快速热激处理对甘薯愈伤层形成及代谢的影响

辛 奇，孙 洁，冯欣欣，赵泽众，刘帮迪,*，江丽华，郝光飞

（1.农业农村部规划设计研究院，北京 100125；
2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056038；
3.农业农村部产地初加工重点实验室，北京 100121）

甘薯（Ipomone batatasL.）又名甜薯，具有易种植、产量高的特性，是我国粮食作物的重要组成部分[1]。甘薯是一种块根类作物，具有块根表皮薄、含水量高、组织易损伤的特点，在机械化或人工的采收、采后过程中极易造成表皮损伤，导致其在贮藏运输中出现呼吸作用增强以及营养物质消耗和外源微生物侵染可能性增加的问题，从而引起甘薯块根快速腐烂和经济价值降低[2-3]。甘薯块根受损伤胁迫后体内自我防御系统受伤信号传导，快速启动自我修复功能，可在损伤部位重新形成愈伤组织使伤口完全愈合[4]。但自然状态下甘薯块根伤口自我愈合的时间较长，且自然愈伤易受天气条件影响，管理成本高，处理不当还会造成块根的大面积腐烂。为促进甘薯伤口的快速愈合，理论研究和实际生产中越来越多地采用人工处理条件进行愈伤。有研究报道，通过外源施加农药、激素或含硫化合物等化学药物能促进果蔬愈伤相关代谢途径，加速损伤组织愈合[5-6]，但化学药物残留及环境污染的问题一直受到质疑。因此，亟待开发一种安全、高效的采后甘薯愈伤方法。

热处理是将采后果蔬置于非致死高温条件下进行短时处理，通过高温处理杀死病原微生物或抑制其活动，激活果蔬组织内相关酶，从而促进果蔬抗性物质积累使伤口快速愈合的一种物理保鲜方法[7]。热激处理不仅能有效激发活性氧代谢途径，诱导抗氧化酶活性升高，催化参与愈伤过程中酚类物质与芳香类物质的氧化交联[8]，还能有效提高苯丙烷代谢途径中关键酶活性，促进木质素、酚类和脂肪酸类等愈伤进程所需成分的积累，加速形成愈伤木栓层，从而提高果蔬的抗性，减少腐烂的发生[9-11]。目前国内外对于果蔬愈伤技术的研究主要集中在马铃薯上，如韩占红等[12]将‘陇薯7号’马铃薯块茎置于常温（20～25 ℃）、相对湿度70%～80%黑暗环境中愈伤，发现愈伤期间马铃薯块茎伤口处苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）和过氧化物酶（peroxidase，POD）活性始终高于未愈伤处理组，木质素、总酚和部分单体酚不断积累；
对伤口处组织进行观察发现，有明显的木质素、软木脂及酚类等愈伤成分沉积。宋若茗等[13]指出，国内外关于甘薯的专业愈伤技术研究十分匮乏，新型技术研究较少且推广力度不够。根据对山东、河北、福建等我国甘薯主产区进行实地调研和美国甘薯产业文献[6]调研情况分析发现，目前甘薯采后最主要应用的愈伤技术是整库（窖）加热封闭愈伤，具体条件为（35±2）℃处理2～7 d，并且在整库（窖）甘薯愈伤期间不开启库门。该愈伤处理技术虽然可以减少部分采后病害和损失，但是存在愈伤均一性较差、愈伤效率极低、愈伤效果不可控、热能大量浪费和不满足小批量处理需求等问题，亟待开发新型甘薯愈伤技术解决上述问题。

因此，为了满足甘薯产业中小批量生产、连续作业、处理效果均一、低碳环保等需求，本研究在前期研究基础上，提出一种专用于甘薯的较高温度、更短时间的热刺激愈伤处理方式——快速热激处理（rapid heat treatment，RHT），并探讨RHT对甘薯块根愈伤组织形成的影响，观察块根伤口处木质素和软木脂沉积情况，分析愈伤木栓层形成相关的活性氧代谢和苯丙烷代谢变化，以期为采后甘薯块根的快速愈伤提供理论依据。

1.1 材料与试剂

供试‘大叶红’甘薯于2019年7月16日购于福建漳州禾谷鸟生态农业科技有限公司，单果套袋后装箱（20个/箱），第2天运抵农业农村部农产品产后处理重点实验室（北京）。挑选外观整齐、大小均匀（（250±50）g）、无损伤且无病虫害的新鲜甘薯作为实验材料。

过氧化氢测定试剂盒、羟自由基测定试剂盒、抑制与产生超氧阴离子自由基测试盒 南京建成生物工程研究所有限公司；
羟胺盐酸、正己烷、冰乙酸 北京化工厂；
L-苯丙氨酸 国药集团化学试剂有限公司；
其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DM500显微镜 德国徕卡公司；
UV-1800P型紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；
HH-2A电热恒温水浴锅 北京科伟永兴仪器有限公司；
TGL-16gR高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；
101型电热鼓风干燥箱 北京中兴伟业仪器有限公司；
LAC-350HPY-2人工气候箱 上海龙跃仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 甘薯块根人工损伤与热激处理

将新鲜甘薯块根用清水温和洗涤2 次，用蒸馏水冲洗干净，晾干备用。不锈钢刀和打孔器（直径为15 mm）经体积分数95%乙醇溶液擦拭消毒后，先利用打孔器在每个甘薯上做圆形标记，再用不锈钢刀沿打孔器标记处对甘薯表皮切出直径为15 mm、深度为3 mm的伤口，每个甘薯分上中下随机取6 处伤口。

实验设置3个组，分别是快速热激愈伤处理组（RHT）、传统窖藏式长时间低温度热激处理组（阳性对照，CK+）和不热激处理组（阴性对照，CK-）。RHT方式和条件为本课题组前期研究优化所得结果[14]，CK+热激处理条件、方式为本课题组前期调研结果[14-15]，具体条件和其他参数[14,16]如表1所示。由于植物愈伤是一个长时间的过程，为完整地观察愈伤情况和差异，将甘薯热激之后贮藏于（13±1）℃和相对湿度（80±5）%条件下，设定热处理和贮藏时间共为7 d。

表1 热激实验设计和相关参数Table 1 Experimental design and parameters of heat treatments

分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7 d取样，取样时先用不锈钢刀切取甘薯块根创伤部位和其下（2.0±0.5）mm处的愈伤组织，一部分用于木质素和软木脂沉积情况观察。剩余样品则立即用液氮冷冻粉碎，混匀后封于自封袋中，在（-80.0±0.2）℃超低温冰箱中冷冻保存，以备各项指标测定。每组处理用甘薯100个，重复3 次。

1.3.2 甘薯形成愈伤后伤口处木质素积累和软木脂积累情况观察

木质素沉积情况观察参照Alba等[17]的方法并作修改，采用双面不锈钢刀片将上述已取下的愈伤组织切成0.2～0.3 mm厚薄片，浸泡于蒸馏水中，按照以下步骤进行木质素染色：取切好的薄片，置于载玻片上，先滴加质量分数1%的间苯三酚溶液，立即滴加浓盐酸染色1 min，盖上盖玻片置于光学显微镜下观察并拍照。

软木脂沉积情况观察参照Lulai等[18]的方法并作修改，采用双面不锈钢刀片将上述已取下的愈伤组织切成0.2～0.3 mm厚薄片，浸泡于蒸馏水中，将切好的薄片置于载玻片上，按照以下步骤进行软木脂染色：初染：先用质量分数0.05%的甲苯胺蓝染液染色45 min；
脱染料：用体积分数75%的乙醇溶液冲洗3 次，再用蒸馏水冲洗干净；
复染：用质量分数1%的中性红染液染色1 min；
脱染料：用体积分数75%的乙醇溶液冲洗3 次，再用蒸馏水冲洗干净；
观察：将染好的切片置于载玻片上，盖上盖玻片在蓝色荧光显微镜下观察拍照。

木质素和软木脂沉积厚度的测量：采用图像分析软件对染色后的木质素沉积和软木质沉积厚度进行测量，使用软件标准卡尺功能对染色部位进行垂直方向高度测量，每张染色照片均取左中右3个点，每个取样点测定不少于5 张染色照片，计算平均值。

1.3.3 过氧化氢、羟自由基和超氧阴离子自由基含量的测定

过氧化氢（H2O2）和羟自由基（·OH）含量的测定：分别称取2 g冷冻愈伤组织置于10 mL离心管中，加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液混匀后，离心（4 ℃、10 000 r/min）20 min，收集上清液，按照对应试剂盒说明书步骤依次加入相应的试剂，混匀后，分别于405 nm（H2O2）和550 nm（·OH）波长处测定其吸光度。H2O2含量单位为mmol/g，·OH含量单位为U/g。

1.3.4 活性氧代谢相关酶活力的测定

称取2 g冷冻愈伤组织置于10 mL离心管中，加入5 mL 0.1 mol/L pH 7.5磷酸缓冲液（含0.005 mol/L二硫苏糖醇和质量分数5%聚乙烯吡咯烷酮）混匀后，离心（4 ℃、10 000 r/min）30 min，收集上清液用于活性氧代谢相关酶活力的测定。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力测定采用氮蓝四唑光还原法[19]；
过氧化氢酶（catalase，CAT）活力的测定采用比色法[19]；
抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力的测定采用紫外分光光度法[19]；
POD活力的测定参考张静荣等[5]的方法；
多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的测定参考Jiang Hong等[20]的方法。以上酶活力单位均为U/g，均以样品湿质量计。

1.3.5 抗氧化活性的测定

取5 g冷冻愈伤组织置于离心管（50 mL）中，加入20 mL体积分数70%乙醇溶液，混匀后，超声处理1 h，离心（4 ℃、10 000 r/min）20 min，取上清液作为提取液。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的测定参考范新光[21]的方法并作修改，吸取0.05 mL的提取液于试管中，先加入3 mL 0.3 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混匀，置于30 ℃条件下水浴1 h后，立即冷却终止反应，于517 nm波长处测定其吸光度，以Trolox为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算DPPH自由基清除能力，结果以每100 g样品反应生成Trolox的质量表示，单位为mg/100 g。

2,2’-联 氮 -二 (3-乙 基 -苯 并 噻 唑 -6-磺 酸 )（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）阳离子自由基清除能力的测定参考范新光[21]的方法并作修改，ABTS工作液的制备：将0.2 mL ABTS水溶液（7.4 mmol/L）和高硫酸钾水溶液（2.6 mmol/L）混匀，在避光环境下放置12 h后，再用无水乙醇稀释12 倍获得ABTS工作液，备用。测定时取0.05 mL上述提取液于试管中，加入5 mL ABTS工作液混匀后，避光条件下静置10 min。于734 nm波长处测定其吸光度，以Trolox为标准品绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算ABTS阳离子自由基清除能力，结果以每100 g样品反应生成Trolox的质量表示，单位为mg/100 g。

1.3.6 苯丙烷代谢相关酶活力的测定

PAL活力的测定参考杨书珍等[22]的方法并作改进，称取2 g冷冻愈伤组织置于10 mL离心管中，加入5 mL预冷的硼酸缓冲液，混匀后，离心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液并测量体积。PAL活力测定：取0.1 mL上述提取液、3.9 mL 0.1 mol/L硼酸缓冲液和0.6 mol/LL-苯丙氨酸溶液混匀后，立即于290 nm波长处测定吸光度作为初始值，然后将混合液置于40 ℃恒温水浴保温1 h，加入0.2 mL 0.002 mol/L盐酸溶液终止反应，于290 nm波长处测定其吸光度作为终止值，以每分钟反应体系吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U），PAL活力单位为U/g，以样品湿质量计，下同。

肉桂酸-4-羟基化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）活力的测定参考Wang Caixia等[23]的方法并作改进，称取2 g冷冻愈伤组织置于10 mL离心管中，加入5 mL 4 ℃预冷的0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCL缓冲液（含0.015 mol/Lβ-巯基乙醇、0.005 mol/L抗坏血酸和质量分数0.15%聚乙烯吡咯烷酮）研磨匀浆，离心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液备用。C4H活力测定：取2.5 mL 0.05 mol/L pH 7.5 Tris-HCL缓冲液（2 μmol/L反式肉桂酸、2 μmol/L氧化型辅酶II二钠、5 μmol/LD-葡萄糖6-磷酸盐）和0.5 mL上述提取液混匀，将反应混合液置于25 ℃下振荡30 min后，加入0.1 mL 6 mol/L盐酸溶液终止反应，离心后取上清液，于340 nm波长处测定吸光度。以每分钟反应体系吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U），C4H活力单位为U/g。

4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumaric acid coenzyme A ligase，4CL）活力的测定参考Yang Ruirui等[24]的方法并改进，称取2 g冷冻愈伤组织置于10 mL离心管中，加入5 mL 4 ℃预冷的0.15 mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲液（含体积分数25%甘油和0.1 mol/L二硫苏糖醇）研磨匀浆，离心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液备用。4CL活力测定：取0.5 mL 15 μmol/L氯化镁、0.2 mL 5 μmol/L对香豆酸、0.15 mL 50 μmol/L腺苷三磷酸、0.15 mL辅酶A和0.5 mL上述提取液混匀，将反应混合液置于40 ℃下水浴30 min后，加入0.1 mL 6 mol/L盐酸溶液，离心后取上清液，于333 nm波长处测定吸光度。以每分钟反应体系吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U），4CL活力单位为U/g。

肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活力的测定参考张志鹏等[25]的方法并作改进，称取2 g冷冻愈伤组织置于10 mL离心管中，加入5 mL 4 ℃预冷的0.1 mmol/L pH 6.25磷酸缓冲液（含质量分数10%交联聚乙烯吡咯烷酮、体积分数2%聚乙二醇和0.1 mol/Lβ-巯基乙醇）研磨匀浆后，于4 ℃下超声处理20 min，离心（4 ℃、1 000 r/min）10 min，取上清液备用。CAD活力测定：取1 mL 0.01 mol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、1.2 mL反式肉桂酸和0.3 mL上述提取液混匀，将反应混合液置于37 ℃下水浴30 min后，加入0.1 mL 6 mol/L盐酸溶液，离心并取上清液，置于340 nm波长处测定吸光度。以每分钟反应体系吸光度变化0.01为一个酶活力单位（U），CAD活力单位为U/g。

1.3.7 总酚和木质素含量的测定

总酚含量的测定参考李昌健等[26]的方法并作改进，取冷冻甘薯愈伤组织1 g，加入提前预冷的6 mL体积分数1%盐酸-甲醇溶液，转入离心管于黑暗4 ℃环境下反应20 min，离心（4 ℃、8 000 r/min）15 min，吸取上清液在280 nm波长处测定光密度值。总酚含量单位为OD280nm/g。

木质素含量的测定参考Hamerschmidt[27]的方法并作改进。取冷冻愈伤组织1 g，加入4 mL预冷的体积分数95%乙醇溶液，用打浆机打匀，转入离心管中4 ℃、10 000 r/min离心20 min，弃掉上清液后，加入2 mL体积分数95%乙醇溶液混匀后离心（4 ℃、10 000 r/min）10 min，重复上述操作3 次，再用V（乙醇）∶V（正己烷）＝1∶2的溶液将沉淀物反复冲洗3 次，收集沉淀将其烘干至恒质量后移至小试管中，测定前需提前将水浴锅置于通风橱中预热至70 ℃，先向试管中加入1 mL体积分数25%溴化乙酰溶液，混匀，立即置于水浴锅中反应30 min后，依次加入1 mL 2 mol/L氢氧化钠溶液、0.1 mL 7.5 mol/L盐酸羟胺溶液和2 mL冰醋酸，随后4 ℃、10 000 r/min离心20 min，吸取上清液0.5 mL，用冰醋酸定容至5 mL，于280 nm波长处测定光密度值，重复3 次。木质素含量单位为OD280nm/g。

1.3.8 甘薯块根愈伤组织中酚类物质含量测定

甘薯愈伤组织中酚类物质含量的测定参考范新光[21]的方法并作修改，实验所用的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪配有LC-20AT泵、C18反相柱（粒径5 μm）和SPD-M20A二极管阵列检测器；
测定参数为柱温35 ℃、流速1 mL/min、进样体积20 mL、流动相A为1%乙醇溶液、流动相B为甲醇。提取液制备：取5 g冷冻愈伤组织置于离心管（50 mL）中，加入20 mL体积分数70%乙醇溶液混匀，混合液超声处理1 h，随后离心（4 ℃、10 000 r/min）20 min，取上清液作为提取液。HPLC条件：将甘薯愈伤组织提取液按照0～15 min 12%～25% B、15～25 min 25%～35% B、25～50 min 35%～55% B、50～60 min 55%～65% B、60～70 min 65%～12% B进行分离，于280 nm波长处测定吸光度。使用实验室配制的混合标准品对甘薯愈伤组织的酚类物质进行定性和定量分析。酚类化合物的含量单位为mg/g。

1.4 数据统计与分析

以上实验均做3 次重复，采用Excel 2010软件对所有数据进行统计，计算平均值、标准差并绘图，用SPSS 18.0软件对实验数据进行方差分析和多重差异显著分析，以P＜0.05表示差异显著。

2.1 RHT对甘薯愈伤期间伤口处木质素和软木脂沉积的影响

如图1所示，愈伤期间，甘薯伤口部位的木质素不断沉积，木栓化周皮的细胞组织不断加厚，软木脂不断沉积。木质素经间苯三酚-HCl染色后呈现红色，木质素含量越高颜色越深。愈伤2～6 d时，CK+和RHT甘薯伤口处的木质素染色程度始终深于CK-，木栓细胞组织厚度明显大于CK-，对比RHT和CK+甘薯发现，RHT的愈伤效果更为明显，其最终木质素染色更深、厚度更大（图1A）。由图2A可知，木质素沉积厚度随着愈伤时间的延长逐渐增加，愈伤6 d时，RHT和CK+甘薯木质素沉积厚度分别为49 μm和47 μm，木栓细胞较小且排列紧密。而CK-的木质素沉积厚度仅为40 μm，木栓细胞较大、排列松散。软木脂是构成甘薯愈伤组织的重要成分之一，它是由脂肪酸代谢途径作用下产生的大量α-、ω-二元酸，ω-羟基酸和脂肪酸类物质单体通过酯键连接聚合而成，这些单体物质能与甲苯胺蓝中的阳离子结合而被染成紫蓝色[28]。随着愈伤时间的延长，各处理组软木脂自发荧光强度逐渐增强，细胞厚度也不断增加（图1B），其中RHT和CK+甘薯自发荧光始终强于CK-。从图2B可以看出，RHT和CK+甘薯软木脂沉积厚度明显高于CK-，愈伤6 d时分别比CK-高80.09%和72.54%。木质素的产生速率和积累量可反映果蔬伤口损伤愈合的效果。由图2C可知，损伤甘薯在愈伤期间木质素含量总体呈上升的趋势；
与CK-相比，CK+和RHT甘薯愈伤期间木质素产生速率始终高于CK-，其中RHT甘薯木质素在前期愈伤过程（0～2 d）中积累较少，之后开始大量积累，愈伤6～7 d时趋于平缓。上述实验结果表明，RHT能够促进甘薯块根伤口处木质素和软木脂的沉积。

图1 RHT对甘薯愈伤期间伤口处木质素（A）和软木脂（B）沉积的影响Fig. 1 Effect of RHT on the deposition of lignin (A) and softwood resin (B)at the wound site

图2 RHT对甘薯愈伤期间伤口处木质素（A）和软木脂（B）沉积厚度及木质素含量（C）的影响Fig. 2 Effect of RHT on the deposition thickness of lignin (A) and suberin (B) and lignin content (C) at the wound site during healing

2.2 RHT对甘薯愈伤期间伤口处H2O2、·OH和O-2·积累的影响

果蔬在受到外界损伤胁迫或病原菌侵染时，会诱导体内H2O2、·OH和等活性氧物质的快速积累，其作为信号分子诱导采后果蔬抗逆性增加[29]。愈伤期间，对照组（CK+和CK-）和RHT甘薯H2O2含量均呈逐渐上升的趋势（图3A）。RHT甘薯组织中H2O2含量在愈伤7 d时达到最大值（57.66 mmol/g），与CK+没有显著差异，而CK-的H2O2含量仅有41.68 mmol/g。各处理组产生的·OH从愈伤第2天开始也呈逐渐上升的变化趋势（图3B）。RHT和CK+甘薯·OH含量始终高于CK-，在愈伤3～5 d时各组·OH含量急剧升高，这可能是苯丙烷代谢产生的大量酚类物质激活调控活性氧产生的相关酶，导致·OH大量积累[30]。愈伤7 d时，RHT和CK+甘薯·OH含量均达到最大值，RHT组分别比CK-和CK+高67.89%和6.64%。甘薯愈伤组织中含量的变化趋势（图3C）与·OH含量的变化趋势（图3B）相似。愈伤前期（0～3 d）各组处理基本没有明显变化，从愈伤3 d开始呈明显上升的趋势，其中RHT甘薯含量始终处于较高水平，愈伤7 d时达到168.94 U/g，显著高于CK-（P＜0.05），与CK+没有显著差异。上述结果表明，RHT可以明显诱导甘薯块根短期内产生大量的活性氧物质，从而促进甘薯愈伤。

图3 RHT对甘薯愈伤期间伤口处H2O2（A）、·OH（B）和（C）积累的影响Fig. 3 Effect of RHT on the accumulation of H2O2 (A), hydroxyl radical (B) and superoxide anion radial (C) in sweet potato callus during healing

2.3 RHT对甘薯愈伤期间伤口处SOD、CAT、APX、POD和PPO活力的影响

如图4A、B所示，愈伤期间，甘薯的SOD和CAT活力呈不断上升的趋势，RHT组总体显著高于对照组（CK+和CK-）（P＜0.05）。APX活力则呈先升高后降低的趋势，愈伤2.5 d和4 d时，RHT和CK+甘薯的APX活力分别达到峰值，之后开始逐渐下降（图4C），这可能是甘薯受应激胁迫影响使得APX活力在愈伤前期迅速升高，而在愈伤后期，细胞活性氧代谢系统平衡被破坏，导致APX活力降低[31]。POD和PPO是愈伤过程中重要的防御酶，可有效清除活性氧自由基，减轻氧化损伤，增加甘薯的抗性。由图4D、E可知，随着愈伤时间的延长，各处理组POD和PPO活力总体呈上升的趋势，RHT甘薯POD活力始终高于对照组（CK+和CK-），愈伤4～7 d时达到了显著水平（P＜0.05）。PPO活力在愈伤0～2.5 d时各组的差异不明显，3 d时CK-的PPO活力有所降低，这可能由于愈伤组织在形成过程中活性氧代谢紊乱，抑制了膜脂的过氧化作用[32]。RHT和CK+甘薯的PPO活力在愈伤7 d时明显高于CK-，分别达到42 U/g和39 U/g。

图4 RHT对甘薯愈伤期间伤口处SOD（A）、CAT（B）、APX（C）、POD（D）和PPO（E）活力的影响Fig. 4 Effect of RHT on the activities of SOD (A), CAT (B), APX (C),POD (D) and PPO (E) in sweet potato callus during healing

2.4 RHT对甘薯愈伤期间伤口处DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力的影响

从图5可以看出，甘薯愈伤组织DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力的变化趋势基本一致，总体呈上升趋势，其中RHT甘薯的DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力均显著高于其他两组（P＜0.05），在愈伤7 d时达到最大值（209.1 mg/100 g和168.2 mg/100 g），分别是CK+的1.16 倍和1.25 倍，而CK-的DPPH自由基清除能力呈单峰型变化趋势，在第5天时达到最大值，ABTS阳离子自由基清除能力则呈缓慢上升的趋势，这可能是甘薯愈伤组织在形成过程中活性氧代谢失衡，导致抗氧化能力降低[33]。

图5 RHT对甘薯愈伤期间伤口处DPPH自由基（A）和ABTS阳离子自由基（B）清除能力的影响Fig. 5 Effect of RHT on DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B)scavenging capacity in sweet potato callus during healing

2.5 RHT对甘薯愈伤期间伤口处黄酮及酚类化合物的影响

酚类物质作为合成甘薯木栓层和木质素的前体物质，是构成甘薯块根愈伤周皮的主要组成成分之一[5]。利用HPLC法对RHT甘薯愈伤组织中酚类物质进行分离和鉴定，发现甘薯愈伤组织中的酚类物质主要有新绿原酸、儿茶素、绿原酸和表儿茶素4种酚类物质。由图6可知，愈伤期间，各组处理的总酚和芦丁含量变化趋势基本一致（图6A、B），愈伤前2 d各处理组间总体无明显差异，之后对照组（CK+和CK-）总酚含量出现逐渐下降后上升的趋势，这可能与PPO不断催化酚类物质氧化生成醌类化合物有关[34]；
而RHT甘薯则呈不断上升的趋势，愈伤5 d时达到了峰值，显著高于对照组（CK+和CK-）（P＜0.05）。上述结果表明，RHT能在一定程度上促进甘薯伤口处总酚和类黄酮的产生和积累。新绿原酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素和芦丁5种单酚类物质的变化趋势也基本一致，总体呈逐渐上升的趋势，新绿原酸、绿原酸和芦丁愈伤前1.5 d各组间差异较小，愈伤后期（2～7 d），RHT甘薯新绿原酸、绿原酸和芦丁含量整体显著高于CK-和CK+（P＜0.05），其中愈伤7 d时，RHT甘薯绿原酸含量达到0.379 mg/g，分别是CK+和CK-甘薯的1.04 倍和1.08 倍。甘薯在愈伤期间儿茶素和表儿茶素含量也呈逐渐上升的变化趋势，其中RHT甘薯儿茶素和表儿茶素含量始终高于其他各组，愈伤0～2 d时，RHT甘薯儿茶素和CK+之间没有显著差异，愈伤7 d时，RHT甘薯的儿茶素含量显著高于对照组（CK+和CK-）（P＜0.05），而RHT甘薯表儿茶素含量在整个愈伤过程中始终处于较高水平，第7天时达到0.063 mg/g，分别比CK+和CK-甘薯高出46.51%和70.27%，说明采后RHT能够有效促进甘薯愈伤过程中酚类化合物的积累，帮助甘薯伤口快速形成愈伤木栓组织。

图6 RHT对甘薯愈伤期间伤口处总酚（A）、芦丁（B）、新绿原酸（C）、绿原酸（D）、表儿茶素（E）和儿茶素（F）含量的影响Fig. 6 Effects of RHT on the contents of total phenols (A), rutin (B),neochlorogenic acid (C), chlorogenic acid (D), epicatechin (E) and catechin (F) in sweet potato callus during healing

2.6 RHT对甘薯愈伤期间伤口处PAL、C4H、4CL和CAD活力的影响

如图7A所示，在愈伤过程中，随着愈伤时间的延长，3个组甘薯PAL活力呈现逐渐上升的趋势，RHT甘薯PAL活力始终显著高于对照组（CK+和CK-），0.5 d时就受热刺激促使PAL活力大幅上升，而CK+甘薯愈伤组织PAL活力在1.5 d时才大幅度上升。愈伤期间4CL和C4H活力的变化趋势基本一致（图6B、C），RHT和CK+甘薯的4CL和C4H活力均呈先升高后逐渐下降的趋势，且RHT甘薯4CL和C4H活力峰值提前于CK+出现。RHT甘薯的CAD活力呈先上升后下降的趋势，愈伤2 d时达峰值，显著高于CK+和CK-（P＜0.05）。CK+和CK-甘薯的CAD活力则呈逐渐上升的趋势，在愈伤7 d时，CK+甘薯的CAD活力达到了0.164 U/g，与RHT组没有显著差异，而CK-甘薯的CAD活力仅有0.113 U/g。上述结果表明，RHT能在短时间内诱导甘薯愈伤组织中关键酶活性快速升高，激活苯丙烷代谢，对甘薯伤口的快速愈合具有积极作用。

图7 RHT对甘薯愈伤期间伤口处PAL（A）、4CL（B）、C4H（C）和CAD（D）活力的影响Fig. 7 Effect of RHT on the activity of PAL (A), 4CL (B), C4H (C) and CAD (D) in sweet potato callus during healing

果蔬在采后的愈伤过程主要涉及细胞增殖与分化、信号传导、抗病反应、次生代谢和能量产生等过程[35]。但目前采后果蔬的愈伤还属一个较新的研究方向，相关研究较少，许多研究指出马铃薯、甘薯等块根类作物愈伤途径主要涉及3个部分，包括活性氧代谢、脂肪酸代谢和苯丙烷代谢[36]，并且这3 条代谢途径中涉及的相关酶系参与整个愈伤过程。

活性氧在块茎愈伤组织形成过程中具有信号分子和氧化交联双重作用[37]。如图8所示，研究指出甘薯受到外界损伤胁迫及外来病原菌侵染时，由于自身的应激反应刺激细胞膜外Ca2+内流，从而导致膜内Ca2+浓度升高[38]，而膜内钙依赖蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase，CDPK）作为钙离子识别蛋白，可以识别并结合Ca2+，这种聚合物在磷酸化后由呼吸爆发氧化酶同系物（respiratory burst oxidase homologues，Rbohs）作用产生大量和·OH。本研究发现，当甘薯受到RHT处理带来的温度刺激时，活性氧代谢途径快速响应，迅速累积大量·OH和。这些活性氧的大量聚集破坏了甘薯自有的活性氧代谢平衡，从而致使甘薯体内SOD、PPO、POD等相关抗氧化酶大量产生，此后在SOD的歧化作用下，这些活性氧歧化生成大量H2O2，进而加速细胞核引导的两条糖代谢途径的次生代谢（脂肪酸代谢和苯丙烷代谢）[39]。在苯丙烷代谢途径下，愈伤组织会产生大量单酚类物质，并且在相关酶的催化下形成聚酚软木脂（suberin polyphenolic，SPP），此外单酚类物质还可以参与木质素特异代谢途径，合成大量木质素从而堆叠在愈伤组织周围[40]。在脂肪酸代谢途径下，愈伤组织会产生的大量小分子脂肪酸，并聚合形成大分子脂肪酸，最终堆叠成为聚酯软木脂（suberin polyaliphatic，SPA）。脂肪酸代谢途径生成的SPA和苯丙烷代谢途径生成的SPP最终参与聚合生成软木脂生物聚合物，作为愈伤层的最终沉积物质形成封闭层[41]。

图8 热激处理参与甘薯块茎愈伤的代谢通路模式图Fig. 8 Pattern of metabolic pathways involved in callus of sweet potato tuber under heat shock treatment

本研究发现，在活性氧代谢过程中，受损甘薯在RHT的温度刺激效应下，活性氧代谢途径快速响应，迅速累积大量·OH和，打破甘薯自有的活性氧代谢平衡，诱导SOD、CAT、APX、POD和PPO等活性氧途径酶活性快速上升，且SOD的大量活化使得歧化反应进程加快，生成更多的H2O2，刺激甘薯细胞内苯丙烷代谢途径。并且POD可在H2O2的作用下通过氧化交联参与SPP和木质素的聚合[42]，参与受损甘薯伤口愈合。此外，RHT提高了甘薯愈伤组织中DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除能力，维持甘薯愈伤组织中活性氧代谢的稳定，参与甘薯块根的愈伤。

另一方面，热激处理下产生的大量H2O2促进细胞糖代谢进程，促使胞内苯丙烷代谢加速。此过程主要分为两个部分，首先是在苯丙烷代谢产生酚类单体过程中，热激处理使甘薯受损组织愈伤时期相关代谢酶含量较对照组总体显著上升（P＜0.05），尤以PAL和4CL两种重要代谢酶为代表，相关研究表明，PAL和4CL活性越高，表明甘薯受损部位愈伤能力越强[43]，对苯丙烷代谢产生聚酚软木脂结构域的过程起到有益作用；
其次是热激处理可促进苯丙烷代谢支路中木质素的产生。研究结果表明，对比对照组，RHT显著促进了苯丙烷代谢中木质素含量的增加（P＜0.05）。这一结果与李昌健[26]和李雪[44]等在马铃薯块茎愈伤中观察到的结果相似。可以推测，甘薯在热激条件下可通过促进胞内苯丙烷代谢途径，进而促进甘薯受伤组织愈伤层的快速形成。

综上所述，本研究在前期研究的基础上，采用65 ℃热激15 min处理与传统愈伤处理对甘薯块根进行愈伤，通过观察块根伤口处木质素和软木脂沉积，分析活性氧代谢和苯丙烷代谢活性变化，证实了热激处理对采后甘薯块根愈伤的促进作用并阐释其机理，可为采后甘薯块根的快速愈伤提供理论和方法依据。但是，本探究还存在一些可延伸研究的部分，例如未对糖代谢过程中脂肪酸代谢及苯丙烷代谢的相关代谢物质转录的基因表达情况进行探究，后续将进行深入探究，补充完善热激促进甘薯愈伤的深层机理，以期为减少甘薯实际生产贮运中的损失提供新方法和新思路。

本研究采用RHT（65 ℃热激15 min）与传统窖藏长时间低温度的热处理（35 ℃热处理2 d）对甘薯块根进行愈伤处理，通过分析活性氧代谢和苯丙烷代谢途径中相关酶活性变化和中间产物的累积情况，对比未经热处理的甘薯，发现RHT对采后甘薯块根愈伤有显著促进作用，特别是在第0～2天内，能够明显刺激活性氧代谢途径的H2O2和积累，激活伤口周围组织的SOD活性。RHT能够使甘薯伤口组织苯丙烷代谢途径快速响应，大量产生并累积儿茶素、芦丁、绿原酸等多酚物质，从而加速木质素和愈伤木栓层的形成。

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