党参青霉病病原菌鉴定及生物学特性
时间：2023-01-23 10:20:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
吕丙钰，杨董云，薛华丽，杨志敏
（1.甘肃农业大学理学院，甘肃 兰州 730070；
2.兰州市食品药品检验检测研究院，甘肃 兰州 730070）
党参（Codonopsis Penicilliosis（Franch.）Nannf.）是我国传统的中药材，属于桔梗科多年生草本植物。性平、味甘，具有补中益气，健脾益肺之功效［1］。还具有免疫调节、改善胃溃疡、抗炎、抗氧化、调节糖脂代谢及抗肿瘤等多种药理作用［2］。据研究，党参富含生物碱、聚炔类、木质素类、黄酮类化合物和多糖等活性成分［3］。
随着党参栽培面积的不断扩大，党参病害已经成为制约其产量与品质的关键因素。目前，已报道的党参的病害有Septoria codonopsidis Ziling引起的斑枯病、Botrytis cinerea Pers.引起的灰霉病、Fu⁃sarium oxysporum Schl.引起的根腐病、Sphaero⁃theca codonopisi（Golov.）Z.Y.Zhao引起的白粉病、Puccinia campanumoeae Pat.引起的锈病、Helicoba⁃sidium mompa Tanaka引起的紫纹羽病［4-5］等。然而，上述病害的研究主要集中在田间，即采收之前。对党参采后青霉病的报道甚少，陈娟等［6］调查了江西药材市场7种药材饮片，其中6种药材如：甘草、黄芩、巴戟天、白术、当归、党参中均存在青霉属真菌的污染，且均分离出皮落青霉（Penicillium crustosum）。在甘肃，党参的采收期正值10月中下旬，处于低温高湿的季节，而当地的农民采收后通常会选择自然晾干，然而，不利的外界环境条件极易导致新鲜党参在采后发病，且病害主要为青霉病，农民针对这些病害的主要处理措施仅是局限于简单的水洗，或者刷掉发病处表面的菌落，党参表面的病原菌虽然可以清除，但是致病菌产生的毒素会在党参体内大量积累。党参作为一种药食同源的植物，这不仅严重影响党参的品质，重要的是，会对人体健康带来巨大的威胁。
据报道，大部分青霉属病原菌均可代谢产生棒曲霉素（patulin）［7］。而棒曲霉素具有致畸、致癌、影响生育和免疫抑制等毒理作用［8］。世界上很多国家都对果汁产品中棒曲霉素的最大限量做了规定，如欧盟（European Union，EU）、美国食品与药物管理局（USFood and Drug Database，USFDA）规定果汁产品中棒曲霉素的最大限量为50μg/kg［9-10］，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）建议正常人每天棒曲霉素的摄入量不超过0.4μg/kg体质量［11］。然而，对中草药中棒曲霉素的限量标准，目前尚未见报道。
本试验对甘肃省党参青霉病病原菌进行分离纯化，通过形态学和分子生物学技术对病原菌进行鉴定，并对病原菌的生物学特性以及产毒情况进行研究，该研究可为后期病害的综合防治提供理论依据。
1.1 样本采集
党参采收自甘肃省定西市岷县的党参种植基地，装袋后24 h内运往甘肃农业大学理学院化学生物学实验室，室温贮藏，待其自然发病。
1.2 培养基
PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖10 g，琼脂17 g，水1 000 mL；
察氏培养基：NaNO33 g，KH2PO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 mL。
1.3 病原菌分离纯化
取5 mm×5 mm的具有典型青霉病症状的党参病健交界处组织，用1%的次氯酸钠消毒3 min，再用无菌水冲洗3次，去除残留的次氯酸钠［12］。将其接种于PDA培养基，25℃恒温培养5~7 d，用打孔器将菌落转移至新的PDA培养基上，纯化2~3次后，得到单一菌株。
1.4 病原菌鉴定
1.4.1形态学鉴定 将孢子悬液接到PDA培养基上，25℃恒温培养2 d，分别使用激光共聚焦和光学显微镜观察孢子梗形态；
培养7 d，观察菌落形态、颜色及大小。
1.4.2 分子生物学鉴定 将病原菌接种到PDA上培养7 d，根据Edwards等［13］的CTAB法提取DNA，使 用 真 菌 通 用 引 物ITS1：5′-TCCGTA GGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′进行PCR扩增。PCR反应体系为：总体积为50μL，其中上下游引物各1μL，模板DNA1-2μL，1×TaqPCR Mix 46~47μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性10 s，53℃退火10 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃保温5 min。扩增产物由2%琼脂糖凝胶进行电泳。扩增片段由北京博迈德生物有限公司进行测序，将测得序列在NCBI中BLAST中搜索并进行同源性分析，利用MEGA 7.0软件采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建ITS系统发育树。
1.5 致病性检测
将健康党参用1%的次氯酸钠消毒3 min，用无菌水冲洗3次，洗去残留的次氯酸钠。配置1×106CFU/mL的孢子悬液，人工喷洒于新鲜健康党参表面，以喷洒无菌水作为对照，待其自然晾干后，在温度15℃、湿度50%RH的条件下装袋培养，观察其发病情况，并从发病部位对病原菌进行分离纯化，采用柯赫氏法则进行验证。
1.6 生物学特性
1.6.1 温度对病原菌生长及产孢量的影响 取2μL 1×106CFU/mL孢子悬浮液接种于PDA培养基上，然后置于温度为10、15、20、25、28、30、35℃的培养箱中恒温培养7 d，十字交叉法测菌落直径。分别加10 mL无菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加无菌水，稀释孢子悬浮液浓度至1×106CFU/mL，用血球计数板法测定产孢量。每处理3个重复。
1.6.2 致死温度 将1×106CFU/mL的孢子悬浮液分别在35、40、45、50、55、60、65℃下水浴加热10 min，接种2μL于PDA培养基上，培养7 d后，观察菌落生长情况，十字交叉法测菌落直径，并计算菌丝生长速率［14］，每处理3个重复。
1.6.3 光照对病原菌生长及产孢量的影响 接种2μL 1×106CFU/mL的孢子悬浮液于PDA培养基上，分别置于24 h黑暗、12 h光照12 h黑暗、24 h光照3个不同光照条件下，7 d后用十字交叉法测菌落直径。分别加10 mL无菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加无菌水，稀释孢子悬浮液浓度至1×106CFU/mL，用血球计数板法测定产孢量。每处理3次重复。
1.6.4 pH对病原菌生长及产孢量的影响 根据田守波等［15］的方法，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节PDA的pH值为4、5、6、7、8、9、10、11，在不同pH的PDA上接种2μL 1×106个/mL孢子悬浮液，25℃恒温培养7 d，用十字交叉法测菌落直径。分别加10 mL无菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加无菌水，稀释孢子悬浮液浓度至1×106CFU/mL，用血球计数板法测定产孢量。每处理3次重复。
1.6.5 碳源对病原菌生长及产孢量的影响 以察氏培养基为基础，将其中的蔗糖分别以麦芽糖、D-果糖、甘露醇、葡萄糖、β-环糊精等质量代替［16］，接种2μL 1×106CFU/mL的孢子悬浮液于不同培养基上，7 d后测量菌落直径。分别加10 mL无菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加无菌水，稀释孢子悬浮液浓度至1×106CFU/mL，用血球计数板法测定产孢量。每处理3次重复。
1.6.6 氮源对病原菌生长及产孢量的影响 以察氏培养基为基础，将其中的NaNO3分别以蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、硫酸铵、甘氨酸、尿素等质量代替［16］，接种2μL 1×106CFU/mL的孢子悬浮液于不同培养基上，7 d后测量菌落直径。分别加10 mL无菌水于上述PDA平板中，用涂布器刮取孢子，再加无菌水，稀释孢子悬浮液浓度至1×106CFU/mL，用血球计数板法测定产孢量。每处理3次重复。
1.7 病原菌代谢产生毒素分析
1.7.1 样品制备 将健康党参用1%的次氯酸钠消毒3 min，用无菌水冲洗3次，洗去残留的次氯酸钠。配置1×106CFU/mL的孢子悬浮液，人工喷洒于新鲜健康党参表面，待其自然晾干后，放入保鲜袋中培养（温度15℃、湿度50%RH），待其发病。
1.7.2 毒素提取 根据柳漆利等［17］方法进行修改。待其发病后，取病部组织切碎，置于研钵中，倒入液氮迅速研磨。取5 g上述样品于离心管中，加入20 mL乙酸乙酯（1∶1，V∶V）萃取，置于旋涡混合器涡旋3 min，放入高速冷冻离心机（5 000 r/min，4℃）中离心5 min，重复上述操作3次。收集3次上清液于圆底烧瓶中，在45℃旋转蒸发浓缩至干，用2 mL pH为4的乙酸复溶，经过0.22μm的有机滤膜过滤，最后用高效液相色谱进行测定。
1.7.3 毒素测定 根据《GB 5009.185-2016食品安全国家标准食品中展青霉素的测定》［18］稍作修改后进行测定。色谱条件［19］：色谱柱：C18反相柱（250 nm×4.6 nm×5μm）；
检测器：紫外检测器；
波长：276 nm；
流动相：乙腈∶水（1∶9，V∶V）；
流速：1.0 mL/min；
柱温：30℃；
进样量：20µL。
2.1 病原菌分离和致病性检测
通过组织分离法从发病的新鲜党参组织中分离纯化得到5株病原菌，其中1株菌的病情指数最高，为50%，命名为LBY-1。将其孢子悬浮液喷洒于健康的党参表面，在温度为15℃，湿度为50%RH的条件下装袋培养。发病初期，病斑表面会生出颗粒状霉斑，直径为2~3 mm，颜色为白色；
中期逐渐形成一簇簇菌落，表面覆有一层青色粉状物；
后期菌斑不断扩大蔓延，颜色变为灰绿色，病斑处组织软腐且霉味严重（图1-A），与自然发病症状（图1-B）相似。再从该发病党参上取病健交界处组织于PDA上培养，分离纯化，得到了相同的菌株。
2.2 形态学鉴定
通过单菌落纯化，得到的菌落在PDA平板上呈现灰绿色，菌落分散生长，菌落质地浓密有颗粒感（图2-A），背面呈白色，不产色素（图2-B）。分生孢子梗直立，有分隔，无色，顶端分支呈扫帚状（图2-C、2-D、2-E、2-F）。分生孢子串生，无色单孢，球形或扁球形，大小为（2.1~3.4）μm×（3.4~4.2）μm，分生孢子数量较多。根据形态学结果，初步鉴定为Peni⁃cillium expansum.
图1新鲜党参病害症状Figure 1 Symptoms of fresh Dangshen
图2 病原菌菌落形态、分生孢子梗形态Figure 2 Colony morphology、conidiophore and conidium of pathogen
2.3 分子生物学鉴定
扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，在500~600 bp得到一条清晰的条带，经测序分析，得知该序列的长度为587 bp（图3）。将该序列在NCBI中的BLAST进行搜索，得到100个同源序列，选取合适的序列，用MEGA7软件构建ITS系统发育树（图4）。由图4可见，病原菌LBY-1与DQ339556.1，KP204877.1，MT 872088.1在同一个分支上，且同源性为100%。因此，致病菌LBY-1被鉴定为Penicil⁃lium expansum.
图3 PCR扩增产物凝胶电泳图Figure 3 Gel electrophoresis image of PCR amplification product
图4 基于r DNA-ITS序列构建的系统发育树Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on rDNAITS sequence
2.4 生物学特性分析
2.4.1 温度对扩展青霉菌落生长和产孢的影响扩展青霉在10~30℃均能生长，温度为10℃时，菌落生长缓慢，菌落直径为14.75 mm，生长速率为2.11 mm/d；
温度为20℃时，菌丝生长较快，菌落直径为51.25 mm；
温度为25℃时，菌落直径达到最大为61 mm，生长速率为8.71 mm/d；
当温度到30℃时，菌丝生长变得缓慢，菌落直径为12 mm；
35℃时，菌落不生长。病原菌在10℃时不产孢，20℃时的产孢量为25℃时的一半，为4.28×106CFU/mL；
25℃时产孢量最高，为11.27×106CFU/mL；
30℃时，该病原菌不产孢（图5）。
图5 不同温度对菌落直径和产孢量的影响Figure 5 Effects of different temperatures on colony diameter and sporulation
2.4.2致死温度 将扩展青霉在35、40、45、50、55、60、65℃水浴加热，恒温处理10 min。该病原菌在35~60℃均能生长，60℃时，病原菌生长速率明显降低，生长速率为1.048 mm/d，在65℃时病原菌不能生长（图6），这表明65℃处理10 min可使该病原菌致死。
图6 致死温度的测定Figure 6 Determination of lethal temperature
2.4.3 光照对扩展青霉菌落生长和产孢的影响不同的光照条件对扩展青霉菌落生长和产孢有显著的影响。病原菌在24 h黑暗、12 h光照12 h黑暗、24 h光照3个不同光照条件下均能生长，24 h光照条件下的菌落生长最快，菌落直径为46.3 mm，12 h光照12 h黑暗条件下菌落生长次之，菌落直径为43.5 mm，24 h黑暗条件下的菌落直径最小，为39 mm。24 h光照条件下的产孢量最高，为6.78×106CFU/mL，24 h黑暗条件下病原菌产孢量最低，为2.6×106CFU/mL。这说明光照条件有利于病原菌菌落的生长及产孢（图7）。
图7 不同光照条件对菌落直径和产孢量的影响Figure 7 Effects of different light conditions on colony diameter and sporulation
2.4.4 pH对扩展青霉菌落生长和产孢的影响扩展青霉在pH 4~11时均能生长及产孢，说明该病原菌对pH的适应范围较宽。pH=7时，菌落直径最大，为28.3 mm，pH=6时，该病原菌产孢量最高，为4.55×106CFU/mL。偏酸或偏碱的环境一定程度抑制了病原菌的生长和产孢（图8）。
图8 不同p H对菌落直径和产孢量的影响Figure 8 Effects of different pH on colony diameter and sporulation
2.4.5碳源对扩展青霉菌落生长和产孢的影响 扩展青霉在以察氏培养基为基础的不同碳源的培养基上均能生长，碳源为葡萄糖时，菌落直径最大，平均为29.88 mm；
碳源为甘露醇时，菌落直径次之，平均为28.38 mm；
当碳源为D-果糖时，平均菌落直径为25.5 mm；
当碳源为麦芽糖和蔗糖时，二者的菌落直径相近，分别为24.5、24 mm；
当碳源为β-环糊精时，菌落直径最小，为19.25mm。该病原菌在6种碳源上均可以产孢，当碳源为β-环糊精时，产孢量最高，为4.97×106CFU/mL；
碳源为D-果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇时，产孢量分别为1.85×106、1.7×106、1.32×106、0.85×106CFU/mL；
碳源为葡萄糖时，产孢量最低，为0.67×106CFU/mL。由此可见，该病原菌在以葡萄糖为碳源时，菌落直径最大，产孢量反而最低；
反之，以β环糊精为碳源时，菌落直径最小，而产孢量却最高（图9）。
图9 不同碳源对菌落直径和产孢量的影响Figure 9 Effects of different carbon source on colony diameter and sporulation
2.4.6 氮源对扩展青霉菌落生长和产孢的影响
扩展青霉在以察氏培养基为基础的不同氮源条件下均能生长，氮源是蛋白胨时，其菌落直径最大为25.5 mm；
氮源是甘氨酸时，菌落直径次之，为24.83 mm；
氮源为酵母粉、硫酸铵、牛肉膏时，其菌落直径分别为21.5、20.5、20 mm；
氮源为尿素时，菌落直径最小，为10.5 mm。病原菌在这6种不同氮源条件下均能产孢，氮源为酵母粉时，产孢量最高，为1.17×106CFU/mL；
氮源为硫酸铵时，产孢量次之，为1×106CFU/mL；
而当氮源为尿素时，产孢量最小，为0.13×106CFU/mL。因此可见，当氮源为尿素时，既不适合该病原菌生长，也不适合产孢（图10）。
图10 不同氮源对菌落直径和产孢量的影响Figure 10 Effects of different nitrogen source on colony diameter and sporulation
2.5 病原菌毒素测定
通过液相色谱分析发现，在扩展青霉侵染党参致其发生青霉病的组织中，检测到了棒曲霉毒素的积累，其含量为1.75μg/g（图11）。
图11 棒曲霉素的液相色谱图Figure 11 Liquid chromatogram of patulin
本研究对甘肃岷县新鲜党参采后青霉病病害的致病菌进行分离纯化、致病性检测，并通过形态学和分子生物学技术进行分析，确定引起新鲜党参采后青霉病的主要致病菌为扩展青霉。目前对中草药病害致病菌有相关的研究报道，周默等［20］从内蒙古莫旗地区的黄芪根腐病中分离鉴定得到其主要致病菌有尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、锐顶镰刀菌和木贼镰刀菌；
张晶晶等［21］从东北地区的人参根腐病中分离鉴定出的主要致病菌为腐皮镰刀菌和尖孢镰刀菌；
陈燕萍等［22］从太子参酸腐病中分离鉴定出的主要致病菌为尖孢镰刀菌；
徐雪芬等［23］从党参根腐病中分离鉴定出的主要致病菌为茄镰孢菌和锐顶镰孢菌；
王艳等［1］从党参斑枯病中分离鉴定出的主要致病菌为党参壳针孢。这表明不同地区，不同种类、不同品种的中药材，引起病害发生的主要致病菌不同。而上述报道的病害主要发生在田间，对于新鲜中药材采后贮藏期间病害报道较少，陈娟等［6］从采后贮藏期间的当归饮片中分离出皮落青霉（Penicillium crus⁃tosum）、鲜绿青霉（P.viridicatum）和橘灰青霉（P.au⁃rantiogriseum），从党参饮片中分离出短密青霉（Penicillium brevicompactum）和橘灰青霉（P.auran⁃tiogriseum）等。然而，药材饮片与新鲜药材在原料上存在差异，同时上述研究未对分离出的病原菌进行系统的生物学特性与毒素积累的研究。
本试验通过扫描电镜和激光共聚焦显微镜对引起党参青霉病主要致病菌的分生孢子及分生孢子梗进行形态观察。分生孢子梗直立，无色，有分隔，顶端分支呈扫帚状。分生孢子串生，无色单孢，球形或扁球形，大小为（2.1~3.4）μm×（3.4~4.2）μm。魏景超［24］的真菌鉴定手册中描述的扩展青霉的分生孢子梗壁光滑或微粗糙，帚状；
分生孢子多，呈椭圆形，部分变亚球形，长径3~3.5μm，与本研究结果一致；
潘春青等［25］报道的正常的扩展青霉孢子呈球形或椭球形，表面粗糙，周边完整，也与本试验研究结果一致。由此表明，在甘肃岷县新鲜党参采后青霉病病害的主要致病菌为Penicillium expansum。
生物学特性试验表明，P.expansum菌落生长的最适温度为25℃、最适pH为7、产孢的最适温度为25℃、最适pH为6，65℃处理10 min可致死；
这与杨美华等［26］报道的在南京中医药大学生物制药教研室保藏的扩展青霉的生长特性相似，扩展青霉在25℃时，菌丝体生物量最高，为4.185 mg/L，pH=6时，其菌丝生物量最高，为3.986 mg/L。丁仁惠等［27］在柑橘采后青霉病主要病原菌的生物学特性研究中发现，指状青霉和意大利青霉的最适生长温度为28~30℃，最适生长pH为6~7，致死温度为75℃。本研究发现：24 h光照处理时，菌落直径最大，且产孢量最高，而24 h黑暗处理，菌落直径最小且产孢量最低，因此光照有利于菌落的生长及产孢；
在碳源试验中，葡萄糖利于菌落生长而不利于产孢，β-环糊精利于扩展青霉产孢，而不利于菌丝生长；
在氮源试验中，蛋白胨利于菌丝生长，酵母粉利于产孢，而尿素既不利于菌落生长又不利于产孢。该结果与郭东起等［28］从冬枣的青腐病中分离得到的橘青霉的生长特性类似，其最适生长pH为7~8，致死温度为75℃，硝酸盐类利于橘青霉生长繁殖，而铵盐有抑制作用，葡萄糖利于橘青霉的生长和产孢，光照利于橘青霉的菌落生长，而黑暗条件利于产孢。王帆等［29］对赭绿青霉生物学特性研究也发现，赭绿青霉的最适生长和产孢温度均为28℃，最适生长pH为6，最适产孢pH为7，最适的菌落生长碳源为麦芽糖，最适产孢碳源为葡萄糖，最适生长和产孢氮源均为蛋白胨。由此表明，不同宿主青霉病病害组织中分离得到的病原菌种类不同，病原菌的生物学特性也存在显著差异。甘肃岷县10月中下旬以后，降雨增多，湿度明显升高，非常容易引起新鲜党参青霉病的发生，且光照利于扩展青霉的生长和产孢，因此新鲜党参采后要低温、干燥、避光贮藏，这样可以适当减轻病害发生。
本研究中测定棒曲霉素时，标样的出峰位置在3.306 min（图11-A），试样的出峰位置在3.029 min（图11-B），出峰位置不能完全重合，其原因可能是中草药的基质效应［30］所导致，但不影响检测结果。本研究表明，青霉病党参组织中检测到棒曲霉素的积累。棒曲霉素是一种常见的真菌毒素，对人体、动物、植物、细菌等均有毒害作用，急性中毒主要影响和损伤消化系统、肝脏和肾脏等，长期接触会导致细胞损伤、肺充血、致畸、致癌等遗传毒性［31］。党参作为一种特殊植物，属于药食同源，其主要功效还是治疗病害，然而青霉病党参不仅不能有效治疗病害，可能还会危害患者的身心健康。
新鲜党参青霉病的主要致病菌为扩展青霉（Penicillium expansum），且它会代谢产生棒曲霉素。在25℃，pH 6~7，24 h光照时，适合菌丝生长且产孢；
最适生长碳源为葡萄糖，氮源为蛋白胨；
最适产孢碳源为β-环糊精，氮源为酵母粉；
65℃处理10 min可致死。本试验为新鲜党参的病害研究与防控以及其他中草药病害的研究与探索奠定了理论基础。
