特异性敲除心肌白细胞介素-8抑制信号转导及转录激活蛋白3活化改善慢性心力衰竭小鼠心功能及炎症反应
时间：2023-01-21 20:05:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
恩歌 陈少杰 刘阳 林祥灿
1天津北大医疗海洋石油医院心内科（天津 300452）；
2中山大学孙逸仙纪念医院消化内科（广州 510120）；
3南华大学附属第二医院心血管内科（湖南 衡阳 421000）
慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是临床上多种心血管疾病终末阶段的共同表现[1-2]，目前发病的分子机制尚未明确，相关的分子生物学研究认为炎症反应、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）系统、交感系统的激活与CHF的发生发展密切相关，其中炎症反应激活所致多种炎症因子的异常释放会造成心肌细胞损害、心肌间质重构。白细胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是参与炎症反应激活的重要细胞因子，CHF患者血清中IL-8的水平明显升高且与心功能减退、预后不良有关[3-4]，深入认识IL-8在CHF发病中的作用及机制有助于进一步阐明CHF的发病机制。
IL-8的生物学作用与下游信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的活化有关[5-6]。STAT3是在心血管系统中发挥重要作用的转录调节因子，在压力负荷、缺血再灌注等病理因素诱导的CHF中均发生过度活化且参与心肌重构、炎症反应的调控[7-8]。为了深入认识IL-8在CHF发病中的作用及机制，本研究在野生型小鼠和特异性敲除心肌IL-8的模型小鼠中进行了实验，具体观察IL-8通过STAT3对CHF小鼠心功能及炎症反应的影响。
1.1 实验动物野生型（wild type，WT）C57BL/6J雄性小鼠购自上海南方模式生物科技公司，特异性敲除（knockout，KO）心肌IL-8的雄性模式小鼠（遗传背景C57BL/6J）由上海南方模式生物科技公司采用LoxP-Cre系统构建并鉴定。
1.2 试剂与仪器苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒购自武汉博士德公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒购自上海碧云天公司，氨基末端脑钠肽前体（N-terminal pro-B type natriuretic peptide，NT-proBNP）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶联免疫吸附法测定（ELISA）试剂盒上海原鑫生物科技公司，总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化公司，IL-8、STAT3、p-STAT3、β-actin特异性一抗购自美国Abcam公司。
6LAB便携式小动物超声仪购自北京益仁恒业科技有限公司，XD30M型光学显微镜购自浙江舜宇光学生物仪器公司，LineGene Mini型荧光定量PCR仪购自杭州博日科技股份有限公司。
1.3 动物分组及造模WT C57BL/6J雄性小鼠分为WT对照组、WT模型组，特异性心肌IL-8 KO的雄性模式小鼠分为KO对照组、KO模型组，每组各8只。WT模型组和KO模型组采用腹主动脉缩窄术建立CHF模型，方法如下：腹腔注射0.4%戊巴比妥钠40 mg/kg，麻醉后打开腹腔、暴露腹主动脉，在主动脉根部上方用3.0丝线穿无菌聚乙烯塑料管结扎；
WT对照组和KO对照组进行假手术操作，按照造模相同的方法麻醉、打开腹腔、暴露腹主动脉、穿线但不结扎。完成手术后关闭切口，4周后进行检测和取材。
1.4 超声心动图检测心功能造模4周后进行超声心动图检查，腹腔注射0.4%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，而后摆放仰卧位，用多普勒探头在胸骨旁的左室长轴进行扫描，获得理想图像后检测左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）。
1.5 血清的取材及检测完成超声心动图检测后，经心尖取血约2～3 mL，静置30 min后凝血，3 000 r/min离心10 min，分离血清并采用ELISA试剂盒检测NT-proBNP、IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平。
1.6 心肌的取材及称重完成经心尖取血后解剖心脏、称量心脏质量（heart weight，HW），解剖左心室、称量左心室质量（left ventricle weight，LVW），同时在超声心动图检查检测称量体质量（body weight，BW），计算HW/BW、LVW/HW。
1.7 心肌病理改变的HE染色检测剪取适量左心室的心肌组织，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，而后进行石蜡包埋、制作厚度4 μm的切片，进行HE染色后在光学显微镜下观察心肌组织的病理改变。
1.8 心肌中蛋白表达水平的免疫印迹检测剪取左心室的心肌组织约5～8 mg，加入预冷的裂解液并在冰上研磨组织，研磨后进行4℃、12 000 r/min 10 min，吸取离心后的上清、BCA法检测蛋白浓度。在免疫印迹检测时，每份样本取30 μg蛋白，在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，分离不同分子量的蛋白后电转移至硝酸纤维素膜；
而后分别进行5%脱脂牛奶孵育，IL-8一抗、p-STAT3一抗、STAT3一抗、β-actin一抗孵育，辣根过氧化物酶二抗孵育，最后采用电化学发光法显影得到蛋白条带，用软件分析条带的灰度值，用目的蛋白与内参蛋白β-actin灰度值的比值来分析蛋白表达水平。
1.9 心肌中mRNA表达水平的PCR检测剪取左心室的心肌组织约5～8 mg，采用总RNA提取试剂盒提取组织中的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒对组织中的总RNA进行反转录、合成cDNA，最后采用荧光定量检测试剂盒对IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平进行荧光定量PCR检测，PCR反应体系如下：cDNA 1 μL、荧光定量检测反应混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去离子水补足至20.0 μL。在荧光定量PCR以上进行PCR反应，反应程序如下：95℃预变性3 min后95℃ 15 s、特异性退火温度（IL-1β 60.0℃、IFN-γ 62℃、TNF-α 60.0℃、β-actin 62.0℃）25 s、72℃ 30 s重复40个循环，反应结束后得到循环曲线及循环阈值（cycle threshold，Ct），以β-actin为内参、按照公式2-△△Ct计算IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平。
1.10 统计学方法采用SPSS 23.0版本软件进行统计学处理，实验数据均为计量资料且符合正态分布，用均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验，4组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 四组小鼠心肌中IL-8表达水平的免疫印迹检测WT模型组小鼠心肌中IL-8的表达水平高于WT对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；
KO对照组、KO模型组小鼠心肌中不表达IL-8。见图1。
2.2 四组小鼠心功能的超声心动图检测四组小鼠LVEF、LVESD、LVEDD的比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较如下：WT模型组小鼠的LVEF水平低于WT对照组，LVESD、LVEDD水平均高于WT对照组（P＜0.05）；
KO对照组小鼠的LVEF、LVESD、LVEDD水平与WT对照组比较无差异（P＞0.05）；
KO模型组小鼠的LVEF水平高于WT模型组，LVESD、LVEDD水平均低于WT模型组（P＜0.05）。见表1。
表1 四组小鼠超声心动图参数LVEF、LVESD、LVEDD的比较Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters LVEF，LVESD and LVEDD among four groups of mice ±s
表1 四组小鼠超声心动图参数LVEF、LVESD、LVEDD的比较Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters LVEF，LVESD and LVEDD among four groups of mice ±s
注：与WT对照组比较，*P＜0.05；
与WT模型组比较，#P＜0.05
例数8 8 8 8组别WT对照组WT模型组KO对照组KO模型组F值P值LVEF（%）66.92±5.41 45.41±4.52*66.29±4.95 56.71±5.09#13.282＜0.001 LVESD（mm）0.298±0.042 0.477±0.061*0.301±0.046 0.389±0.038#11.922＜0.001 LVEDD（mm）0.471±0.051 0.672±0.084*0.480±0.048 0.545±0.060#9.484＜0.001
2.3 四组小鼠血清中心衰标志物NT-proBNP的Elisa检测四组小鼠血清NT-proBNP水平的比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较如下：WT模型组小鼠的血清NT-proBNP水平高于WT对照组（P＜0.05）；
KO对照组小鼠的血清NT-proBNP水平与WT对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
KO模型组小鼠的血清NT-proBNP水平低于WT模型组（P＜0.05）。见图2。
2.4 四组小鼠HW/BW、LVW/HW的比较四组小鼠HW/BW、LVW/HW的比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较如下：WT模型组小鼠的HW/BW、LVW/HW高于WT对照组（P＜0.05）；
KO对照组小鼠的HW/BW、LVW/HW与WT对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
KO模型组小鼠的HW/BW、LVW/HW低于WT模型组（P＜0.05）。见表2。
表2 四组小鼠HW/BW、LVW/HW的比较Tab.2 Comparison of HW/BW and LVW/HW among four groups of mice ±s
表2 四组小鼠HW/BW、LVW/HW的比较Tab.2 Comparison of HW/BW and LVW/HW among four groups of mice ±s
注：与WT对照组比较，*P＜0.05；
与WT模型组比较，#P＜0.05
例数8 8 8 8组别WT对照组WT模型组KO对照组KO模型组F值P值HW/BW 0.231±0.031 0.377±0.042*0.228±0.034 0.293±0.031#9.392＜0.001 LVW/HW 0.193±0.022 0.284±0.032*0.201±0.025 0.237±0.029#15.283＜0.001
2.5 四组小鼠心肌病理改变的HE染色检测WT模型组与KO模型组小鼠心肌组织中细胞排列规则、间质未见明显炎症细胞浸润；
WT模型组小鼠心肌组织中细胞排列混乱，有水肿现象，肌纤维明显增粗；
KO模型组小鼠心肌的病理改变较WT模型组小鼠明显改善。见图4。
2.6 四组小鼠血清中炎症因子含量的Elisa检测及心肌中炎症因子表达水平的PCR检测四组小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较如下：WT模型组小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平均高于WT对照组（P＜0.05）；
KO对照组小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平与WT对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
KO模型组小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表达水平均低于WT模型组（P＜0.05）。见表3。
表3 四组小鼠血清中炎症因子含量及心肌中炎症因子表达水平的比较Tab.3 Comparison of the content of inflammatory factors in serum and the expression level of inflammatory factors in myocardium among four groups of mice ±s
表3 四组小鼠血清中炎症因子含量及心肌中炎症因子表达水平的比较Tab.3 Comparison of the content of inflammatory factors in serum and the expression level of inflammatory factors in myocardium among four groups of mice ±s
注：与WT对照组比较，*P＜0.05；
与WT模型组比较，#P＜0.05
组别WT对照组WT模型组KO对照组KO模型组F值P值例数8 8 8 8血清炎症因子水平（ng/mL）IL-1β 3.12±0.66 7.58±0.94*3.04±0.57 4.74±0.61#15.832＜0.001 IFN-γ 1.84±0.32 3.94±0.52*1.77±0.26 2.44±0.29#12.774＜0.001 TNF-α 5.41±0.84 9.19±1.21*5.72±0.94 7.74±1.09#11.928＜0.001心肌炎症因子mRNA表达IL-1β 1.00±0.12 1.88±0.25*1.09±0.14 1.40±0.20#10.284＜0.001 IFN-γ 1.00±0.15 2.31±0.32*0.96±0.15 1.62±0.22#18.832＜0.001 TNF-α 1.00±0.19 2.03±0.26*1.04±0.17 1.49±0.19#12.382＜0.001
2.7 四组小鼠心肌中STAT3活化的免疫印迹检测四组小鼠心肌中p-STAT3表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。两两比较如下：WT模型组小鼠心肌中p-STAT3的表达水平高于WT对照组（P＜0.05）；
KO对照组小鼠心肌中p-STAT3的表达水平与WT对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；
KO模型组小鼠心肌中p-STAT3的表达水平低于WT模型组（P＜0.05）。见图5。
CHF的临床诊疗缺少针对病理生理机制的治疗手段，主要与疾病的发病机制未明相关，虽然心肌重构、炎症细胞浸润、胶原代谢异常等与CHF病情进展的关系受到一致认可[9-10]，但相关的调控机制仍未明确，因而也缺乏能够预防或延缓CHF病理进程的治疗靶点。
近些年，慢性炎症反应在多种心血管疾病中的作用受到广泛关注，炎症反应激活不仅直接促进心肌中炎症细胞的浸润、导致心肌损伤及间质纤维化，还参与氧化应激、细胞凋亡、胶原代谢等过程的调控，进而加重心肌损伤及间质纤维化[11-13]。CHF相关的临床研究证实血清中炎症因子IL-8、TNF-α、IFN-γ等增多与患者心功能减退、预后不良有关[14-16]；
相关的动物实验证实多种改善心功能的药物能够在CHF模型中减轻心肌炎症反应，抑制心肌中IL-8、TNF-α、IFN-γ等炎症细胞因子的释放[17-18]。在众多与CHF发病相关的炎症细胞因子中，IL-8的表达广泛、生物学作用多样，本研究在腹主动脉缩窄诱导的CHF模型小鼠中观察到心肌IL-8的表达水平明显增加，在此基础上将深入研究IL-8高表达在CHF发病中的作用及机制。
CHF模型小鼠的心肌中IL-8呈高表达趋势，为了研究IL-8的生物学作用，本研究通过LoxP-Cre系统进行了心肌中IL-8的特异性敲除，在特异性敲除心肌中IL-8的表达后进行CHF造模并通过超声心动图检测、NT-proBNP检测观察心功能的情况。单纯进行心肌中IL-8的敲除后，小鼠的心功能正常，表明在生理条件下IL-8表达缺失并不直接影响心功能；
在特异性敲除心肌IL-8并造模后，小鼠的各项心功能指标与野生型CHF模型小鼠比较明显改善，表明心肌特异性IL-8敲除能够改善CHF小鼠的心功能，进而提示CHF小鼠心肌中IL-8表达增加与心功能的减退有关。
IL-8是具有广泛生物学作用的细胞因子，参与炎症反应、组织纤维化、细胞存活和凋亡等调控，抑制IL-8能够在心肌缺血再灌注过程中起到抗炎、抗凋亡、抑制纤维化等保护作用。在CHF的发病过程中，心肌中高表达的IL-8也可能发挥调控炎症反应、组织纤维化的生物学功能，进而导致心肌重构及心功能减退[19-21]。本研究在特异性敲除心肌IL-8并造模后观察到心肌组织中CHF相关的病理改变较野生型CHF小鼠减轻，同时心肌中炎症因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α的表达较野生型CHF小鼠降低，表明心肌特异性IL-8敲除能够减轻CHF小鼠的心肌病理改变及炎症反应，这为IL-8在CHF发病过程中调控心肌病理改变提供了直接的实验证据。
本研究还将通过心肌特异性IL-8敲除实验初步探索IL-8参与CHF发病的相关分子机制。IL-6、IL-8、IL-35等白介素的生物学作用与下游STAT3通路密切相关，在细胞因子的持续作用下细胞内的STAT3会磷酸化为p-STAT3，后者具有转录调节作用，能够通过NF-κB增加多种炎症因子的表达、促进炎症反应的级联放大[5，22]。在CHF的发病过程中，STAT3呈过度活化的趋势；
多种具有改善心功能的药物能够抑制STAT3的磷酸化并发挥治疗作用。本研究在特异性敲除心肌IL-8并造模后观察到心肌组织中p-STAT3的表达水平与野生型CHF模型小鼠比较明显降低，表明心肌特异性IL-8敲除对STAT3的磷酸化活化具有抑制作用，进而提示IL-8可能通过STAT3在CHF的发病中发挥生物学作用。
综上所述，CHF发病过程中心肌IL-8表达明显增加；
心肌特异性IL-8敲除显著改善CHF小鼠的心功能及心肌炎症反应，IL-8敲除的上述改善作用可能与抑制STAT3磷酸化活化有关。未来，IL-8/STAT3途径有望成为研究CHF发病机制的新靶点，以IL-8为靶点、也可作为靶向防治CHF的新方向。
