尿感方对膀胱上皮屏障及关键连接蛋白表达的影响
时间：2023-01-21 20:55:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
朱盼盼， 蒋 健， 陈君灏， 乔 昀， 元唯安， 梁群梅， 贺 敏
(上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203)
尿路感染是病原体入侵泌尿系统引起的感染性疾病，尿道致病性大肠杆菌是导致尿路感染发生的主要病原体[1-3]。膀胱上皮细胞通过连接复合体将相邻的上皮细胞紧密相连，共同构成膀胱上皮屏障，其在防御病原体中发挥着重要作用，上皮屏障受损是尿路感染的主要病理特征之一[3-7]。上皮屏障的结构和功能与连接复合体中的关键连接蛋白闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(Occludin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)关系密切，尿路感染时，上皮细胞ZO-1、Occludin、E-cadherin表达下调，上皮屏障受损[4,7]。
尿感方(授权专利号ZL200910201845.6)由马齿苋、蒲公英组成，具有抗菌、抗炎、免疫调节等多种药理作用[8-12]，是治疗尿路感染的有效方剂[13]。膀胱上皮细胞与致病菌共存于尿液环境中，尿液中药物的作用对于尿路感染的研究更为直接，课题组前期研究发现，尿感方含药尿液具有免疫调节的作用[14-16]，但其对膀胱上皮屏障的影响尚不清楚。因此，本研究利用Transwell小室建立单层膀胱上皮细胞尿道致病性大肠杆菌感染模型，通过菌落检出数量化穿过单层细胞的细菌数和酚红透过率的方法，观察尿感方对膀胱上皮屏障完整性和通透性的影响，并从对关键连接蛋白表达影响的角度探讨其作用机理。
1.1 动物和细胞株 SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体质量(250±10)g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK(沪)2017-0005，饲养于上海中医药大学实验动物中心。人膀胱癌HTB-9细胞，目录号TCHu1，购于中国科学院细胞库。
1.2 药物 马齿苋(配方颗粒，批号20020481，每袋1.5 g，相当于饮片15 g)、蒲公英(配方颗粒，批号20041181，每袋2 g，相当于饮片15 g)，均由江阴天江药业有限公司生产。
1.3 菌株 尿道致病性大肠杆菌J96(编号ATCC700336)购自上海北诺生物科技有限公司，接种于卢里亚-贝尔塔尼培养基，37 ℃培养24 h后用PBS配制成细菌悬液备用，实验前通过细菌比浊仪估算细菌浓度。
1.4 试剂 卢里亚-贝尔塔尼琼脂平板，购自上海科玛嘉微生物技术有限公司；
RPMI-1640培养基，购自美国Thermo Scientific公司；
胎牛血清、0.25%胰酶，购自美国Gibco公司；
PBS、酚红、庆大霉素，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
CCK-8细胞活性计数试剂盒，购自苏州宇恒生物科技有限公司；
ZO-1兔抗IgG、Occludin兔抗IgG、E-cadherin兔抗IgG、β-actin鼠抗IgG、BCA蛋白定量检测试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、RIPA裂解液(强)、封闭液、一抗稀释液、二抗稀释液、显影定影试剂，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；
PVDF膜，购自美国Millipore公司。
1.5 仪器 细菌比浊仪(法国BioMerieux公司)；
SpectraMaxi3x多功能酶标(美国Molecular Devices公司)；
普通倒置显微镜(日本Olympus公司)；
超净工作台、CO2培养箱(美国Thermo Scientific公司)；
Western Blot电泳系统、转膜仪(美国Bio-Rad公司)；
低温离心机(德国Eppendorf公司)；
Odyssey双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司)。
2.1 含药尿液制备 尿感方饮片剂量(马齿苋70 g、蒲公英55 g)换算为配方颗粒剂量，按课题组前期的方法[14-16]制备大鼠空白尿液和含药尿液，大鼠(生药25.0 g/kg)按“3D-2T-1H”法给药，即每天灌胃给药2次，连续3 d，次日早晨再灌胃给药1次，收集末次给药后3 h内尿液，4 000 r/min离心15 min，56 ℃水浴灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤，于-80 ℃保存备用。
2.2 药物毒性实验 含药尿液及空白尿液的安全范围采用CCK-8法确定，按试剂盒说明书操作。
2.3 细胞培养 HTB-9细胞用含10% FBS的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，培养瓶内细胞长至70%～80%时，用0.25%胰酶消化后传代或种板。
2.4 细胞分组及给药 HTB-9细胞分为正常组，模型组，10%、5%大鼠含药尿液组及10%、5%大鼠空白尿液组。各尿液组用含10% FBS的RPMI-1640培养基稀释尿液至终体积分数为5%、10%，然后与细胞共同培养；
模型组和正常组用含10% FBS的RPMI-1640培养基与细胞共同培养，培养12 h。
2.5 造模 HTB-9细胞接种在Transwell小室上室中，隔天按“2.4”项下方法分组和给药，培养结束后，用PBS洗涤3次，下室加入培养基，上室除正常组外，均加入细菌/细胞比例(MOI)为100的尿道致病性大肠杆菌J96，培养造模2 h[17]。
2.6 酚红透过率实验 按“2.5”项下方法造模结束后，采用庆大霉素保护法清除胞外细菌，用PBS洗涤后，弃去洗液并吸干残液，上室加入含酚红(15 mg/L)的培养基(不含FBS)，下室加入PBS，37 ℃、5% CO2孵箱中培养4 h，分别取上、下室溶液，酶标仪于570 nm波长处检测光密度(OD)值[18-19]。相对酚红透过率=[(OD实验组下室溶液/OD实验组上室溶液)/(OD正常组下室溶液/OD正常组上室溶液)]×100%。
2.7 测定穿过单层细胞的细菌数 采用平板菌落计数法对菌落进行计数以量化穿过单层细胞的细菌数，以模型组细菌数的均值归一化计算各组的相对菌落计数。参考文献[17]方法，按照“2.5”项下造模结束后，用移液器从下室取出100 μL培养液，倍比稀释并涂于卢里亚-贝尔塔尼琼脂平板，37 ℃培养过夜后计数。
2.8 Western blot法检测ZO-1、Occludin、E-cadherin蛋白表达 细胞接种于6孔板，按“2.4”项下方法分组和给药，培养结束后，用PBS洗涤3次，除正常组外加入MOI为100的尿道致病性大肠杆菌J96，正常组加入培养基，培养造模2 h。采用庆大霉素保护法清除胞外细菌后，加入RIPA裂解液提取总蛋白，以BCA法检测蛋白浓度。蛋白样本电泳分离并转移至PVDF膜，封闭1 h，加入一抗工作液4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入二抗工作液室温孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL法发光，凝胶成像系统观察蛋白条带，用AlphaEase FC软件分析灰度值，计算目标蛋白与β-actin(内参)的灰度值比例。各实验均重复3次。
3.1 药物毒性实验 经10%大鼠含药尿液或10%大鼠空白尿液预处理24 h的细胞存活率均大于90%，提示10%及以下浓度的含药尿液和空白尿液对HTB-9细胞无明显毒性。
3.2 尿感方对细胞间通透性的影响 如图1所示，与正常组比较，模型组酚红透过率增加(P<0.01)，提示尿道致病性大肠杆菌损伤了细胞屏障，使细胞之间的间隙增大；
与模型组比较，5%、10%大鼠空白尿液组酚红透过率均无明显变化(P>0.05)，提示大鼠空白尿液对尿道致病性大肠杆菌所损伤的细胞间隙没有明显影响；
与5%、10%大鼠空白尿液组比较，5%、10%大鼠含药尿液组酚红透过率均降低(P<0.05)，提示尿感方含药尿液对尿道致病性大肠杆菌所损伤的细胞间隙具有一定的修复作用。
3.3 尿感方对穿过单层细胞细菌数的影响 如图2所示，模型组有大量细菌穿过单层细胞；
与模型组比较，5%、10%大鼠空白尿液组穿过单层细胞的细菌数均无明显变化(P>0.05)，提示大鼠空白尿液对尿道致病性大肠杆菌所损伤的细胞屏障没有明显影响；
与10%大鼠空白尿液组比较，10%大鼠含药尿液组穿过单层细胞的细菌数减少(P<0.05)，提示尿感方含药尿液对尿道致病性大肠杆菌所损伤的细胞屏障具有一定的修复作用。
3.4 尿感方对尿道致病性大肠杆菌感染膀胱上皮细胞关键连接蛋白表达的影响 如图3所示，与正常组比较，模型组上皮细胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达均降低(P<0.01)，提示尿道致病性大肠杆菌影响了HTB-9细胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达；
与模型组比较，5%、10%大鼠空白尿液组ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达均无明显变化(P>0.05)，提示空白尿液对尿道致病性大肠杆菌所致的HTB-9细胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达下调无明显影响；
与10%大鼠空白尿液组比较，10%大鼠含药尿液组 ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)；
与5%大鼠空白尿液组比较，5%大鼠含药尿液组 ZO-1和E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05)，提示尿感方含药尿液能够逆转尿道致病性大肠杆菌所致的HTB-9细胞ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达下调。
膀胱上皮屏障是抵御病原体入侵的重要防线，膀胱上皮细胞之间互相接触，通过连接复合体特化加固上皮细胞结构的细胞连接方式构成了膀胱上皮屏障[3-5]。连接复合体参与调节上皮细胞之间的粘附和细胞旁路运输，其对上皮屏障功能的正常发挥起着重要作用。正常生理情况下，膀胱上皮屏障只允许小分子物质通过屏障；
当尿道致病性大肠杆菌感染时，尿道致病性大肠杆菌可通过直接和间接的方式作用于连接复合体，影响连接复合体中连接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin等的表达，导致细胞连接结构受损、屏障功能异常，进而膀胱腔内的病原体、有害物质等从上皮屏障侵入深层组织，引起一系列病理生理的改变(疾病发生或加重)[4-6]。因此，保护膀胱上皮屏障为临床防治尿路感染提供了新的思路[7]。
通过测定酚红从Transwell小室上室渗透至下室的量，可以评价细胞间隙的通透性和单细胞层的完整性[18-19]；
另外，测定病原体从上室穿过单细胞层至下室的数量也是评价单细胞层完整性的良好方法[17]。本研究结果显示，尿感方含药尿液中的药物能修复尿道致病性大肠杆菌所损伤的细胞间隙，降低细胞间的通透性，使从细胞间隙透出的酚红量减少，穿过单层细胞的细菌数量减少。
ZO-1、Occludin和E-cadherin是膀胱上皮屏障连接复合体中的关键连接蛋白，其对屏障结构和功能的维持有重要作用。ZO-1位于细胞质内膜，是连接复合体中最重要的紧密连接蛋白，它是细胞间紧密连接结构的支架，将跨膜蛋白与骨架蛋白相连，并通过跨膜信号通路调节细胞屏障的功能[20-21]。ZO-1表达的下降会影响细胞间紧密连接结构的稳定和屏障功能的发挥，它是评价细胞紧密连接屏障完整性的主要指标[20-23]。Occludin是连接复合体中重要的跨膜蛋白，它通过自身的4个跨膜区将相邻细胞以拉链方式相结合，从而实现细胞旁封闭[24]。Occludin的羧基端通过ZO-1与骨架蛋白相连，与ZO-1共同调节紧密连接结构的变化[24-25]。Occludin表达或活性降低，都会导致细胞间隙通透性的增加[24-25]。E-cadherin是上皮细胞的标志物，也是连接复合体中最重要的跨膜粘附连接蛋白之一，它位于细胞紧密连接处，主要介导和调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，直接影响着紧密连接结构的稳定性。E-cadherin能跨越细胞间隔，粘附连接对侧的相邻细胞，在细胞之间形成粘附带[26-27]。E-cadherin表达的下调会影响上皮细胞间的粘附水平和紧密连接结构的完整性，导致屏障受损[26-28]。
本研究结果显示，模型组ZO-1、Occludin和E-cadherin的蛋白表达较正常组显著降低，与文献报道一致。本研究结果还显示，大鼠空白尿液对尿道致病性大肠杆菌所致的ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达下调没有明显影响，但尿感方含药尿液中的药物能逆转尿道致病性大肠杆菌所致的ZO-1、Occludin和E-cadherin蛋白表达下调。
综上所述，尿感方对尿道致病性大肠杆菌所致的膀胱上皮屏障损伤有一定的修复作用，其作用机制与关键连接蛋白表达有关。
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