苏黄止咳胶囊提取物多糖含量的测定方法研究
时间：2023-01-22 18:15:04 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李超 丰杰 郑悦 张海平 刘小清
苏黄止咳胶囊源于国医大师晁恩祥教授“风咳”理论名医名方[1]，是“风咳”证独家治疗药物，申请到了“风咳”适应症的专利，保护期为 20 年。是针对感冒后咳嗽和咳嗽变异性哮喘等亚急性、慢性咳嗽开发的独家产品，西医《咳嗽的诊断与治疗指南》（2021 版）[2]唯一推荐中成药。该药功效为疏风宣肺，止咳利咽，由九味中药材组成，采用中药提取与制剂工艺，对紫苏叶、前胡提取挥发油，麻黄、五味子采用乙醇提取有效成分，地龙等五味药材水提醇沉，制得浸膏减压干燥后得到干膏粉，与挥发油包合物、药用辅料混合制粒，整粒灌装后最终得到苏黄止咳胶囊。其中，地龙等五味药材水提醇沉，制得浸膏减压干燥后得到的干膏粉，因其富含多糖，具有很强的引湿性，直接影响制剂产品的质量，是中药硬胶囊剂普遍存在的顽疾[2-3]。为此，有必要建立提取物中多糖含量的检测方法，以增加制剂工艺过程控制，提升产品质量。本研究主要对苏黄止咳胶囊提取物中多糖的含量测定条件进行研究。通过查阅文献[3-5]，选用最常用的苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法进行方法开发，以D-无水葡萄糖为对照，采用紫外分光光度法，建立提取物中多糖的含量测定方法。
1.1 一般材料
1.1.1 仪器与试剂 UV-2550 型紫外分光光度计（岛津公司）；
XPE105 型电子天平（梅特勒-托利多）；
HHS-21-8 型水浴锅（常州诺基仪器有限公司）。
苏黄止咳胶囊（国药准字Z20103075，规格：45 g，生产单位：北京海燕药业有限公司）提取物由北京海燕药业有限公司自制；
无水乙醇、浓硫酸、苯酚、蒽酮等均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供；
D-无水葡萄糖，由中国食品药品检定研究院提供，纯度99.8%。
1.1.2 供试液的配制 精密称取苏黄止咳胶囊提取物，研细混匀，取约10 mg，至100 mL 容量瓶中，加入70.0%乙醇溶液定容至刻度，摇匀。精密量取5 mL，至200 mL 容量瓶中，纯化水定容至刻度，摇匀，即得。
1.1.3 对照品溶液的配制 精密称取D-无水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，纯化水定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液储备液。
1.2 方法
多糖的含量测定方法主要分两大类：一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法；
另一类是直接测定多糖，如气相色谱法和高效液相色谱等。中药材多糖种类繁多，分子量大，结构复杂，这给直接测定多糖增加了难度。
故采用多糖的单糖缩合反应建立苏黄止咳胶囊提取物中多糖的测定方法，利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质来测定，即苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，故苯酚-硫酸法在紫外490 nm 处有最大吸收，蒽酮-硫酸法在紫外620 nm 处有最大吸收[6-8]。
1.2.1 苯酚-硫酸法显色及测定条件的选择
1.2.1.1 浓硫酸加入量考察 量取供试液2 mL 至试管中，加入4% 苯酚溶液1 mL，选择加入浓硫酸体积5、7、9 mL，各制备5 份样品，摇匀，至100℃水浴中加热30 min，冰浴5 min 后冷却至室温。取适量倒入比色皿中，于490 nm波长下测定样品溶液中多糖的吸光度。结果显示，反应后样品溶液的吸光度RSD 值分别为3.1%、2.1%、4.8%，优选浓硫酸加入体积为7 mL。
1.2.1.2 冰浴时间考察 量取供试液2 mL 至试管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 浓硫酸，摇匀，至100℃水浴中加热30 min，选择不同的冰浴时间3、5、10 min 后，冷却至室温。取适量倒入比色皿中，于490 nm 波长下测定样品溶液中多糖的吸光度。结果显示，反应后样品溶液的吸光度RSD 值分别为1.36%、0.89%、1.65%，故冰浴时间确定为5 min。
1.2.1.3 水浴温度的考察 量取供试液2 mL 至试管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 浓硫酸，摇匀，至水浴中加热，分别设置水浴温度40、80、100℃，时间30 min，冰浴5 min 后冷却至室温。取适量倒入比色皿中，于490 nm 波长下测定样品溶液中多糖的吸光度，考察15 min 内样品的稳定性。结果显示，水浴温度为100℃时，反应后样品溶液的吸光度RSD 值分别为2.1%、0.158%、0.155%，故水浴温度确定为100℃。
1.2.1.4 确定最佳显色条件 量取供试液2 mL 至试管中，加入4%苯酚溶液1 mL，加入7 mL 浓硫酸，摇匀，至水浴温度100℃条件下加热30 min，冰浴5 min 后冷却至室温。在15 min 内，取适量倒入比色皿中，于490 nm 波长下测定样品溶液中多糖的吸光度。
1.2.1.5 D-无水葡萄糖标准曲线的制作 精密称取D-无水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀，作为储备液。量取储备液1、2、3、4、5 分别至50 mL 容量瓶中，用纯化水定容至刻度即得5 个不同浓度的D-无水葡萄糖标准溶液。然后分别吸取2 mL D-无水葡萄糖标准溶液至试管中，加入4% 苯酚溶液1 mL，加入7 mL 浓硫酸，摇匀，至100℃水浴中加热30 min，冰浴5 min 后冷却至室温。另取纯化水2 mL，操作同上，加苯酚硫酸进行显色反应，作为空白对照。分别取适量倒入比色皿中，于 490 nm 处测定上述溶液吸光度值，以D-无水葡萄糖浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制D-无水葡萄糖标准曲线，并得出D-无水葡萄糖标准曲线的回归方程：y=0.1323x+0.1347，相关系数R2=0.9913，D-无水葡萄糖质量浓度在3.261～16.303 μg/mL 范围内与吸光值之间呈良好的线性关系，符合郎伯-比尔定律。
1.2.2 蒽酮-硫酸法显色及测定条件的选择
1.2.2.1 蒽酮-硫酸溶液用量的确定 取供试品溶液2 mL，置于试管中，同时以2 mL 纯化水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4、5 和6 mL，各制备5 份样品，摇匀，混匀后沸水浴中显色15 min，迅速置于冰水中冷却。待冷却至室温，取适量倒入比色皿中，在620 nm 处测定反应产物的吸光值。结果显示，反应后溶液的吸光度RSD 值分别为3.1%、4.3%、4.8%，优选浓硫酸加入体积为4 mL。
1.2.2.2 水浴温度的考察 取供试品溶液2 mL，置于试管中，同时以2 mL 纯化水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，摇匀，混匀后分别置于80、90 和100℃水浴中显色15 min，迅速置于冰水中冷却。待冷却至室温，取适量倒入比色皿中，在620 nm 处测定反应产物的吸光值。结果显示，反应后溶液的吸光度RSD 值分别为1.12%、0.56%、0.17%。即水浴温度为100℃时，样品吸光度RSD 值最小，优选水浴温度100℃。
1.2.2.3 水浴时间的考察 取供试品溶液2 mL，置于试管中，同时以2 mL 纯化水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL 摇匀，混匀后在100℃的沸水浴中分别显色10、15、20 min，迅速置于冰水中冷却。待冷却至室温，取适量倒入比色皿中，在620 nm 处测定反应产物的吸光值。结果显示，反应后溶液的吸光度RSD 值分别为3.10%、2.46%、5.07%，即水浴时间为15 min 时，样品吸光度RSD 值最小，优选水浴时间为15 min。
1.2.2.4 确定最佳显色条件 取供试品溶液2 mL，置于试管中，同时以2 mL 纯化水作为空白，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，摇匀，混匀后在100℃的沸水浴中显色15 min，迅速置于冰水中冷却。待冷却至室温，取适量倒入比色皿中，在620 nm 处测定反应产物的吸光值。
1.2.3.5 D-无水葡萄糖标准曲线的制作 精密称取D-无水葡萄糖40 mg，至50 mL 容量瓶中，加纯化水定容至刻度，摇匀，作为储备液。量取储备液1、2、3、4、5 分别至50 mL 容量瓶中，用纯化水定容至刻度，即得5 个不同浓度的D-无水葡萄糖标准溶液。然后分别吸取2 mL D-无水葡萄糖标准溶液至试管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，摇匀，至100℃水浴中加热15 min，迅速置于冰水中冷却。待冷却至室温，取适量倒入比色皿中。另取纯化水2 mL，操作同上，作为空白对照。分别于620 nm 处测定上述溶液的吸光度值，以D-无水葡萄糖浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标，绘制D-无水葡萄糖标准曲线，并得出标准曲线的回归方程：y=0.0 487x-0.0 082,相关系数R2=0.9 897，D-无水葡萄糖质量浓度在4.127～18.219 μg/mL范围内与吸光值之间呈良好的线性关系，符合郎伯—比尔定律。
实验数据显示，线性方面，苯酚-硫酸法线性相关性优于蒽酮-硫酸法，苯酚-硫酸法的精密度更高，方法更可靠。测量准确度方面，蒽酮-硫酸法的检测结果略高于苯酚-硫酸法，蒽酮-硫酸法可能与供试品中非糖物质发生了缩合反应，影响了测量精度。为确保苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量的稳定、可靠。最终选用苯酚-硫酸法作为苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量的测定方法，并开展了重复性、精密度、稳定性的方法研究[9-11]。
2.1 重复性
取同一份供试品，按照1.1.2 项下供试液配制方法，平行制备6 份供试品溶液，按照1.2.1.4 项下的最佳显色条件测定吸光值，6 份供试品溶液中多糖含量的RSD 为1.5%，小于2.0%的接受标准，说明苯酚-硫酸法测定苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量的方法重复性良好。
2.2 精密度试验结果
取同一份供试品，按照1.1.2 项下的供试液配制方法，平行制备6 份供试品溶液，按照1.2.1.4 项下的最佳显色条件测定吸光值，6 份供试品中多糖含量的RSD 为0.7%，小于2.0%的接收标准，说明仪器的精密度良好。
2.3 中间精密度试验结果
取与精密度实验相同的供试品，另一实验员按照1.1.2 项下的供试液配制方法，平行制备6 份供试品溶液，按照1.2.1.4项下的最佳显色条件测定吸光值。两名实验员12 份样品中多糖含量的RSD 为1.7%，小于2.0%的接收标准，说明中间精密度良好。
2.4 稳定性试验结果
按照1.1.2 项下的供试液配制方法，配制一份供试液，按照1.2.1.4 项下的最佳显色条件，每隔10 min 测定一次供试液的吸光度，1 h 内连续检测供试品溶液中多糖的含量，多糖含量的RSD 为0.3%，小于2.0% 的接受标准，说明苯酚-硫酸法测定苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量的方法稳定性良好。
试验结果显示，苯酚-硫酸法测定苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量的方法，精密度良好，重复性良好，方法的中间精密度良好，显色反应后1 h 内稳定性良好。供试品溶液中多糖含量的RSD 小于2.0%。
通过查阅文献，发现苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法是常用测定多糖含量的方法，方法简单、快速易推广[12-14]。实验时，苯酚-硫酸法基本不受检测过程中可能存在的蛋白质影响，先加入苯酚试剂，再加入浓硫酸，浓硫酸的加入触发反应进行，反应完成生成稳定的化合物，故精密度、准确度、反应稳定性较好。但由于分次加入试剂，可能加入一致性略有差异，重复性略有降低。蒽酮-硫酸法测出的是溶液中全部可溶性碳水化合物总量，回收率略高；
此外，因为一次性加入蒽酮试剂，故反应起点准确，重复性较好。大量文献显示，针对不同的研究对象、实验研究结果略有不同。
本研究以苏黄止咳胶囊提取物多糖含量测定作为研究对像，分别采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法进行多糖含量检测，得出了苯酚-硫酸法与蒽酮-硫酸法的最佳显色条件。苯酚-硫酸法测定苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量的最佳显色条件为：移液管量取供试液2 mL 滴入试管中，加入4%的苯酚溶液1 mL，随后加入7 mL 浓硫酸，充分摇匀，放置至100℃水浴中加热30 min，冰浴5 min 后冷却至室温。待冷却至室温，取适量倒入比色皿中，于490 nm 波长下测定样品溶液的吸光度。蒽酮-硫酸法测定提取物中多糖含量的最佳显色条件为：移液管量取供试品溶液2 mL 滴入试管中，冰水浴中加入0.5%蒽酮-硫酸溶液4 mL，摇匀，将混合溶液放置至100℃水浴中显色15 min，然后将混合溶液迅速置于冰水中冷却，待冷却至室温，取适量倒入比色皿中，在620 nm 处测定样品溶液的吸光度[9-11]。
实验结果显示，苯酚-硫酸法制作的标准曲线线性关系较好[15]，检测结果精密度高，方法准确度较好，控制硫酸加入量、反应环境等，可以实现方法的高重复性和稳定性。故苯酚-硫酸法可作为苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量测定的首选方法，方法稳定、可靠、简单、易于操作。
本文建立的苏黄止咳胶囊提取物中多糖含量测定方法，有效监控中药提取物中多糖吸湿物质的含量，为苏黄止咳胶囊提取物中间产品控制提供了监测方法和控制指标，有利于提升制剂产品质量，减少内容物吸湿性问题，减少胶囊壳易脆碎问题，提升产品顾客满意度。为其他中药提取物制定中间产品控制标准提供了手段和思路。
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