多精受精中人卵丘颗粒细胞差异基因表达分析
时间：2023-01-23 22:30:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
王丽，赵杰*，陈秀娟，杜琛，刘芳，何江峰，梅步俊
(1.内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050；
2.内蒙古自治区农牧业科学院，呼和浩特 010030；
3.河套学院，巴彦淖尔 015000)
自1978年首例试管婴儿问世以来，辅助生殖技术(ART)得到了快速发展，促排卵、IVF及胚胎体外培养方面的技术水平也在不断提高，但仍然无法避免常规IVF中出现的多原核(PN)现象。多PN合子的出现会降低卵母细胞利用率、减少可利用胚胎数量、降低患者妊娠机会[1]。在卵母细胞和卵泡生长发育过程中，卵母细胞与卵丘颗粒细胞及卵泡内微环境会进行双向的信号传导，促使卵母细胞发育与成熟[2]；
卵母细胞与颗粒细胞之间的密切关系使得颗粒细胞中差异基因的表达会影响卵母细胞的发育情况，进而影响到卵母细胞的受精情况。本研究通过分离受精前卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞，再根据卵母细胞的受精情况分为正常受精组与多精受精组，检测正常受精和多精受精前颗粒细胞的基因表达情况，以期发现在多精受精中差异表达的基因。
一、研究对象
筛选2019年4月在内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心因输卵管因素导致继发不孕而进行IVF-ET的病例3例为研究对象。纳入标准：年龄25～26岁，月经周期正常，基础窦卵泡计数(AFC)≥7个，基础FSH(bFSH)值在5～10 U/L之间。排除标准：(1)女方为卵巢低反应者；
(2)女方患有糖尿病、高血压、甲状腺疾病等内分泌疾病；
(3)存在子宫畸形、子宫腺肌症、子宫内膜异位症、子宫粘膜下肌瘤等妇科疾病；
(4)女方诊断为输卵管积水；
(5)夫妇一方患有其他系统器质性疾病；
(6)夫妇中任何一方有染色体异常。男方精液质量符合《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》(第5版)正常标准要求。本研究经内蒙古医科大学附属医院生殖伦理委员会审批通过，患者经充分知情同意后签署知情同意书，自愿捐赠部分颗粒细胞用于科学研究。
纳入研究的卵冠丘复合体(OCCC)根据卵母细胞受精情况分为多精受精组和正常受精组。多精受精组即将同一患者的多PN受精，含2个极体(2Pb)+3PN及3PN以上的卵母细胞对应的颗粒细胞合并为一管，按照患者姓氏区分分别标记为MAF1、WAF2、LAF3；
正常受精组即将同一患者正常受精(2Pb+2PN)的卵母细胞对应的颗粒细胞进行合并，分别标记为MNF1、WNF2、LNF3。
二、研究方法
1.取卵、授精、培养与观察：促排卵方案按照内蒙古医科大学附属医院生殖医学中心标准长方案进行，于月经周期第21天开始每天肌肉注射促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a，达菲林，Ipsen Pharman Biotech，荷兰)0.1 mg，14 d后，当卵泡大小接近且直径均<5 mm、E2<146.8 pmol/L、LH<10 U/L、FSH<10 U/L、子宫内膜厚度<5 mm时，给予皮下注射重组卵泡刺激素(果纳芬，默克，瑞典)75～225 U，进行促排卵。定期进行阴道超声检查，并测定血E2和孕酮(P)水平，评估卵泡发育情况。当B超观察到双侧卵巢中有1～2个卵泡直径≥18 mm时，给予肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，36～38 h后经阴道B超引导下吸出卵泡内卵泡液及OCCC。将吸出的包含OCCC的卵泡液快速送至胚胎实验室，在体视显微镜下用巴斯德吸管取出OCCC，经培养液洗涤4遍后，放入含1 ml IVF-Plus受精液(Vitrolife，瑞典)的培养皿中，37℃、6%CO2、5%O2培养箱中培养3～4 h等待授精。精液采用密度梯度离心法联合上游法进行分离，分离后的精液进行计数，调整精子密度为1×106条/ml前向运动精子，室温放置。卵母细胞培养3～4 h后，将精子悬液制作成100 μl的微滴，精子浓度为10～20万条/ml，将切割后的OCCC加入精子微滴中，共同过夜培养17 h，用拆卵管将卵母细胞周围颗粒细胞拆除，将受精卵转入G1-plus(Vitrolife，瑞典)微滴中，倒置显微镜下观察PN及Pb排出情况并记录，其中2Pb+2PN的受精卵为正常受精，2Pb+3个或以上PN的受精卵为多精受精。微滴继续培养，加精后40 h观察受精卵的卵裂情况，加精后64 h观察胚胎发育情况并评级，对可移植胚胎进行移植、冷冻或囊胚培养。
2.颗粒细胞的采集：在授精前10 min，用机械方法对受试者的卵母细胞外围部分颗粒细胞进行切割，获取颗粒细胞团块，用含80 U/ml透明质酸酶的MOPs+5%HSA液体消化1 min，离心、洗涤两遍，分装入0.2 ml无菌管，-80℃冷冻保存。包裹有卵母细胞的OCCC进行微滴授精。
3. 总mRNA提取、文库构建、测序及数据分析：总mRNA提取、文库构建及测序按照北京诺禾致源科技股份有限公司标准流程进行。差异表达基因筛选采用软件DESeq操作，P<0.05为差异有统计学意义；
采用GOseq软件进行差异表达基因的基因本体论(GO)分析，P<0.05时表示在该GO条目显著富集；
并进行京都基因和基因组数据库(KEGG)分析，错误发现率(FDR)≤0.05时表示差异基因在该KEGG中显著富集[3]。应用STRING蛋白质互作数据库(http：//string-db.org/)中的互作关系进行差异基因蛋白互作网络的分析。
一、3例患者多精受精的发生情况
3例患者中，第1例M患者获卵16枚，正常受精13枚(对应的颗粒细胞纳入MNF1管)，多精受精3枚(对应的颗粒细胞纳入MAF1管)；
第2例W患者获卵13枚，正常受精10枚(对应的颗粒细胞纳入WNF2管)，多精受精2枚(对应的颗粒细胞纳入WAF2管)；
第3例L患者获卵15枚，正常受精11枚(对应的颗粒细胞纳入LNF3管)，多精受精3枚(对应的颗粒细胞纳入LAF3管)。第2、3例患者中单PN受精或晚卵裂受精的情况未纳入统计。
二、两组之间差异表达的基因
1.样本生物信息学分析：本实验对6个样本的cDNA文库进行高通量测序和生物信息学分析，得到部分原始数据与去杂后的数据信息，详见表1。多精受精组与正常受精组比较，存在的差异表达基因共139个，其中显著上调的基因106个，显著下调的基因33个(图1)。显著上调及显著下调的前10个基因信息详见表2、表3。
表1 样品测序数据质量评估情况
红色：上调基因；
绿色：下调基因；
蓝色：无显著性差异表达的基因。图1 三名患者中多精受精组与正常受精组比较差异基因表达火山图
表2 多精受精组与正常受精组比较显著上调的Top10基因信息
表3 多精受精组与正常受精组比较显著下调的Top10基因信息
2.同一患者中多精受精组与正常受精组比较：MAF1与MNF1比较，存在显著表达差异的基因有694个，其中207个基因上调，487个基因下调(图2)；
WAF2与WNF2比较，存在显著表达差异的基因有886个，其中596个基因上调，290个基因下调(图3)；
LAF3与LNF3比较，存在显著表达差异的基因有805个，其中498个基因上调，307个基因下调(图4)。
红色：上调基因；
绿色：下调基因；
蓝色：无显著性差异表达的基因。图2 MAF1与MNF1比较差异基因表达火山图
红色：上调基因；
绿色：下调基因；
蓝色：无显著性差异表达的基因。图3 WAF2与WNF2比较差异基因表达火山图
红色：上调基因；
绿色：下调基因；
蓝色：无显著差异表达的基因。图4 LAF3与LNF3比较差异基因表达火山图
三、差异表达基因GO及KEGG分析
对差异基因进行GO功能注释，分析结果显示，其分子功能主要参与转录因子活性(GO0003712)、转录因子结合(GO0000989)、蛋白质链接(GO0000988)，生物过程主要参与细胞分化(GO030154)、细胞信号转导(GO0007267)(图5)。KEGG富集分析显示，差异表达基因信号通路在核糖体(hsa03010)、细胞因子受体相互作用(hsa04060)、细胞分化(hsa04380)、半胱氨酸和蛋氨酸的代谢(hsa00270)等通路上富集(图6)。上调的差异基因主要涉及P53信号通路、PI3K-AKT信号通路、肌动蛋白细胞骨架信号通路和HIPPO信号通路。表达上调的基因BMP2、SESN3、CDK6、GRLF1(ARHGAP35)与多精受精相关。
红色：上调基因；
蓝色：下调基因。图5 存在差异表达的基因功能注释
图6 差异基因KEGG富集分析(橙色表示富集的基因)
哺乳动物的卵母细胞在体内生理条件下发生多精受精的几率较低，但在体外操作下，多精受精发生的几率较高。过往的研究多集中在临床操作的技术及方法上，且由于人类卵母细胞不易获得及伦理的限制，因此对卵母细胞发生多精受精的机制进行基因水平的研究很少。因卵丘颗粒细胞与卵母细胞通过缝隙连接进行双向的信号交流[4-9]，所以通过研究与卵母细胞有信号转导的卵丘颗粒细胞的基因转录水平差异或许可以为研究卵母细胞的多精受精原理提供另外一条思路。
体外操作中多PN卵母细胞的出现可能是由于多条精子入卵、卵母细胞第二极体未排出、PN碎裂、入卵精子多倍体等原因造成的。这些情况的发生与卵母细胞的发育成熟度异常、卵母细胞透明带异常、卵泡液中激素水平过高或过低导致的卵母细胞异常以及精子浓度过高、体外培养条件不适导致的操作异常有关。
精子入卵后，卵母细胞会发生皮质反应从而阻止多精入卵，若卵母细胞成熟度不足或过熟，皮质反应容易发生异常。未成熟卵母细胞由于细胞核、细胞质、细胞膜与透明带未发育成熟而不能发生彻底的皮质反应与透明带反应；
但卵母细胞过熟后会使皮质颗粒内容物排出，皮质反应发生不全，导致多精受精。本研究中，多精受精组中与卵母细胞成熟度相关的差异基因有CDK6、BMP2基因。CDK基因家族参与调节哺乳动物细胞周期和转录，对卵母细胞的核成熟和转录活性具有重要作用，是恢复卵母细胞减数分裂的重要物质，能够调节细胞G1/S期进程[10-12]。作为BMP亚家族、TGF-β超家族的成员之一，BMP2与GDF9一起在卵母细胞成熟过程中发挥作用[13]，BMP2与细胞膜上的受体结合并通过HIPPO信号通路BMPs-Smad1/4系统使Smad1/4磷酸化，影响卵母细胞受精，BMP2水平可作为卵母细胞质量与受精的预测指标[14-16]。
MDM2-p53-SESN信号通路可能通过SESN3基因调控卵母细胞氧化、衰老以及DNA损伤和修复过程。PI3K/AKT信号通路中PI3K激活磷酸化并进一步激活AKT，其定位于细胞膜，与细胞静止、增殖有关。PI3K/AKT信号通路促进细胞周期发育并改善细胞增殖从而影响卵母细胞受精。。
p53基因是重要的肿瘤抑制基因之一[17-19]，在多个通路中发挥作用。在MDM2-p53-SF1通路中，p53影响着小鼠卵母细胞的成熟和受精[20]。在人卵巢颗粒细胞中，p53通过MDM2-p53-SESN信号通路对下游基因SESN3进行调节[21-22]。在本研究中，作为抗氧化基因，SESN3基因有差异表达，其是否可以通过调控卵母细胞氧化、衰老以及DNA损伤和修复过程影响受精结局，有待进一步的证明。
卵母细胞未成熟或过熟会导致细胞内肌动蛋白动力学异常以及受精时细胞内钙离子释放异常。肌动蛋白细胞骨架是一种通用的聚合应力，是产生细胞中心体、细胞核和纺锤体所必需的聚合应力[23]，还参与细胞迁移、胞质分裂等过程[24-27]。GRLF1(ARHGAP35)基因可以抑制Rho活性，通过GRLF1-Rho-mDia信号通路调控细胞内肌动蛋白聚合应力纤维，调控肌动蛋白细胞骨架[27]。在本研究中，多精受精组中GRLF1基因的表达显著上调。另外，过熟的卵母细胞在受精时会发生细胞内钙释放模式的改变以及肌动蛋白动力学的异常，导致多精受精率增高[28-29]。本研究也筛选出与钙离子释放相关的基因——TANC1基因显著上调，TANC1是重要的突触支架蛋白，在调节突触棘密度和兴奋性突触强度中起关键作用，可能通过改变细胞内钙释放模式以及肌动蛋白动力学，影响受精结局。激素刺激不当也会引起卵母细胞发育异常导致多精受精，本研究筛选出的在多精受精组中表达上调的IGRBP5基因是促进细胞有丝分裂的敏感基因，受卵泡刺激素的影响。
本研究最初设计时为防止各组中取样细胞过少导致测序结果出现偏差，故将同一个体的相同受精类型卵母细胞对应的颗粒细胞进行合并，筛选差异基因表达情况，这可能会使测序结果的准确性存在偏差。下一步研究将对单精受精、0PN晚卵裂、多精受精每个卵母细胞的卵丘细胞转录组进行测序，分析各种异常受精情况的差异基因表达情况。
综上，本研究发现，多精受精组与正常受精组比较颗粒细胞存在基因表达差异，其中，显著上调的基因集中在与卵母细胞生长、成熟及凋亡、激素分泌、免疫、肿瘤发生、有丝分裂及受精过程相关的通路上，主要涉及p53信号通路、PI3K-AKT信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控信号通路、HIPPO信号通路；
显著下调的基因则主要集中在细胞物质代谢及内分泌调节过程。本研究通过对差异基因表达进行分析，这可能为后续开展生殖过程中异常受精发生的影响因素研究提供一定的参考。
