响应曲面法优化小叶红叶藤挥发油包合物的制备工艺及评价*
时间：2023-01-22 17:05:05 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
袁彩英，刘本涛，黄嘉咏，严振硕，谢长江，霍丽妮，陈 睿，2△
1 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；
2 广西中医药大学赛恩斯新医药学院
小叶红叶藤（Rourea microphylla）是牛栓藤科红叶藤属攀援灌木，主要分布在福建和广西等地，其茎叶具有清热解毒、消肿止痛等功效。其所特含的香气使之成为广西壮族人民喜爱的保健茶饮［1］。小叶红叶藤主要含有蒽醌类、黄酮类、甾体、脂肪酸类、萜类及香豆素类等化学成分［2-3］。目前，对小叶红叶藤的研究处于初步探索阶段，本课题组已完成对小叶红叶藤挥发油的化学成分分析及抗氧化活性的初步研究［1］。由于小叶红叶藤挥发油的溶解性及稳定性较差，因此，在探索其药理活性时遇到了一定阻碍。
研究表明，很多挥发油类物质具有抗肿瘤［4］、抗病毒和抗菌［5］、抗抑郁［6］、抗氧化［7］等功效。因其化学性质不稳定，水溶性欠佳，临床应用多为直接溶解喷洒或加入一定增溶剂以制备成各种制剂，但仍存在稳定性欠佳，难以长时间保存等问题［8］。β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）是被制药行业广泛应用的药用辅料，其疏水空腔能通过主-客体的作用力对亲脂性物质实现包合，在掩盖不良异味的同时能增加亲脂性物质的溶解性及稳定性，从而提高生物利用度［9］。本实验利用β-CD 制备小叶红叶藤挥发油的包合物，与传统正交实验对比，运用响应曲面法从统计学角度出发，能更有效地确定最佳包合条件，进而改善其挥发油的溶解性和稳定性，提高生物利用度。本研究通过显微鉴定法、薄层色谱法、紫外分光光度法及红外光谱分析法对挥发油包合物进行鉴定，从而更直观地观察包合物的形成，评价包合物的包合效果，最终为小叶红叶藤的进一步开发利用提供理论依据。
1.1 药物与试剂小叶红叶藤购于广西德保县，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为Rourea microphylla；
无水乙醇（成都科隆化学品有限公司）；
无水硫酸钠（天津博迪化工股份有限公司）；
溴化钾、香草醛、β-CD（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。
1.2 仪器98-1-C 型数字控温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；
BSA2245 型电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；
KQ-500DB 型数控超声波清洗器（昆山市舒美超声仪器有限公司）；
2X15-3 型恒温磁力搅拌器（上海思乐仪器有限公司）；
UV-2600 型紫外分光光度计（岛津仪器苏州有限公司）；
BX53 型荧光正置显微镜（日本OLYMPUS）；
iS10型红外光谱仪（美国NICOLET）。
1.3 方法
1.3.1 小叶红叶藤挥发油提取［10］称取适量小叶红叶藤干燥茎叶，剪碎，加入10 倍量纯水浸泡1 h。根据2015年版《中华人民共和国药典》四部通则2204挥发油测定法中的甲法，提取至挥发油油量不再增加，停止加热后静置1 h 以上并收集挥发油，加入适量无水硫酸钠干燥，4 ℃下保存备用。
1.3.2 包合方法的选择
1.3.2.1 饱和水溶液法 准确称取β-CD 8.00 g置于圆底烧瓶中，加入10 倍量超纯水，加热使之成为饱和水溶液。转移至恒温搅拌器中，缓慢滴入1 mL 挥发油（挥发油和无水乙醇等比例混合），保持400 r/min，50 ℃反应2 h。冷却至室温，于4 ℃下冷藏24 h，抽滤，用适量超纯水（约30 mL，10 mL/次）洗涤包合物表面未包合的环糊精，40 ℃真空干燥至恒重［11-12］。
1.3.2.2 超声法 准确称取β-CD 8.00 g 置于圆底烧瓶中，加入10 倍量超纯水，加热使之成为饱和水溶液。转移至超声波清洗器上进行超声，缓慢滴入1 mL 挥发油，50 ℃下超声2 h，其余操作同“1.3.2.1”项下“冷却至室温”起。
1.3.2.3 研磨法 准确称取β-CD 8.00 g 置于圆底烧瓶中，加入适当超纯水，研磨成团状，缓慢滴入1 mL 挥发油，研磨2 h，其余操作同“1.3.2.1”项下“冷却至室温”起。
1.3.2.4 包合效果评价指标及方法 包合物收率：准确称量上述方法得到的包合物质量，计算包合物收率。包合物收率（%）=包合物质量/（环糊精质量+挥发油质量）×100%。
空白回收率测定：用移液枪精密量取1.000 mL挥发油，加入适量β-CD，同挥发油测定方法一致，读取挥发油体积，计算空白回收率［13］。重复实验3 次，取其平均值。空白回收率（%）=收集的挥发油量/挥发油投入量×100%。
包合率的测定：精密称取上述包合物适量，置于圆底烧瓶中，加入500 mL 超纯水，连接挥发油提取器，置电热套中加热，保持微沸状态至挥发油油量不再增加，读取挥发油体积，计算挥发油包合率［13］。挥发油包合率（%）=包合物中挥发油量/（挥发油投入量×空白回收率）×100%。
1.3.3 包合条件的优化
1.3.3.1 单因素试验 以小叶红叶藤挥发油包合物收率及包合率为测定指标，计算综合评分。综合评分=（挥发油包合率/挥发油包合率最高值）×60+（包合物收率/包合物收率最高值）×40［14-15］。采用单因素试验分别考察β-CD和小叶红叶藤挥发油的投料比（6，8，10，12，14）、包合时间（1、2、3、4、5 h）、包合温度（30、40、50、60、70 ℃）对挥发油包合物制备的影响。
1.3.3.2 响应面法对包合条件的优化设计 基于单因素试验基础，以挥发油包合率和包合物收率的综合评分为考察指标，以投料比（A）、包合温度（B）、包合时间（C）为考察因素。根据Box-Behnken 响应曲面的设计原理，设置3 因素3 水平进行试验，见表1。
表1 实验因素水平
1.4 最佳包合工艺的验证和表征
1.4.1 最优工艺条件验证 为验证预测结果的准确性，验证预测的最佳工艺条件，实验重复3次，计算综合评分，比较实测值和预测值，计算偏差值。偏差=（实测值-预测值）/预测值。
1.4.2 包合物表征 显微鉴别法［16］：取β-CD（A）、β-CD 与挥发油的物理混合物（B）、包合物（C）适量，分别置于载玻片上，滴加少量纯水，使其均匀分散，盖好盖玻片，显微镜下（×100）观察形态。
薄层色谱法［17］（TLC）：适当修改文献方法，称取适量β-CD 于离心管中，加入1 mL 无水乙醇，超声15 min，离心后取上清液，得样品I；
用移液枪准确移取100 μL小叶红叶藤挥发油，用无水乙醇等比例稀释，得样品Ⅱ；
取适量包合物置于挥发油提取器中，重新提取包合物中的挥发油，用样品Ⅱ处理方法处理，得样品Ⅲ；
将小叶红叶藤挥发油和β-CD进行物理混合，加入5 mL无水乙醇，与样品I处理方式处理，得样品Ⅳ；
将包合物与样品I 处理方法一致，得样品Ⅴ。用毛细管分别吸取上述样品溶液，在硅胶G 薄层板点样，置于乙酸乙酯和石油醚按1∶4 的体积比展开，晾干后用5%香草醛硫酸溶液喷雾显色，置于105 ℃干燥箱中烘干至显色清晰。
紫外分光光度计法［18］（UV）：分别取适量β-CD、挥发油、挥发油和β-CD 物理混合物和包合物，加入5 mL 无水乙醇，得样品Ⅰ～Ⅳ。采用紫外分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描。
红外光谱法［19］（IR）：将β-CD、挥发油和β-CD的物理混合物和包合物采用KBr压片后分别作为样品Ⅰ～Ⅲ；
用移液枪量取小叶红叶藤挥发油10 μL直接滴加在KBr压片上作为样品Ⅳ，采用溴化钾压片法测定各样品在4 000～400 cm处的红外吸收光谱。
1.5 统计学方法利用Design-Expert 8.0.6软件设计实验，以综合评分进行回归方程拟合及方差分析，判断数据的差异是否具有统计学意义。
2.1 挥发油空白回收率挥发油的平均空白回收率为95%，其RSD 为1.82%。说明β-CD 对挥发油具有一定吸附能力，但影响较小。见表2。
表2 挥发油空白回收率
2.2 包合方法选择结果显示，饱和水溶液法、超声法、研磨法的包合率分别为84.21%、73.68%、63.16%。表明饱和水溶液法和超声法的包合效果较好。因饱和水溶液法操作简单易行，故选择此法作为包合方法。
2.3 单因素试验通过测定挥发油包合率和包合物收率，计算综合评分。
1）当投料比过低时，β-CD 不足以包合完全挥发油，导致包合效果低。随着投料比的增高，包合效果增加。但当比例过高时β-CD 形成聚合物进而阻碍挥发油进入空腔内，从而影响包合率和包合物收率。2）随着包合温度的升高，包和效果出现先增高后降低情况。在温度适宜情况下，主客体分子间能形成稳定包合物，过低温度使分子运动迟缓，包合效果不佳，过高温度可能导致分子运动加快，造成包合物脱包现象，且温度过高，挥发油容易挥发，一定程度上造成损失。3）包合效果一定程度上随着包合时间的增加而逐渐增大，挥发油作为客体分子，随着反应时间的延长进入到β-CD 的空腔内以分子间氢键结合更紧密，最终形成包合物。当反应时间达到一定时，其包合效果趋于稳定。见图1。
图1 单因素试验结果
为进一步考察最优的包合工艺，选择投料比为8、10、12 g/mL；
包合温度为40、50、60 ℃；
包合时间为1、2、3 h进行响应曲面实验。
2.4 响应曲面包合条件优化响应曲面法作为一种优化生物过程的统计学试验设计，可以帮助确定最佳水平范围，减少试验组数以减少成本［20-21］。基于单因素试验结果，根据Box-Behnken Design（BBD）设计模型试验方案进行响应曲面试验。利用Design-Expert8.0.6 软件，进行多因素回归拟合，建立二次项回归模型方程，得到方程：综合评分=94.30+3.76A+3.73B+0.45C+0.78AB-5.97AC+1.36BC-3A2-7.31B2-8.62C2。见表3。
表3 响应曲面试验设计及结果
二次回归方程的方差分析结果显示该模型对小叶红叶藤会挥发油包合效果的影响极显著，失拟项P=0.0548，R2=0.9613，C.V.%为2.82，RAdj2=0.9116，说明该模型拟合效果较好，试验误差较小，说明该回归方程对真实值反映较好，该试验具有较高的可信度及准确性。见表4。
表4 回归模型方差分析
方差分析结果显示，一次项中的B、C，二次项中B2、C2和交互项中AC 表现为极显著（P＜0.01）。说明投料比和包合温度为影响包合效果的主要因素，包合时间对包合效果影响无统计学意义。响应面曲面图可直观反映不同因素交互作用的影响，可见各因素对包合效果的影响程度为：物料比（A）＞包合温度（B）＞包合时间（C）。见图2。
图2 两两因素交互作用对综合评分影响的响应曲面图
2.5 最佳包合工艺验证按最佳工艺重复试验3 次，综合评分依次为95.20、96.46、96.67 分，平均综合评分为96.11 分，响应曲面预测的综合评分为96.63 分，预测值偏差率为-1.48%、-0.18%、0.04%，证明该模型能较好反映各因素与评价指标的关系。
2.6 包合物表征
2.6.1 显微鉴定法β-CD（A）、β-CD 与挥发油的物理混合物（B）和包合物（C）的显微成像图显示：β-CD 为无色透明的块状颗粒，粒度边缘清晰、体积较大。β-CD 与挥发油的物理混合物，可见部分挥发油附着在β-CD 上，使其整体透明度变低。包合物为不透明黑色团状物质，包合物中可见粒度小颗粒状物质，应为未包合的β-CD碎片。包合前后物质形态发生改变，表明包合物新物相形成。见图3。
图3 包合物表征电子显微成像图（×100）
2.6.2 薄层色谱法 样品Ⅱ、样品Ⅲ和样品Ⅳ在近似位置出现了相同斑点，且Rf 值基本一致。样品Ⅰ和样品Ⅴ中没有出现斑点，说明小叶红叶藤挥发油包合物已形成，且无或极少量挥发油存在。样品Ⅱ和样品Ⅲ表明小叶红叶藤包合前后挥发油的主要成分变化不大，包合效果较好。见图4。
图4 各样品的薄层色谱图
2.6.3 紫外分光光度计法 小叶红叶藤挥发油（样品Ⅱ）与物理混合物（样品Ⅲ）的紫外吸收图谱相似，而包合物（样品Ⅳ）的紫外吸收与β-环糊精（样品Ⅰ）相似，但与样品Ⅱ、Ⅲ的紫外吸收明显不同，在306 nm处的吸收被遮掩，在250～300 nm处的紫外吸收明显减弱，表明小叶红叶藤挥发油进入空腔内，形成稳定的包合物。见图5。
图5 各样品的紫外分光光度图谱
2.6.4 红外光谱法 物理混合物与β-CD 的红外吸收图谱相似，但其在2295、2926、2870、1171 cm处有较强吸收峰，表现为挥发油相同的吸收峰，说明物理混合物红外图谱是β-CD 和挥发油图谱的叠加。包合物与β-CD 的吸收峰较为相似，包合物中未见挥发油特征吸收峰，表明包合完成。各样品的红外吸收图谱见图6。
图6 各样品的红外吸收图谱
本研究利用响应曲面法建立了小叶红叶藤挥发油包合物的二次多项回归方程，方程拟合性较好。该方法在中药成分如挥发油、多糖的提取［22-23］、药物处方设计［24］、化工［25］、生物发酵［26］等多领域均有应用。在考察的包合条件中发现，β-CD和挥发油的投料比和包合温度对小叶红叶藤挥发油包合物制备的影响较大，投料比和包合温度具有极显著交互作用。优化后的最佳包合工艺为β-环糊精和挥发油投料比为11.88 g/mL，包合温度为52.8 ℃，包合时间为1.72 h，综合评分为96.53 分，包合物的预测值和理论值偏差较小，表明响应曲面法设计结果在挥发油包合物制备工艺优化中的重要作用。
通过对小叶红叶藤挥发油包合物的表征，直观反应包合后的物质状态。本研究结果显示，小叶红叶藤挥发油和β-CD 包合物是一种新物相，并非直接物理混合后的结果。同时，通过饱和水溶液法制备的包合物，其原本的挥发油气味被掩盖，溶解度和稳定性得到较大改善，方便了制剂成型。挥发油经过包合后其释放速度降低，可以用于制备缓释剂型，延长作用时间，更好满足实际用药的需求。对制得小叶红叶藤挥发油包合物仍需对其药理活性以及挥发油包合前后活性的差异做进一步探讨。
猜你喜欢 包合物投料挥发油 升血小板胶囊中连翘挥发油包合工艺研究陕西中医药大学学报(2022年2期)2022-04-08吨包拆袋投料站的创新设计与应用粮食加工(2022年1期)2022-03-23浮法玻璃生产线斜毯式投料机在线检修实践玻璃(2022年1期)2022-02-23金属离子/环糊精包合物在潜血指纹显现中的应用纺织科技进展(2021年3期)2021-06-09安徽产薄荷挥发油提取工艺优化研究湖北农业科学(2021年8期)2021-05-11响应面法优化水蒸气蒸馏提取牡丹根皮挥发油工艺＊科技与创新(2020年4期)2020-03-12雷公藤内酯酮与2，6-二甲基-β-环糊精包合物的制备及性能研究分析化学(2019年8期)2019-09-19智能投料机远程监控系统①计算机系统应用(2017年5期)2017-06-07芦丁-二甲基-β-环糊精包合物的制备、物理化学表征及体外溶出研究药学研究(2015年11期)2015-12-19水蒸气蒸馏法提取云木香中的挥发油山东工业技术(2015年3期)2015-07-26
