烟草腺毛优势表达基因NtMYB108b的克隆及分析

余 婧，赵会纳，闫筱筱，郭玉双，王召军，余世洲，王 兵，雷 波*

1.贵州省烟草科学研究院 烟草行业烟草分子遗传重点实验室，贵阳市观山湖区龙滩坝路29号 550081 2.河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95号 450002

表皮毛为植物表皮细胞突起的特殊结构，通常分为分泌型和非分泌型。分泌型表皮毛（腺毛）能特异合成和储存多种类型的次生代谢物，在防御食草动物和病原体等生物胁迫以及应对紫外线照射、强光或干旱等非生物胁迫中发挥着重要的作用［1-3］。此外，腺毛还是特殊次生代谢物合成的“细胞工厂”［3-4］，薄荷（Mentha spicata）、薰衣草（Lavandula angustifolia）、青蒿（Artemisia annua L.）等植物的腺毛分泌物是生产香精香料或有效药物成分的原料［5-8］。烟草（Nicotiana tabacum L.）的腺毛占总表皮毛数量的85%左右［9］，其特异合成的类西柏烷二萜、蔗糖酯等分泌物是烟叶香味和香气的前体物质，对烟叶的香气品质有积极影响［10-11］。

转录因子（Transcription factors，TFs）是一类结合在启动子上的特异蛋白，可激活（或抑制）靶基因在特定的时间或空间表达［12］。研究表明，MYB、MYC和WRKY等一些在植物腺毛中优势（或特异）表达的转录因子可调控腺毛的发生、发育或次生代谢物的合成与分泌。Xu等［13］研究发现，番茄（Solanum lycopersicum）SlMYC1基因参与了VI型腺毛形成和萜烯的生物合成；
Wang等［14］的研究表明，MsYABBY5基因在薄荷腺毛中特异表达并负向调控萜烯类物质的合成；
Qin等［6］研究发现，在青蒿中AaMYB17基因的过表达可增加分泌型腺毛的密度并增加青蒿的青蒿素含量。其中，MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，根据MYB保守结构域重复的数量可分为1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB（R1R2R3-MYB）和4R-MYB 4个类型［15-16］。R2R3-MYB是MYB转录因子最大的亚家族，通常分为22个亚组，每个亚组成员功能相似［15，17］。目前，R2R3-MYBs在烟草中的生物学功能已有报道，如NtMYB44b基因能响应ABA等激素诱导并对干旱胁迫产生应答［18］；
NtMYB4基因是调节烟草类黄酮生物合成的关键基因，并且在盐胁迫响应中发挥着重要作用［19］；
NtMYB12基因通过正向调控NtCHS等黄酮醇生物合成途径中结构基因的表达，增加黄酮醇的含量并增强烟草对低磷胁迫的耐受性［20］。然而，MYB108-like基因在植物腺毛中相关功能的研究还鲜见报道。

本实验室前期以烟草K326叶片、去腺毛叶片和腺毛为材料，获得了3者的比较转录组数据，发现18个注释为MYB的基因在腺毛中上调表达明显，其中5个注释为MYB108，然而这些MYB108基因在烟草中的生物学功能仍未知。为此，从栽培烟草K326腺毛的cDNA中克隆NtMYB108b基因，对其进行生物信息学分析并检测NtMYB108b基因在烟草不同组织中的相对表达量，同时分析叶片中NtMYB108b基因在响应SA等激素处理和干旱胁迫后的表达情况，旨在为揭示NtMYB108b基因的功能奠定基础。

1.1 实验材料及样品采集

实验材料为烟草（Nicotiana tabacum L.）K326。苗期培养条件为：16 h光照/8 h黑暗，温度（25±2）℃，相对湿度60%。烟苗在5月上旬移栽大田，按当地栽培措施进行管理。使用Harada等［21］的冻刷法，用液氮速冻烟草叶片，然后用毛刷轻轻刮下腺毛备用，去除腺毛的叶片即为去腺毛叶片。采集苗期、团棵期、旺长期、现蕾期和成熟期植株叶片用于检测NtMYB108b基因在不同生育期的相对表达量；
采集现蕾期植株的顶叶、上二棚叶、腰叶、下二棚叶和脚叶用于检测NtMYB108b基因在不同叶位中的相对表达量；
采集苗期植株的根、茎及盛花期植株的花、叶和腺毛组织用于检测NtMYB108b基因在不同组织中的相对表达量。分别向苗期植株叶片喷洒乙烯利（ET，5 mmol/L）、茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol/L）、水杨酸（SA，50 mg/L）、赤霉素（GA，100 mg/L）和脱落酸（ABA，10 μmol/L），并分别在喷洒后第0、6、12、24和48 h采集样品用于检测NtMYB108b基因的激素处理响应；
使用浓度为100 g/L的聚乙二醇（PEG-6000）浇灌根部模拟干旱胁迫，分别于处理后第0、2、4、8和16 d采 集 叶 片 组 织 用 于 检 测NtMYB108b基因的干旱胁迫响应。每组试验设置3次生物学重复。上述材料采集后用液氮速冻，保存于-80℃冰箱中备用。

1.2 实验方法

1.2.1 NtMYB108b基因克隆

根据K326腺毛转录组测序数据，初步获得NtMYB108b基因的全长CDS序列。分别采用EasyPure®Plant RNA Kit、TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit（北京全式金生物技术有限公司），从烟草腺毛中提取总RNA并反转录成cDNA。使用2×TransStart®KD Plus PCR SuperMix Kit（北京全式金生物技术有限公司）从cDNA中扩增目的基因，引物序列见表1。PCR反应条件：94℃预变性5 min；
94℃变性30 s，55℃退火30 s，68℃延伸50 s，共35个循环；
68℃延伸10 min。反应产物于1%琼脂糖凝胶电泳后将目的条带回收，连接至中间克隆载体pEASY-Blunt Zero（北京全式金生物技术有限公司）并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2 生物信息学分析

使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质分子量、等电点等理化性质；
采用Protscale（https：//web.expasy.org/protscale/）预测蛋白的亲/疏水性；
使用TMHMM（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）预测蛋白跨膜结构；
分别 使 用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）预测蛋白的二、三级结构；
SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）用于预测蛋白结构域；
Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plantmulti/）用于预测蛋白的亚细胞定位；
使用DNAMAN软件比对分析氨基酸序列；
使用MEGA 6.0软件，在p-distance模型下，采用Neighbor-Joining（NJ）算法构建系统进化树，bootstrap设置为1 000次重复。

1.2.3 实时荧光定量PCR实验

使用ViiA7荧光定量PCR仪（美国ABI公司）检测NtMYB108b基因在烟草中的相对表达情况。β-Actin为内参基因，qRT-PCR试剂盒为日本TAKARA公司生产的TB Green®Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time），反应程序为：95℃预变性30 s；
95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸34 s，40个循环。用于qRT-PCR的引物信息见表1。反应结束后用公式2-ΔΔCT计算基因的相对表达量［22］。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR amplification

2.1 NtMYB108b基因的CDS序列扩增及分析

M.DL2 000 DNA Marker；
1.NtMYB108b基因PCR扩增片段图1 NtMYB108b全长CDS序列的PCR产物Fig.1 PCR production of NtMYB108b full-length CDS

以栽培烟草K326的腺毛cDNA为模板进行PCR扩增，获得NtMYB108b（LOC107809713）长度为828 bp的CDS序列（图1、图2），编码蛋白长度为275个氨基酸（图2）。Protparam分析结果显示，NtMYB108b蛋白的分子式为C1365H2113N417O443S11，相对分子质量31.81 kDa，理论等电点PI 5.82，不稳定系数为（Ⅱ）53.24，属于不稳定蛋白，总平均亲水性系数为-0.903。采用ProtScale在线工具进一步分析NtMYB108b蛋白的亲/疏水性，发现其亲水区域（负值）多于疏水区域（正值），表明NtMYB108b是一种亲水性蛋白（图3A）。TMHMM跨膜结构预测表明，NtMYB108b蛋白不存在跨膜区域（图3B）；
Plant-mPLoc预测NtMYB108b蛋白定位于细胞核。利用SOMPA分析NtMYB108b蛋白的二级结构（图4），发现其无规则卷曲含量最高，占50.91%，其次是α-螺旋（38.55%）、延伸链（6.54%）和β-转角（4.00%）。三维结构预测结果如图5所示，NtMYB108b蛋白具有螺旋-转角-螺旋的结构特征，这与二级结构预测结果（其富含无规则卷曲及α-螺旋）一致。蛋白结构域分析发现，NtMYB108b的N端有两个SANT保守结构域，分别由51个（第13～第63位）和49个（第66～第114位）氨基酸组成，其C端第146～第182位氨基酸处有一个低复合物区域（图6），推测NtMYB108b属于R2R3型MYB转录因子。

图2 NtMYB108b全长CDS序列及其编码氨基酸序列Fig.2 Sequences of full-length CDS and amino acids of NtMYB108b

图3 NtMYB108b蛋白亲/疏水性及跨膜结构分析Fig.3 Hydrophilic/Hydrophobicity and transmembrane structure analyses of NtMYB108b protein

2.2 多重序列比对及进化树分析

根据2.1中蛋白结构域的预测结果，NtMYB108b属于R2R3型MYB转录因子（图6），从在线网站https：//www.arabidopsis.org/上下载拟南芥（Arabidopsis thaliana）126个R2R3-MYB的氨基酸序列并与NtMYB108b共同构建系统进化树，根据Stracke等［23］的报道进行分组，结果如图7所示，NtMYB108b与拟南芥S20亚组成员AtMYB108、AtMYB78、AtMYB112等聚为一支。从进化树分析结果可以预测，NtMYB108b与S20亚组成员的生物学功能相似。将NtMYB108b的氨基酸序列在NCBI中进行Blastp比对分析，结果显示，NtMYB108b与其他茄科烟草属的MYB108、马铃薯StMYB108以及番茄SlMYB78等的氨基酸序列相似度较高，其中，与绒毛状烟草NtomMYB108的相似度最高，为100.00%。选择与NtMYB108b相似度较高的物种及其氨基酸序列与拟南芥S20亚组成员一起进行多序列比对并构建系统树化树，多重序列比对结果如图8所示，这些MYB108-like蛋白在N端含有高度保守的R2R3-SANT结构域，而C端的差异较大，这符合R2R3型MYB转录因子的典型特征。将图8中的氨基酸构建进化树，发现NtMYB108b与绒毛状烟草NtomMYB108在同一分支（图9）且它们的序列相似性为100.00%，说明NtMYB108b很可能来源于其祖先种绒毛状烟草。

图4 NtMYB108b蛋白二级结构预测Fig.4 Prediction on secondary structure of NtMYB108b protein

图5 NtMYB108b蛋白三级结构预测Fig.5 Prediction on tertiary structure of NtMYB108b protein

图6 NtMYB108b蛋白结构域分析Fig.6 Domains of NtMYB108b protein

图7 NtMYB108b与拟南芥R2R3-MYB蛋白的系统进化树Fig.7 Phylogenetic tree for NtMYB108b and Arabidopsis R2R3-MYB proteins

图8 不同物种MYB108-like氨基酸序列比对分析Fig.8 Multi-sequence alignment of MYB108-like amino acids of different species

图9 不同物种MYB108-like氨基酸序列进化树分析Fig.9 Phylogenetic tree for MYB108-like amino acids of different species

2.3 NtMYB108b基因在不同组织中的表达分析

使用qRT-PCR方法调查NtMYB108b基因在烟草不同生育期及不同叶位叶片中的表达情况，发现NtMYB108b基因在团棵期叶片中的相对表达量较高，在旺长期时表达量较低（图10A）；
现蕾期时，NtMYB108b基因在顶叶、上二棚叶、腰叶、下二棚叶和脚叶5个叶位叶片中的表达量没有显著差异（图10B）。在烟草根、茎、花、叶和腺毛中均检测到NtMYB108b基因的表达（图10C），但不同组织的表达量不同，其中NtMYB108b基因在腺毛中的相对表达量最高，达94.39，而在叶片中的相对表达量为1，这与本实验室前期获得的转录组数据结果一致，即NtMYB108b基因在叶片的腺毛中优势表达；
NtMYB108b基因在根、茎和花中的相对表达量分别为17.42、5.79和66.49，在花中的表达量较高，仅次于腺毛。

图10 NtMYB108b基因的组织表达分析Fig.10 Relative expression level of NtMYB108b gene in different tissues

2.4 NtMYB108b对激素处理及干旱胁迫的响应

NtMYB108b基因在ET处理后第6、12、24和48 h均能被强烈诱导，在第12 h时相对表达量最高，为18.28（图11A）；
SA处理后第6 h，NtMYB108b基因表达上调，在第12 h时达到峰值，相对表达量为14.16，在第24 h时显著下调（图11C）。当采用PEG-6000模拟干旱胁迫时，NtMYB108b基因的表达量在处理后第2 d时显著升高，此时其相对表达量为15.12，在处理后第4和8 d时有所下降（图11F）。而经MeJA、GA和ABA处理后，NtMYB108b基因的表达量较未处理时（0 h）相比并无显著差异（图11B、图11D、图11E）。上述结果说明，NtMYB108b基因能被ET、SA及干旱胁迫所诱导，而对MeJA、GA和ABA的处理则无响应。

图11 NtMYB108b基因在不同激素处理及干旱胁迫后的表达分析Fig.11 Relative expression level of NtMYB108b gene under different hormone or drought stress treatments

从烟草品种K326的腺毛cDNA中克隆了NtMYB108b基因的CDS序列，经生物信息分析，NtMYB108b基因编码蛋白属于R2R3-MYB型转录因子（图6、图8），来源于其祖先种绒毛状烟草。相同R2R3-MYB亚组成员的基因功能具有一定相似性［15，17］，如AtMYB11、NtMYB12、GhMYB1a等S7亚组成员调控类黄酮的生物合成［15，20，24］，S9亚组成员MIXTA-like转录因子参与植物表皮细胞的生长发育［1，7］，S1亚组成员是蜡质生物合成的调控因子［25-26］。本研究中发现NtMYB108b属于S20亚组成员（图7），从系统进化树分析结果可初步推测NtMYB108b基因的功能与S20亚组成员相似，该组成员主要参与植物器官衰老、萜类物质合成、胁迫响应等过程［27-30］。Li等［28］对丹参（Salvia miltiorrhiza）的110个R2R3-MYB转录因子进行了全基因组分析，预测S20亚组成员是萜类物质生物合成的调控因子，因此，NtMYB108b可能是烟草中参与萜类物质合成的潜在调控基因。

本研究中发现NtMYB108b基因在烟草腺毛中优势表达，在花中的表达量略低，说明NtMYB108b在烟草腺毛及花中可能有更重要的生物学功能。此外，根据Zhang等［30］的研究，月季（Rosa hybrida）RhMYB108基因在衰老的花瓣中高水平表达，同时通过ET和JA信号通路可靶向调节衰老相关基因并调节花瓣的衰老。本研究中发现NtMYB108b基因在ET诱导后表达上调（图11A），且在花中的表达量也较高（图10C），初步推测NtMYB108b基因通过ET信号途径，参与了花瓣的衰老。在激素处理及干旱胁迫的实验中观察到了NtMYB108b基因在ET、SA及干旱胁迫处理后均显著上调表达（图11A、图11C、图11F），这些结果暗示NtMYB108b基因在生物及非生物胁迫的调控中起着重要作用，并且可能与ET和SA信号途径有关。此外，NtMYB108b基因对腺毛发育调控激素MeJA［1，5，31］和GA［32］的处理无响应（图11B、图11D），推测该基因可能不参与调控烟草腺毛起始或伸长。

从烟草K326的腺毛中克隆了NtMYB108b基因的全长CDS序列，其开放阅读框为828 bp，编码275个氨基酸。NtMYB108b蛋白定位于细胞核，属于R2R3-MYB转录因子S20亚组成员，来源于其祖先种绒毛状烟草。NtMYB108b基因在叶片中的相对表达量为1，在腺毛及花中的相对表达量分别为94.39和66.49，表明NtMYB108b在烟草腺毛及花中发挥着重要的生物学功能。激素及干旱胁迫实验进一步说明NtMYB108b的功能可能涉及ET、SA信号转导及干旱胁迫。

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