细胞嗜性差异的2株柯萨奇病毒A10型的构建与拯救
时间：2023-01-23 21:35:02 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
裴捷，杨祥，汪梦俊，刘睿伦，周金戈，吕诗韵，王文辉，郭靖，孟胜利，申硕
武汉生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗研究一室 国家联合疫苗工程技术研究中心 湖北省疫苗技术创新中心，湖北 武汉 430207
手足口病（hand-foot-and-mouth disease，HFMD）是一种全球范围内严重危害婴幼儿生命健康的传染病，主要由肠道病毒引起［1-2］。当前引起HFMD的主要流行毒株有肠道病毒A71型（enterovirus A71，EV-A71）、柯萨奇病毒A16型（Coxsackievirus A16，CV-A16）、A6型（CV-A6）和A10 型（CV-A10）等［1，3］。EV-A71 单价灭活疫苗已成功上市，而针对包含CV-A16、CV-A6、CV-A10 毒株在内的多价HFMD 疫苗尚处于临床前研究阶段［4-5］。近年来的流行病学调查表明，CV-A6和CV-A10 逐渐替代EV-A71 和CV-A16 成为我国HFMD的主要流行株［6-8］，由CV-A6和CV-A10引起的重症HFMD 病例也陆续被报道［9-10］。2015年在对厦门18 例重症HFMD 病例的检测中发现，有7 例是由CV-A10 毒株引起的［10］。因此，对于新流行毒株，特别是CV-A10毒株疫苗的研发迫在眉睫。
在流行毒株临床样本分离用于灭活疫苗研究及生产的过程中，CV-A10 毒株人用疫苗细胞基质的分离培养面临巨大挑战。早期研究表明，CV-A10 毒株可在人横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma，RD）细胞中分离培养，但无法在人用疫苗生产细胞基质Vero 细胞上生长［6，8，11］。近年来，陆续有文献报道从Vero 细胞上分离得到CV-A10 毒株，但分离率较低，且适应性有限［12-13］。目前对于不同CV-A10 毒株在Vero 细胞上适应能力的差异尚不明确。
CV-A10毒株在人用疫苗细胞基质Vero细胞或二倍体细胞上难以分离培养，严重限制了灭活疫苗候选株的筛选范围。随着RNA病毒反向遗传操作技术的成熟，研究者可利用重组DNA 技术对RNA 病毒定向改造，以获得满足生产需要的毒株性状，如获得在Vero细胞上生长良好、免疫原性强的候选疫苗株。本研究以从临床样本中分离到的在Vero细胞上表现出适应性差异的两株CV-A10毒株为亲本毒株，分别构建其感染性克隆并完成病毒拯救，为今后利用肠道病毒反向遗传操作技术解析CV-A10毒株在Vero细胞上的嗜性决定位点，研究不同肠道病毒进入细胞的机理，定向构建适应Vero细胞的疫苗候选株奠定基础。
1.1 细胞、毒株及质粒 XL-10化学感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司；
RD 细胞、Vero 细胞、克隆质粒pBR322 及T7-RNA 聚合酶表达质粒pCAGGS-T7 均由本实验室保存；
CV-A10-R3482／XY CHN／2017 毒株经RD 细胞分离自1 例2017年湖北襄阳HFMD 患儿临床样本，且无法在Vero 细胞上分离生长；
CV-A10-V010195／PX CHN／2019 毒株经Vero细胞分离自1例2019年江苏沛县HFMD 患儿临床样本。
1.2 主要试剂 病毒RNA 提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自德国QIAGEN 公司；
逆转录试剂盒HiScript@Ⅱ、DNA 聚合酶Phanta@和无缝连接试剂盒ClonExpressⅡ均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；
转染试剂LipofectamineTM2000和荧光二抗Alexa FlourTM488 羊抗兔抗体均购自美国Thermo 公司；
兔抗CV-A10 多克隆抗体由本实验室制备并保存；
4%多聚甲醛固定液、细胞通透液和细胞核染色液DAPI 均购自上海碧云天生物技术有限公司；
限制性内切酶NotⅠ-HF 购自美国NEB公司。
1.3 细胞培养 Vero 细胞用DMEM 培养基培养，RD细胞用MEM 培养基培养，均添加10%新生牛血清，维持液均不添加血清，于37 ℃常规培养。
1.4 引物设计及合成 使用Primer 5 软件设计CVA10 毒株测序、感染性克隆构建及菌落PCR 鉴定所用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。感染性克隆构建时所用病毒5′及3′端引物序列为CV-A10 保守序列，引物5′端引入T7 启动子序列，引物3′端引入25 个碱基的polyA 尾及NotⅠ酶切位点。
表1 CV-A10毒株测序、感染性克隆构建及鉴定所用引物Tab.1 Primers for sequencing，construction of infective clone and identification of CV-A10 strains
1.5 病毒基因组的扩增 用病毒RNA 提取试剂盒提取CV-A10-R3482／XY CHN／2017 及CV-A10-V010195／PX CHN／2019 临床分离株的病毒基因组后，用逆转录试剂盒HiScript@Ⅱ逆转录得到病毒基因组cDNA。按照DNA 聚合酶Phanta@说明书，分别以两个毒株的cDNA 为模板，pBR322-CV-A10-T7-F／pBR322-CV-A10-NotⅠ-R 引物对进行病毒基因组全长扩增。PCR 反应条件为：95 ℃预变性2 min；
95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s／kb，共35个循环；
72 ℃延伸7 min。
1.6 感染性克隆质粒的构建 以pBR322 质粒为模板，pBR322-F／pBR322-R 引物对扩增得到线性化载体片段，引物设计时基因组片段两端与载体两端各有16 个碱基的同源臂用于无缝连接。使用胶回收试剂盒回收上述PCR 扩增产物，测定浓度后，按照ClonExpressⅡ无缝连接试剂盒说明书，将基因组片段与载体序列按摩尔比2∶1 混合后，利用ClonExpressⅡ酶于37 ℃作用30 min 进行连接。连接产物转化XL-10 感受态细胞，挑取单菌落，以JD-pBR322-F／JD-pBR-A10-R引物对扩增进行PCR鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，确认正确后保存菌种并扩大培养，使用质粒提取试剂盒提取质粒。
1.7 CV-A10毒株的拯救及鉴定使用限制性内切酶NotⅠ对构建的全长质粒进行酶切，胶回收试剂盒回收得到线性化片段。使用Lipofectamine™2000 转染试剂，将0.5 μg pCAGGS-T7 质粒分别与0.5 μg 线性化片段混合后，于12 孔板共转染RD 细胞（细胞密度60% ～70%），转染4 h 后更换不含血清的MEM 培养基维持液，于37 ℃培养箱继续培养4 d 后病毒拯救孔出现细胞病变（cytopathic effect，CPE），冻融3 次后收获P0 代拯救病毒。将拯救病毒在RD 细胞上扩增至P3 代后，提取病毒RNA，逆转录得到cDNA，使用测序引物进行扩增鉴定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。
1.8 两株CV-A10 拯救毒株细胞嗜性差异的比较按MOI = 1 将两株拯救病毒分别接种至RD 及Vero细胞上，并设未加病毒的阴性对照，48 h 后观察CPE情况。
1.9 两株CV-A10 拯救毒株在Vero 细胞上感染能力的比较采用间接免疫荧光试验。按MOI=1将两株拯救病毒分别接种至Vero 细胞上，并设未加病毒的阴性对照，感染1 h；
PBS洗涤3次，更换维持液，37 ℃培养48 h；
弃去细胞上清，加入4%多聚甲醛，固定30 min；
PBS 洗涤3 次，加入细胞通透液通透10 min；
PBS 洗涤3 次，加入含1%BSA 的PBS，37 ℃封闭1 h；
加入兔抗CV-A10多克隆抗体（1∶1 000稀释），37 ℃孵育1 h；
PBS 洗涤3 次，加入Alexa FlourTM488 羊抗兔二抗（1∶500稀释），37 ℃避光孵育1 h；
PBS洗涤3次，加入DAPI（1∶1 000 稀释）进行细胞核染色，室温避光孵育5 min；
PBS 洗涤3 次后，于荧光显微镜下观察并拍照。
2.1 病毒基因组全长扩增产物的鉴定 两株CV-A10毒株基因组全长扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，均可见7 494 bp 的基因组全长序列，大小与预期一致，见图1。
图1 两株病毒基因组全长PCR扩增产物电泳图Fig.1 Electrophoretic profile of PCR products of full-length genomes of two strains
2.2 感染性克隆质粒的鉴定 两株CV-A10 毒株感染性克隆质粒的阳性菌落经PCR 鉴定，可见577 bp的目的片段，大小与预期一致，见图2。测序后确认序列正确。扩大培养并提取质粒获得两株CV-A10毒株的全长基因组克隆质粒pBR322-CV-A10-3482及pBR322-CV-A10-010195（以下简写为p3482 及p0195），用于后续病毒拯救。
图2 质粒的菌落PCR鉴定Fig.2 Colony PCR identification of plasmids
2.3 拯救病毒的鉴定 将线性化的p3482 及p0195片段与pCAGGS-T7质粒共转染RD 细胞后第4天，能观察到明显的CPE，成功拯救得到重组病毒rCV-A10-3482及rCV-A10-010195（以下简写为r3482及r0195），见图3。提取病毒RNA，进行RT-PCR，测序后进行序列比对，与亲本毒株序列一致。
图3 拯救的r3482 及r0195 在RD 细胞上的CPE 观察（×100）Fig.3 CPE of rescued r3482 and r0195 in RD cells（×100）
2.4 两株CV-A10拯救毒株细胞嗜性差异的比较 显微镜下观察显示，r3482和r0195毒株在RD细胞上均可见明显的CPE，r0195 毒株在Vero 细胞上也可见明显的CPE，而r3482 毒株接种于Vero 细胞后不引起CPE，见图4。r3482 和r0195 毒株的细胞嗜性表现型分别为Vero-／RD+和Vero+／RD+，均与母株相同。
图4 r3482和r0195毒株在RD及Vero细胞上的CPE观察（×100）Fig.4 CPE of r3482 and r0195 in RD and Vero cells（×100）
2.5 两株CV-A10 毒株在Vero 细胞上感染能力的比较 r3482 和r0195 毒株分别接种于Vero 细胞48 h后，r0195 毒株感染的细胞荧光显微镜下可见明显的绿色荧光，表明r0195 毒株可有效感染Vero 细胞，实现病毒蛋白的表达；
而r3482 毒株接种于Vero 细胞后，无法实现对Vero细胞的有效感染。见图5。
图5 间接免疫荧光检测r3482 和r0195 毒株对Vero 细胞的感染（×100）Fig.5 Determination of infection of r3482 and r0195 on Vero cells by indirect immunofluorescence assay（IFA）（×100）
HFMD 严重危害我国婴幼儿的生命健康，近15年来，国内引起HFMD 的病原谱已发生改变，已上市的EV-A71灭活疫苗无法保护当前主要流行毒株CVA6 及CV-A10 引起的HFMD［6，14］。对于新流行毒株的疫苗研发迫在眉睫。目前针对新流行毒株的基础研究不足，严重限制了疫苗研发的推进速度。
早期关于肠道病毒的研究集中在EV-A71，但关于EV-A71 基础研究的成果并不能有效推广至其他肠道病毒血清型［15］。研究表明，不同肠道病毒在入侵宿主细胞时所使用的主要受体不同。EV-A71 和CV-A16 的主要受体为人B2 类清道夫受体2（scavenger receptor class B member 2，SCARB2），而CV-A6和CV-A10 的主要受体则为含环状结构跨膜蛋白1（kringle containing transmembrane protein 1，KREMEN1）［16-17］。所用受体的不同可能是决定不同肠道病毒在不同细胞上分离难度差异的重要因素，解析不同毒株对不同细胞系的侵染机制，有助于疫苗毒株的快速选育［18-19］。
EV-A71和CV-A16等毒株在Vero细胞上较易分离，而CV-A6和CV-A10等毒株在人用疫苗细胞基质Vero 细胞上分离难度大［6，8，11］，疫苗候选测试株少。早期研究表明，CV-A10 毒株可在RD 细胞中分离培养，但无法在Vero细胞上生长。随着CV-A10毒株的逐渐流行，近年来陆续有文献报道从Vero 细胞上分离得到CV-A10 毒株，但分离率低，分离得到的毒株在Vero 细胞上增殖能力较弱［12，20］。解析能够在Vero细胞上生长的CV-A10毒株的机制对于CV-A10疫苗候选株的选育意义重大。
RNA 病毒的反向遗传操作系统是推进RNA 病毒机制研究的重要工具［21］。在肠道病毒的研究中，研究者已建立了成熟的EV-A71 反向遗传操作系统进行致病机制、毒力研究及疫苗研发等工作［22］。CVA2 和CV-A6 毒株在RD 细胞分离后，在Vero 细胞适应，并以反向遗传学技术在Vero 细胞拯救得到的疫苗候选株已有报道［23-24］。而关于CV-A10 毒株的反向遗传操作系统尚无报道。本研究以从临床样本中分离得到的在Vero 和RD 细胞上呈现细胞嗜性差异的毒株为模板，分别构建了能有效感染Vero 细胞和不能感染Vero 细胞的两株CV-A10 毒株的感染性cDNA，并实现了病毒拯救。基于RD 和Vero 细胞分离传代毒种未经空斑纯化株的共有序列（consensus sequences）构建二者的感染性cDNA，并获得拯救病毒。本研究在分子水平证明了不同基因型CV-A10毒株对细胞嗜性的影响，也为进一步分析细胞嗜性相关位点，研究病毒进入细胞的机理奠定了基础。
使用高效率及高保真度的逆转录酶和DNA 聚合酶可直接以提取的病毒基因组为模板，扩增得到基因组全长序列。对于载体，为了避免酶切不完全，载体自连等问题，以PCR扩增pBR322质粒的方式引入同源臂，并得到线性化载体。采用无缝连接技术连接基因组片段及线性化载体，最终构建的感染性克隆质粒阳性率在95%以上。传统的肠道病毒拯救过程中，将感染性克隆线性化后使用T7-RNA聚合酶体外转录试剂盒进行体外转录，回收RNA 后转染细胞进行病毒拯救［25］。但RNA 易降解，不稳定，操作过程复杂，难度大，且每次病毒拯救依赖T7-RNA 聚合酶体外转录试剂盒。因此，本研究引入T7-RNA聚合酶表达载体pCAGGS-T7，与线性化载体共转染完成病毒拯救。拯救后得到了在Vero细胞上嗜性不同的两株CV-A10毒株r3482和r0195，可作为后续开展CV-A10毒株细胞嗜性研究的重要工具。
综上所述，本研究结合无缝连接技术构建感染性克隆，引入T7-RNA 聚合酶表达载体进行病毒拯救，建立了细胞嗜性差异的两株CV-A10毒株的反向遗传操作系统，证明了CV-A10 细胞嗜性与不同年代、不同地点分离株的基因型相关。为进一步解析CV-A10 毒株对于Vero 细胞的细胞嗜性及病毒进入细胞的机制，定向改造能够适应于Vero 细胞生长的CV-A10疫苗候选株奠定了基础。
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