婴幼儿配方食品中致病微生物的污染状况及风险评估
时间：2023-01-23 22:25:01 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
◎ 刘晓晖，何 伟，凤淳雅，付婧超，任明月，何 苗
（1.吉林省产品质量监督检验院，吉林 长春 130103；
2.长春职业技术学院，吉林 长春 130033）
食源性致病微生物主要通过污染食物导致人类中毒或死亡，其引起的食源性疾病已经成为世界性的公共卫生难题[1-2]。据文献统计，我国于2018—2021年发生过多起由蜡样芽孢杆菌污染食物造成的食物中毒事件[3-7]。婴幼儿配方食品是免疫力低下、未发育完全的婴幼儿等特殊人群获得能量和营养物质的主要来源，对于6月龄以下人工喂养的婴儿，更是其唯一营养来源[8]。因此，对婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌污染状况进行风险评估与分析意义重大。
微生物风险评估（Microbiological Risk Assessment，MRA）是当前国际食品安全领域广泛应用的一种工具，是人类感染微生物后，对人类健康产生的不良后果进行识别，以微生物的定量关系来判断或估计人类发生中毒的概率[9]。微生物风险评估是微生物风险分析体系的基础，其主要分析过程分为危害识别、危害特征描述、暴露评估和风险特征描述等4 个部分[10]。
本文围绕婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌的污染状况进行简单分析及风险评估，并对蜡样芽孢杆菌现行评估的难点、复杂性及其前景作简单论述，为制定更为合理的食品安全监管和评价机制提供决策依据。
1.1 样品采集
按照《国家食品安全监督抽检实施细则》（2022年）要求，结合本市实际情况，随机抽取百货商场、便利店/零售店、超市和网店等场所婴幼儿食品203 份，其中婴儿配方食品87 份、较大婴儿和幼儿配方食品54 份、婴幼儿谷类辅助食品62 份。采样包装完整，在保质期内且避免污染。
1.2 设备、培养基与试剂
LightCycler480 II 型荧光定量PCR 仪（罗氏）；
Q7全自动病原微生物检测系统（美国杜邦）；
生化培养箱（上海一恒）；
HITACHI 离心机（日本）；
ML105型电子天平（Mettler Toledo）；
呕吐型基因PCR 试剂（20211004）、腹泻型基因PCR 试剂（2021080），购自北京卓诚惠生；
胰酪胨大豆多黏菌素肉汤、甘露醇卵黄多黏菌素（MYP）琼脂、细菌基因组DNA 提取试剂盒和PCR 引物，由上海生工提供。
1.3 检验与判定方法
按照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》（GB 4789.14—2014）[11]方法进行检验，依据试剂盒方法开展荧光PCR 定量和呕吐型基因检测，以无菌水为阴性对照，以实验室保存的质控样品为阳性对照。参考“Standard 1.6.1-Microbiological Limits for Food”婴儿配方食品蜡样芽孢杆菌限量标准（n=5，c=0，m≤100 CFU·g-1）进行判定[12]。
2.1 检验结果
结合《国家食品安全监督抽检实施细则》（2022年），本次实验共完成检品203 批次，检出蜡样芽孢杆菌23 株。其中，检出呕吐型基因3 例。和其他两类比较，婴幼儿谷类辅助食品感染呕吐型蜡样芽孢杆菌阳性率有统计学差异。不同类型婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌检测情况见表1。
表1 不同类型婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌检测情况表
2.2 风险评估
2.2.1 危害识别
蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）为兼性厌氧、能够产生芽孢的革兰氏阳性杆状食源性致病菌[13]，其广泛分布于土壤与食物中，能产生肠毒素，对人体危害极大。根据其基因型和产生肠毒素机制的不同，分为腹泻型毒素和呕吐型毒素，二者的临床表现主要为腹泻和呕吐等症状。
蜡样芽孢杆菌引起的腹泻主要是由于人摄入污染食物后，在小肠中产生肠毒素而引发的感染。肠毒素种类繁多，而与胃肠道食物中毒有关的肠毒素只有肠毒素Nhe、溶血素BL 和细胞毒素K[14]。据报道[15-18]，三者主要通过作用小肠上皮细胞，在穿孔毒素作用下使小肠上皮细胞形成孔洞，导致Na+和Ca2+流失，细胞电位失衡而凋亡或死亡。其临床表现主要为摄入污染食物8～16 h 后出现腹痛、腹泻和偶尔恶心，症状持续12～24 h。
呕吐型毒素是一种非核糖体产生的离子型环状十二肽，产呕吐毒素的蜡样芽孢杆菌的质粒与炭疽杆菌毒力质粒pXO1 具有较高的序列相似性[19]，因此被单独分为一个亚群，归入新种副炭疽芽孢杆菌（Bacillus paranthracis）[20]。其产生的呕吐毒素具有耐酸、耐热的特性，不受胃蛋白酶的影响[21]。推测呕吐毒素进入人体后经胃进入十二指肠与5-HT3受体结合，刺激迷走神经导致呕吐症状。呕吐毒素能将K+导入线粒体内，通过抑制脂肪酸的氧化破坏线粒体的活性[22]。淀粉能促进呕吐毒素的产生，因此呕吐毒素食物中毒事件多与进食米面等淀粉含量高的食物有关[23]。一般误食被污染的食品0.5 h 后就会有头晕呕吐，伴有腹泻、发烧和四肢无力等现象。
2.2.2 危害特征描述
蜡样芽孢杆菌分为有毒菌株与无毒菌株，有毒菌株可引起动物和人的食物中毒，偶见由该菌引起的眼部感染、皮下脓肿、肝衰竭等疾病[24]。摄入蜡样芽孢杆菌有毒菌株污染的食物后主要引起呕吐和腹泻等急性肠胃炎症状，因此其剂量-反应曲线的终点是以疾病的发病来界定的。国际公认的蜡样芽孢杆菌肠毒素阈值为0.1～1.0 μg，即摄入这个浓度范围的肠毒素可产生中毒症状。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的研究得出肠毒素含量只要高于1.0 μg 即可造成蜡样芽孢杆菌食物中毒[25]，而食物中蜡样芽孢杆菌超过102CFU·g-1时即可产生足够致病的肠毒素，引发中毒症状[26]。因此，本次评估以102CFU·g-1作为蜡样芽孢杆菌食物中毒的阈值标准。
2.2.3 暴露评估
（1）样品初始污染情况。通过对不同采样地点、不同亚类的203 批次婴幼儿配方食品进行检验，结果空白对照未见蜡样芽胞杆菌菌株，样品中共检出蜡样芽孢杆菌23 株，以数值>100 CFU·g-1为阳性，比率占总体样本的11.33%；
检出呕吐性基因3 份，阳性检出的构成比为10.83%。其中，婴幼儿谷类辅助食品的检出率和构成比较大，疑似其淀粉成分的比例和蜡样芽孢杆菌的依赖性相关。
（2）暴露人群与消费量。蜡样芽孢杆菌对人群的影响主要是通过摄入被蜡样芽孢杆菌有毒菌株污染的食物。本暴露评估主要是针对免疫力低下、未发育完全的婴幼儿等一类食用婴幼儿配方食品的特殊人群。结合《社区居民膳食营养与健康状况的调查分析》[27]和婴幼儿对1～3 段配方食品的平均日常摄入情况（80～300 g·d-1），暂定婴幼儿对配方食品的日均摄入量为200 g·d-1。
（3）风险暴露评估。采用风险评估理论，通过计算膳食暴露风险商（Risk Quotient，RQ），评估婴幼儿配方食品中暴露蜡样芽孢杆菌的风险大小，RQ的值越小风险越低。当RQ≥100%时表示有较大的风险；
当RQ≤100%时表示风险在可接受范围内。膳食暴露风险商计算为
式中：RQ为暴露风险商，%；
EDI为婴幼儿食品的日均摄入量（Estimated Daily Intake），CFU·g-1·d-1；
ADI为每日允许摄入量（Acceptable Daily Intake），CFU·g-1·d-1，以102CFU·g-1为参考；
C为婴幼儿食品中蜡样芽孢杆菌的数量，CFU·g-1；
P为婴幼儿食品日均摄入量，kg·d-1；
bw为体重，kg。
婴幼儿体重按20 kg 计算，则EDI=100 CFU·g-1·0.2 kg·20 kg-1·d-1=400 CFU·g-1·d-1；
ADI=102CFU·g-1·20 kg·kg-1·d-1=2 000 CFU·g-1·d-1。RQ=EDI/ADI×100%=20%。
2.2.4 风险特征描述
把风险评估的输出数据与剂量-反应关系模型结合起来，可以导出婴幼儿配方食品中暴露蜡样芽孢杆菌的风险大小。本研究尝试运用风险评估的理论，对本市市售婴幼儿配方食品进行暴露评估。结果发现23批次样本中有蜡样芽孢杆菌的检出，暴露风险商数值较小（RQ＜100%），同时发现呕吐性毒素菌株3 例，说明本市婴幼儿配方食品中暴露蜡样芽孢杆菌的危险性虽尚在可控范围内，但也应引起足够重视。
蜡样芽孢杆菌属芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，可在8～55 ℃条件下存活，但在pH ≤2 或含水量≤0.95%时无法生存[28]。然而一旦侵入宿主后，若不能快速准确诊断治疗，其分泌的毒素上升后将会对宿主造成很大的危害。尽管有时定量检测的结果未能达到引起食物中毒的阈值，但不能排除蜡样芽孢杆菌在适宜条件下大量繁殖和引起腹泻及呕吐的可能，因此不能忽视其在婴幼儿配方食品中的潜在污染。
由于蜡样芽孢杆菌族不同物种之间普遍存在质粒水平或垂直转移，导致它们的表型、致病性和宿主特异性方面有明显的差异，目前尚需借助全基因组单核苷酸多态性分析（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）和多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）等基因分析手段对其不同菌种加以区分和鉴别[27]。本研究采用PCR 法结合试剂盒分离出3 份呕吐性基因，提示蜡样芽孢杆菌在市售的婴幼儿配方食品中尚有潜在风险，应加强此方面的风险评估和分析工作。
我国对食源性致病菌的风险评估工作起步较晚，体系机制还不够完善，工作缺乏制度化、法制化和系统化的保障，而微生物本身的特点又决定了微生物风险评估的复杂性，必须考虑不确定性和变异性。不确定性的种类包括模型不确定性、生长过程不确定性和参数不确定性等。进行定量风险评估的核心部分就是剂量-反应分析，但相关剂量-反应模型的缺乏亦影响了婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌评估的确定。而基因型、菌株类型和环境条件的改变等方面也是产生变异性的至关要素。因此，对蜡样芽孢杆菌中毒风险的评估普遍是基于模型预测的菌体水平相关联的肠毒素水平，而不是实际食品中预测的肠毒素水平，即剂量-反应关系。不同类型的肠毒素和它们的基因表达调控机理以及是否存在一定的相互作用关系尚不明确。可见，各种不确定性和变异性都给微生物风险评估工作带来了具大挑战。
为尽快提高婴幼儿配方食品中蜡样芽孢杆菌风险评估的科学性、有效性，宜做好以下几点工作。①建立相关的云数据库或平台，加强微生物学、流行病学、数学、统计学和计算机学等多学科的融汇与交合，建立完善的蜡样芽孢杆菌的剂量-反应关系。②加强蜡样芽孢杆菌交互模型的研究，模拟真实的微生物生长和变化，降低分析结果的不确定性和变异性。③借鉴先进的风险评估理念和手段，利用数学模型、量子计算机等先进手段，构建符合我国国情的致病微生物危害性评估新技术、新方法。
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