液相色谱-串联质谱法测定虾类中四环素类物质的不确定度评定
时间：2023-01-23 22:25:01 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
◎ 何咏欣，陈嘉欣，龚海锟，杨嘉鑫威，张 辉，林泽珊，黄景初，钱振杰
（广州市食品检验所，广东 广州 511400）
四环素类物质（四环素、土霉素、多西环素和金霉素）是一类较为常见的兽药，常用作广谱抗病原微生物的快速抑菌剂，高浓度时能对某些细菌有杀菌效果。由于四环素类抗生素抑菌效果好、价格便宜，具有防治肠道感染和促进生长等优点，在畜类、禽类、水产品饲料添加剂和药品等产业领域中广泛使用[1]。但在生产养殖行业中无节制地使用四环素类药物会导致其在动物食品及其制品中大量残留，人们可通过食物摄入残留药物进而危害身体健康。因此，在食品安全监管的重点监测项目中包括动物源性食品中四环素类药物的残留量。
目前，水产品中四环素类兽药残留检测主要采用高效液相色谱法[2-4]和高效液相色谱-串联质谱法[5-8]。《食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的测定》（GB 31656.11—2021）增加了液相色谱-串联质谱测定方法，方法检出限更低，灵敏度更高。研究不确定度来源是对测量结果准确度的重要评定标准之一，能在一定程度上反映该测定方法的准确性和可信度[9]。本文依据《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）[10-13]、《化学分析中不确定度的评估指南》（CNAS—GL006：2019）[14]和《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1—2012）[15]等标准，结合日常检测发现虾类样品中四环素类药物残留相对较多。本文对GB 31656.11—2021中高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中四环素残留量的不确定度进行分析与评定，为确保检测结果准确度、可信度和加强实验室的质量控制及规范养殖业用药安全提供依据[16-20]。
1.1 材料与试剂
虾类，购于广州市场；
盐酸土霉素标准品（CAS No：2058-46-0）、四环素盐酸盐标准品（CAS No：64-75-5）、金霉素盐酸盐标准品（CAS No：64-72-2）和多西环素标准品（CAS No：24390-14-5），均为德国Dr.厂家提供；
乙腈、甲醇、乙酸乙酯和正己烷（色谱纯，美国Thermo 公司）；
甲酸、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、氢氧化钠（分析纯，广州化学试剂厂）；
柠檬酸、磷酸氢二钠（分析纯，广东光华科技公司）；
醋酸铅（分析纯，上海安谱公司）；
Waters Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，沃特世公司）；
氮气（99.999%，大成广州气体公司）。
1.2 仪器与设备
ABI 4000 QTRAP 液相色谱-串联质谱仪，配ESI离子源（美国AB 公司）；
电子天平（精度0.01 g，德国赛多利斯公司）；
电子天平（精度0.000 01 g，德国赛多利斯公司）；
离心机（德国Sigma 公司）；
涡旋振荡器（德国IKA 公司）；
超声波清洗仪（上海安谱公司）；
系列刻度吸管（A 级，天津天玻公司）；
系列移液器（德国艾本德公司）；
氮吹仪（美国Organomation 公司）；
超纯水机（法国Millipore 公司）。
1.3 实验方法
1.3.1 样品制备
按照GB/T 30891—2014 附录B 中的要求制样，取均质后的待测样品为待测样，取均质后的空白样品为空白样，空白样中添加20 μL 1.00 μg·mL-1标准工作液为加标样。
按照GB 31656.11—2021 所述方法进行样品前处理：称取2.0 g（准确至±0.01 g）样品使用提取液提取3 次，合并提取液后取部分提取液过固相萃取柱净化，氮吹浓缩后及时测定。
1.3.2 混合标准工作液配制
称取标准品盐酸土环素10.51 mg、四环素盐酸盐10.29 mg、金霉素盐酸盐10.76 mg、多西环素10.07 mg，分别用甲醇定容于10 mL 棕色容量瓶，分别配制成浓度为1.0 mg·mL-1标准储备液。分别吸取1 000 μL 标准储备液定容至10 mL，配制成10.00 μg·mL-1的混合标准储备液。吸取1.0 mL混合标准储备液定容于10 mL容量瓶，配制成1.00 μg·mL-1标准工作液。
1.3.3 标准曲线制备
使用100 μL 或1 mL 量程的移液器分别准确吸取0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL 和1.00 mL 1.00 μg·mL-1四环素类标准工作液于一系列10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成浓度分别为5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和100 ng·mL-1的标准工作曲线溶液。每次实验现用现配，以标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.4 仪器条件
（1）液相色谱条件。色谱柱：C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）；
流速：0.3 mL·min-1；
柱温：30 ℃；
进样量：3 μL；
流动相：A 为甲醇，B 为0.1%甲酸溶液；
梯度洗脱程序：0.01～1.00 min，75%B，1.00～4.00 min，75%B～30%B，4.00～5.40 min，30%B，5.40～5.50 min，30%B～75%B，5.50～7.00 min，75%B。
（2）质谱条件。电离方式：ESI 离子源。离子喷雾电压为5 500 V；
雾化气：氮气，40 psi；
干燥气：氮气，流速10 L·min-1，温度500 ℃；
碰撞气：氮气；
扫描模式：MRM 正离子扫描模式。
1.3.5 数学模型的建立
试样中四环素类物质残留量的计算公式为
式中：X为试样中四环素类物质残留量，μg·kg-1；
C为样品溶液中四环素类物质的质量浓度，ng·mL-1；
V为提取液总体积，mL；
m为试样称取的质量，g。
2.1 不确定度主要来源
通过分析实验方法和数学模型，不确定度来源主要包括标准溶液的配制、前处理提取、样品制备、仪器测定等步骤，参考文献[21]将每个步骤细化绘制出不确定度来源图，见图1。
图1 不确定度来源鱼骨图
2.2 标准溶液配制引入的不确定度
2.2.1 标准品纯度引入的相对标准不确定度urel(S1)
经标物证书查询可得盐酸土霉素、四环素盐酸盐、金霉素盐酸盐和多西环素4 种标准品的纯度及其扩展不确定度，假设呈均匀分布根据文献[14]可得标准物质的相对标准不确定度的计算公式为由标准物质纯度引入的相对标准不确定度见表1。
表1 标准物质纯度引入的相对标准不确定度表
2.2.2 标准品称量引入的相对标准不确定度urel(S2)
使用十万分之一的电子天平称取标准品，依据该天平附的检定证书，其最大允许误差为±0.05 mg，按均匀分布，包含因子则根据文献[14]计算公式可计算出计算得到4种四环素类标准物质称量引入的相对标准不确定度，结果见表2。
表2 4 种四环素类标准物质称量引入的相对标准不确定度表
2.2.3 标准物质溶液定容引入的相对标准不确定度urel(C1)
配制标准物质溶液是用甲醇溶解并定容至10 mL 容量瓶中，依据《常用玻璃器具检定规程》（JJG 196—2006）可得，10 mL A 级容量瓶容量允差为±0.020 mL，按均匀分布，则根据文献[14]公式可计算得出容量瓶体积校准引入的标准不确定度为
配制标准物质溶液除了容量瓶标定引入的不确定度外，还有温度引入的标准不确定度，实验室的温度变化范围是（20±5）℃，温度影响引入的不确定度可通过估算该温度范围和体积膨胀系数计算，液体的体积膨胀远大于容量瓶的体积膨胀，因此只考虑溶剂的体积系数，甲醇的膨胀系数为1.19×10-3℃-1，产生的体积变化为±（10×5×1.19×10-3）=0.059 5 mL，按均匀分布，则根据文献[14]计算公式可得温度引入的标准不确定度为
根据文献[14]计算公式可得标准物质溶液定容引入的不确定度为
根据文献[14]计算公式可得标准物质溶液定容引入的相对标准不确定度为
2.2.4 标准中间液及标准曲线配制过程中引入的相对标准不确定度urel(C2)
配制成1.00 μg·mL-1中间液：使用100 μL 移液器分别依次吸取99.9 μL、98.7 μL、94.4 μL 和95.4 μL 的多西环素、四环素盐酸盐、金霉素盐酸盐、盐酸土霉素标准物质溶液定容至10 mL 配制成浓度为10.00 μg·mL-1四环素类混标溶液，再使用1 mL 移液器吸取1 mL 混标溶液配制成1.00 μg·mL-1混标中间液。
标准曲线工作溶液按1.3.3 步骤配制。根据证书查询并计算可得溶剂为甲醇时移液枪和容量瓶产生的不确定度，结果见表3。
表3 溶剂为甲醇时移液枪和容量瓶产生的不确定度表
则可计算得出配制标准中间液和标准工作液过程中引入的相对标准不确定度为
2.3 称量样品引入的相对标准不确定度urel(m)
实验称取2 g（准确至±0.02 g）样品，由电子天平检定证书可得，当称样范围在0～50 g 时，其最大允许误差为±0.01 g，采用B 类方法评定，按均匀分布，则称量样品引入的相对标准不确定度urel(m)为0.002 89。
2.4 样品处理引入的相对标准不确定度urel(V总)
实验过程中影响定量的步骤有3 部分。①样品提取3 次，分3 次加入6 mL Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液和1 次2.0 mL 醋酸铅溶液提取，使用10 mL 分度吸量管3次，使用2 mL分度吸量管1次。②精确取10.0 mL提取液上样固相萃取柱，使用10 mL 分度吸量管1 次。③用1.0 mL 的0.1%甲酸水溶液溶解残留物，使用1 mL 移液枪1 次。产生不确定度的主要来源是吸取提取液的10 mL 刻度吸管、2 mL 刻度吸管和1 mL 移液枪。根据检定证书可得10 mL 刻度吸管的允许误差为±0.05 mL，2 mL 刻度吸管的允许误差为±0.012 mL，采用B 类方法评定，按均匀分布，根据文献[14]计算公式可得10 mL 分度吸量管引入的相对标准不确定度urel(V10mL)为0.004 81，2 mL 分度吸量管引入的相对标准不确定度urel(V2mL)为0.003 46。根据表3可得1 mL 移液枪引入的相对标准不确定度urel(V1mL)为0.005 77。实验用的提取液均用纯水配制，缓冲盐等物质占比较小，所以提取液的膨胀系数均以水的膨胀系数计算。水的膨胀系数为2.08×10-4℃-1，实验室的温度变化范围是（20±5）℃，按均匀分布，则由温度引入的相对标准不确定度为
由此可得实验过程中样品前处理经过稀释浓缩富集后引入的相对标准不确定度为
2.5 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(curve)
将标准曲线的5 个浓度点的工作液上液相色谱-质谱联用仪器检测，每个浓度点重复测定3 次，横坐标为标准溶液的浓度，纵坐标为标准曲线液质图谱峰面积，最小二乘法拟合得到线性回归方程及相关系数，标准曲线及加标样测定结果见表4和表5，标准曲线线性方程及其拟合引入的相对不确定度表见表6。
表4 标准曲线测定峰面积表
表5 加标样测定结果表（n=6)
表6 标准曲线线性方程及其拟合引入的相对不确定度表
线性回归方程的标准差Sy的计算公式为
标准曲线的拟合引入的标准不确定度计算公式为
标准曲线的拟合引入相对不确定度计算公式为
式中：Sy为标准曲线的标准差；
n为标准曲线校准点的测量次数；
a为校准曲线的斜率；
b为校准曲线的截距；
Ai为第i次测量时标准溶液的峰面积；
ci为第i次测量时标准溶液的浓度，ng·mL-1；
p为样品溶液测量次数；
c0为代入标准曲线线性方程所得的样品溶液浓度的平均值，ng·mL-1；
c曲线为标准溶液浓度点的平均浓度，ng·mL-1。
2.6 样品重复性测定引入的相对标准不确定度urel(X)
取空白样品加标，加标含量为20 μg·kg-1，经提取处理后上机，用该曲线对加标样重复测定6 次，通过公式计算得到样品重复性测定引入的相对标准不确定度，结果见表7。
标准偏差Sx的计算公式为
样品重复性测定及回收率的标准不确定度的计算公式为
计算样品重复测定及回收率的相对标准不确定度为
式中：Sx为样品重复性测定的标准偏差；
n为测量次数；
Xi为样品的测定值，μg·kg-1；
为测定样品的平均值，μg·kg-1。
2.7 合成标准不确定度urel(W)
根据上述分析的不确定度计算合成标准不确定度urel(W)，结果见表7。计算公式为
表7 加标样对应含量及其相关不确定度表
2.8 扩展不确定度
根据表7中测得样品中4 种化合物的平均含量，合成标准不确定度的计算公式为u=urel(W)×，可得u(CTC)=0.053 9×18.6=1.002 54 μg·kg-1；
u(DC)=0.049 3×18.8=0.926 84 μg·kg-1；
u(OTC)=0.048 6×19.3=0.937 98 μg·kg-1；
u(TC)=0.049×19.2=0.940 8 μg·kg-1。
根据《化学分析中测量不确定度评估指南》对检验实验室的规定[14]，在置信区间P=95%时，扩展因子取k=2，扩展不确定度计算公式为U=k×u。因此，U(CTC)=2×1.002 54=2.005 08 μg·kg-1；
U(DC)=2×0.926 84=1.853 68 μg·kg-1；
U(OTC)=2×0.937 98=1.875 96 μg·kg-1；
U(TC)=2×0.940 8=1.881 6 μg·kg-1。最终测得金霉素含量为（18.6±2.0）μg·kg-1（k=2）；
多西环素含量为（18.8±1.9）μg·kg-1（k=2）；
土霉素含量为（19.3±1.9）μg·kg-1（k=2）；
四环素含量为（19.2±1.9）μg·kg-1（k=2）。根据不确定度分析计算结果绘制四环素类化合物不确定度分量占比图，见图2。
图2 测定四环素类4 种化合物的不确定度分量柱状图
本研究依据《食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素、多西环素残留量的测定》（GB 31656.11—2021）测定虾中四环素类药物的残留量，对实验中产生的各种不确定度进行计算与评定。结果表明，标准曲线配制引入的不确定度最高，其次是标准曲线拟合引入的不确定度，而其他因素引入的不确定度相对较小。因此，通过选择适合量程的高等级移液器与容量瓶、选择合适的浓度点、减少标准溶液稀释次数和标曲拟合中选择合适的权重方式，可提高检测结果的准确度。同时，采取增加样品测定次数、加标回收、仪器比对、人员比对等质控方式降低实验误差，也是减小试验不确定度的有效途径。
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