 22.0进行正交试验的方差分析。
2.1 番茄红素标准曲线的绘制 利用配制好的标准溶液，于波长473 nm处对吸光度进行测定，可以发现吸光度Y与番茄红素浓度X之间呈现良好的线性关系，其关系为Y=0.1049X-0.0011386，R2=0.9966（图1），可以使用标准曲线法对番茄红素含量进行分析。
图1 番茄红素的标准曲线
2.2 单因素试验结果与分析
2.2.1 不同料液比对番茄红素提取率的影响结果图2表明，料液比对圣女果中番茄红素的浸提提取率有十分明显的影响，当料液比为1:1～1:3时，番茄红素的提取率呈现上升趋势，在1:3时达到最大提取率。由此可知在料液比1:3时，番茄红素的提取率达到峰值，料液比为1:3～1:5时，番茄红素提取率趋于稳定。可能是料液比为1:3时，番茄红素已经全部被提取出来。
图2 不同料液比对提取率的影响
2.2.2 不同浸提温度对番茄红素提取率的影响结果 由图3可以看出，在25～45℃，提取率与浸提温度成正相关，这可能是因为温度升高时，分子热运动增快，圣女果中番茄红素溶解速度加快。但温度超过45℃时，浸提提取率变小，可能是因为温度接近浸提剂的沸点，导致浸提剂挥发，番茄红素分解，不能稳定存在。由此可知，在进行番茄红素的提取时，浸提温度选择45℃比较合适。
图3 不同浸提温度对提取率的影响
2.2.3 不同浸提时间对番茄红素提取率的影响结果 从图4可以看出，浸提时间对圣女果中番茄红素的提取率有影响，当提取时间为1～4 h时，提取率明显呈现上升趋势，并且在4 h时番茄红素的提取率达到峰值，但提取时间为4～5 h时，番茄红素的提取率有下降趋势，可能是由于浸提时间超过最大限度，色素不能稳定存在。
图4 不同浸提时间对提取率的影响
2.2.4 不同浸提pH对番茄红素提取率的影响结果 从图5可以看出，浸提pH为2～6时，随着浸提pH的增加，番茄红素的提取率逐渐上升，当pH＞6时，番茄红素的提取率相较于之前有明显的下降。可能是因为在强碱环境下，由于发生未知反应导致番茄红素不能稳定存在，导致提取率变低。另外当浸提pH＜4时，提取率有较大幅度的下降，可能是在强酸条件下，番茄红素不能稳定存在。
图5 不同浸提pH对提取率的影响
2.3 正交试验结果与分析 正交试验设计结果见表2，方差分析结果见表3。
从表2的数据可以得出，最优提取工艺为A3B1C3D2，即圣女果与乙酸乙酯的料液比为1:4，浸提温度45℃，提取时间5 h，提取pH为6。其中，料液比、提取时间和提取温度引起的番茄红素提取率的改变较大，而提取环境pH引起的番茄红素提取率的改变较小。从表3的各项数据可以得出，料液比和浸提时间引起的提取率变化呈极显著差异，浸提温度引起的提取率变化达到显著水平。
表2 正交试验设计方案与试验结果
表3 方差分析
另外，通过正交试验结果进行极差与方差分析可得，浸提剂的多少是影响提取率的重要因素之一，而通过单因素试验可知料液比1:3和料液比1:4的差距较小，从经济角度来看，选用料液比1:3更加合理。而在浸提时间的选用方面，在单因素试验中，提取时间为4 h和提取时间为5 h的提取率相比较接近，没有明显差异，所以为了节省提取时间，可以把浸提时间设置为4 h。其次，浸提温度是影响提取率的一个重要因素，在浸提温度为45℃时提取率达到最大，但当温度大于45℃后，提取率开始减小。因此，温度选择45℃比较合适。最后，在浸提pH的选择上，通过单因素试验的结果可以看出，在pH为2或pH为10的条件下，番茄红素的提取率与其他条件下相差较大，可能是由于这两种条件下提取液中发生未知反应导致番茄红素不能稳定存在于浸提剂中，导致提取率变低。因此可以得出进行番茄红素提取的最优pH为6。
综上所述，进行提取的最优条件是圣女果与乙酸乙酯的料液比为1:3，温度为45℃，浸提时间为4 h，提取pH为6。根据最优条件进行三次试验，所得到的提取率为56.19 μg/g，优于正交试验结果和预试验结果。
2.4 抑菌试验结果
2.4.1 番茄红素抑菌试验结果 由表4可知，在作为对照的平板1中放入带有各种溶液的滤纸片，抑菌圈直径均为6 mm，说明未接种菌种的平板中滤纸片周围未形成透明抑菌圈。平板2、3、4中放有无菌水滤纸片，乙酸乙酯滤纸片的抑菌圈直径为6 mm，说明带有这两种溶液的滤纸片周围未形成透明抑菌圈，由此可知无菌水、乙酸乙酯对这三种菌类没有抑制作用。而番茄红素滤纸片和山梨酸钾滤纸片的抑菌圈直径均大于6 mm，说明这两个滤纸片周围有透明抑菌圈形成。可以看出，番茄红素和山梨酸钾对这三种菌类均有一定的抑制作用。
表4 各个平板内的滤纸片抑菌圈直径
2.4.2 番茄红素抑菌稳定性试验结果
2.4.2.1 不同温度对番茄红素抑菌稳定性的影响由表5可知，通过改变温度，当温度在20～60℃时，番茄红素试验组的抑菌圈直径与对照组之间并无明显差距；
而当温度在80～100℃时，番茄红素试验组的抑菌圈直径明显小于对照组；
这说明番茄红素的抑菌效果在20～60℃比较稳定，而当温度升高到60℃以上时番茄红素的抑菌效果会降低，可能是由于温度过高，番茄红素不能稳定存在。
表5 温度对番茄红素抑菌稳定性的影响mm
2.4.2.2 不同pH对番茄红素抑菌效果的影响由表6可知，不同pH对番茄红素的抑菌效果有比较明显的影响，当pH在4～8时，试验组番茄红素的抑菌圈直径与对照组番茄红素的抑菌圈直径相比无明显差异；
但是当pH为2或10时，试验组番茄红素的抑菌圈直径与对照组番茄红素的抑菌圈直径相比有明显的减小，可能是因为在强酸或强碱条件下，番茄红素的活性被破坏，导致番茄红素抑菌效果降低。由此可以得出，在pH在4～8时，番茄红素的抑菌效果比较稳定；
在pH为2或10时（有没考虑强酸或强碱本身这三种菌就不适合生长，pH设在中性左右，间隔也可小些，间隔1或0.5），可能由于发生未知反应，导致番茄红素的抑菌效果不稳定。
表6 pH对番茄红素抑菌效果的影响mm
该试验以圣女果为原料，通过单因素试验，分析单因素试验结果，并设计正交试验，通过综合分析，得出的最佳提取条件为：料液比1:3，提取温度45℃，浸提时间4 h，浸提pH 6。根据该条件进行提取，番茄红素提取率可达56.19 μg/g；
同时通过抑菌试验，对其抑菌作用进行研究，得到了番茄红素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有一定的抑制作用。在20～60℃、pH为4～8条件下，番茄红素的抑菌效果有良好的稳定性。
