羧甲基茯苓多糖对香菇贮藏保鲜效果的影响
时间：2023-01-16 21:10:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
姚韶华，程雅清，武若楠，臧瑞祥，李新伟，雷于国，刘启燕，胡国元*
1. 武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉 430205；
2. 湖北裕国菇业股份有限公司，湖北随州 441300；
3. 湖北省农业科学院经济作物研究所，湖北武汉430070
羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachyman，CMP）的制备多采取从茯苓菌核中提取或从茯苓发酵液提取的茯苓多糖经化学修饰的方法，本实验室建立了通过茯苓发酵直接制备CMP 的方法［1-2］。大量文献报道CMP 具有免疫调节、抑菌、抗氧化、调节小鼠肠道菌群的生态平衡和减轻结肠损伤的作用［2-4］。CMP 目前在食品保鲜领域上应用还鲜有报道。
香菇是我国食用菌年产量最大的单品［5］。由于新鲜的香菇采后含有较高的水分，新陈代谢旺盛，营养物质消耗快，易受到机械伤害，引起子实体的褐变或腐败变质，影响其药用和食用价值，带来了巨大的经济损失［6］。目前多糖类生物保鲜剂在香菇保鲜研究领域受到青睐。有研究发现多糖类保鲜剂涂膜处理香菇后，在贮藏期内延缓了香菇营养品质的下降，同时对香菇体内多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性起到抑制作用［7-8］。PPO 是果蔬酶促褐变的主要酶类，同样也是导致香菇褐变的主要酶类，褐变对香菇的色泽及感官品质都有很大的影响，因此在香菇保鲜范畴内对它的研究是相当重视［9］。
为提高贮藏期内新鲜香菇的商品和食用价值，延长香菇货架期，减少经济损失［10-11］。本研究通过探究CMP 对香菇体内PPO 体外酶活的抑制作用，初步确定CMP 对香菇保鲜试验的有效性和保鲜试验所用CMP 浓度，通过不同浓度的CMP 处理香菇，研究其对香菇保鲜效果的影响，找到最佳的CMP 保鲜浓度，并对CMP 的应用提供了一条新途径。
1.1 材料与试剂、仪器
1.1.1 材料与试剂 茯苓菌株Z1 由湖北省中医药研究院王克勤研究员惠赠，本实验室进行保藏。
香菇子实体（菌种号为0912）由湖北省农业科学院经济作物研究所提供。
3，5-二硝基水杨酸（成都科龙化工试剂厂）；
没食子酸、福林酚、Na2CO3、无水乙醇（天津博迪化工股份有限公司）；
葡萄糖、琼脂、酵母浸粉、蛋白胨、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、无 水乙醇、2，6-二氯靛酚（质量分数97%）、苯酚、考马斯亮蓝G-250（麦克林）。以上试剂均为分析纯。
1.1.2 主要仪器 紫外分光光度计：T6 新世纪（北京普析通用仪器有限责任公司）；
冰箱：LSC-288G（浙江星星冷链集成股份有限公司）；
循环水式真空泵：SHZ-D（Ⅲ）（河南省予华仪器有限公司）；
旋转蒸发器：RE-52A（上海亚荣生化仪器厂）；
电热恒温鼓风干燥箱：DHG-9053A（上海精宏实验设备有限公司）；
高速冷冻离心机：Multifuge X1R［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；
高压蒸汽灭菌锅：LDZX-50KBS（上海申安医疗器械厂）；
超净工作台：SW-CJ-2FD（苏州净化设备有限公司）；
台式全温振荡培养箱：MQT-60R（上海旻泉仪器有限公司）；
恒温培养箱：GNP-9080（上海精宏实验设备有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 香菇预处理 自湖北省农科院采摘的香菇，当天运回实验室进行分拣，去除田间热。选择未开伞、大小均匀、色泽黄褐、无破损、无畸形、无病虫危害的香菇。
1.2.2 CMP 的发酵及制备 参考文献［1］方法：茯苓菌种活化→茯苓液体种子制备→CMP 发酵→过滤收集发酵液上清→浓缩→醇沉→离心→沉淀物烘干→CMP 粗品→Sevage 法除蛋白→取上清烘干→CMP 样品，备用。
1.2.3 多酚氧化酶活性的测定 （1）香菇多酚氧化酶的提取。参考文献［12］方法：取1.0 g 香菇样品，加入pH 7.0 磷酸盐缓冲液3.0 mL，在冰浴条件下研磨匀浆并转移到离心管中，再用7.0 mL 磷酸盐缓冲液冲洗研钵，合并提取液静止40 min，4 ℃下10 000 r/min 离心10 min，上清液即为PPO 粗提液，收集并于4 ℃冰箱保存待用。
（2）CMP 溶液对香菇多酚氧化酶体外活性抑制作用的测定。分别向试管中加5 mL pH 值7.0的磷酸缓冲液（0.05 moL/L），分别加入1 mL 2、4 、6、8、10 mg/mL 的CMP 溶液，40 ℃温 度 下水 浴10 min 后，加入预热的酶液1 mL，平衡10 min，然后加入1 mL 预热邻苯二酚（0.3 mol/L），开始计时，每30 s 记录1 次OD420 随时间的变化值，以最初直线段的斜率计算酶活力。以未加酶液为对照组，以未加CMP 溶液组的酶活为起始酶活。一个酶活力单位定义为在测定条件下，每分钟引起光密度值改变0.001 所需的酶量［9，13-14］，CMP 溶液处理前后酶活变化以酶活抑制率表示，并以CMP 质量浓度为X轴，以孢子萌发抑制率为Y轴绘制拟合曲线并建立抑制率回归方程。
1.2.4 保鲜试验设计 将香菇随机分成4 组，每组25 个样品，分别用3 个不同质量浓度的CMP 溶液喷洒香菇表面20 s，即5、10、20 mg/mL CMP 溶液处理组实验。不做任何处理对照组（control check，CK）。处理结束后，自然晾干表面水分，将4 组香菇分别装入保鲜袋中放置于4 ℃冰箱中贮藏，每4 d 分别从每组取样测定其感官品质、可溶性蛋白、还原糖、总糖和抗坏血酸（vitamin C，VC）质量浓度，各项指标重复测定3 次。
1.2.5 保鲜试验测定指标 （1）香菇感官品质评分指标测定。参考高帅平等［15］的感官品质评分标准，并且固定5 人每4 d 对香菇的感观品质进行评分，从色泽，硬度，气味，开伞度分别评价，权重依次为30%，30%，30%，10%。
（2）可溶性蛋白含量测定。参考Huang 等［16］方法：采用考马斯亮蓝法测定，用牛血清白蛋白为标准蛋白。准确称取1.0 g 香菇，加入10 mL 磷酸缓冲液（pH=7），冰浴中充分研磨，离心。吸取上清液1 mL 于试管中，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置5 min 后测定595 nm 下的吸光值，并通过标准曲线计算待测样品提取液中蛋白质的含量。
（3）还原糖和总糖含量测定。样品处理参考姜天甲［17］的方法，还原糖标曲的制备参考国标法NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的测定3，5-二硝基水杨酸比色法》，总糖标曲的制备参考国标法SN/T 4260-2015《出口植物源食品中粗多糖的测定苯酚-硫酸法》。取上清液，按照与制作标准曲线相同的方法操作，并通过标准曲线计算待测样品提取液中总糖和还原糖的含量。
（4）VC 含量测定。样品处理参考姜天甲［17］的方法，采用2，6-二氯靛酚法［16］进行测定。
（5）总酚含量测定。样品处理及测定参考姜天甲［17］的方法。样品处理：称取5 g 样品于研钵中，加入10 mL 预冷的质量分数80%乙醇充分研磨后倒入锥形瓶中，摇床摇动20 min，充分提取，离心，吸取上清液1 mL，按照与制作标准曲线相同的方法操作，760 nm 测定其吸光值，计算总酚含量。
1.3 数据分析
采用Excel 2016 计算出各指标含量，结果以“均值±标准差”表示，采用Origin 2019 绘制作出柱形图，采用GraphPad Prism 5 绘制折线图同时进行数据间差异性分析。
2.1 不同质量浓度CMP 溶液对香菇多酚氧化酶体外酶活的影响
用香菇多酚氧化酶体外酶活实验来检测CMP溶液对香菇PPO 体外酶活的是否具有抑制效果，根据图1（a）结果所示，CMP 对香菇PPO 体外酶活具有抑制作用。并拟合CMP 溶液对香菇PPO 体外酶活抑制率的回归方程为Y=4.442 5X+ 30.398，R2=0.952 5。根据抑制率回归方程计算得到CMP溶液对香菇PPO 体外酶活的IC50=4.41 mg/mL，IC90=13.42 mg/mL。为后续实验提供依据。
2.2 不同质量浓度CMP 溶液处理对香菇感官品质的影响
香菇采后自身代谢活动依旧活跃，受外界的影响对其外观及气味都有一定的影响，感官指标是评价商品品质好坏的重要指标之一，直接影响着商品价值［15］。贮藏期间香菇的感官指标变化如图1（b）所示，在贮藏期间处理组均高于对照组，CMP 溶液处理组香菇的感官评分与对照组感官评分相比具有显著性差异（P＜0.05）。结果表明CMP溶液处理组对香菇感官评定具有一定的效果，其中10、20 mg/mL CMP 溶液处理组效果更好些（P＜0.05），有利于香菇贮藏期的延迟。
2.3 不同质量浓度CMP 溶液处理对香菇可溶性蛋白含量的影响
香菇在采后贮藏期间，蛋白质会在蛋白酶的作用下分解产生氨基酸和多肽，同时会释放菇体生命活动所需的能量，随着贮藏时间的延长进一步衰老，蛋白质含量呈现下降趋势低［18］。蛋白质含量的高低影响着香菇的营养价值，也在一定程度上反映了机体的抗氧化水平。由图2（a）可知，香菇可溶性蛋白质含量随着贮藏期的延长呈下降趋势。处理组香菇蛋白质贮藏前期（4~12 d）下降速率缓慢，对照组贮藏期在4 d 后开始急速下降，其主要原因可能是贮藏前期处理组香菇的蛋白质分解代谢低于对照组。贮藏前期对照组可溶性蛋白含量高于处理组可能跟香菇自身的水分散失有关［19］。贮藏期达到第20 d 时，5、10、20 mg/mL CMP 溶液处理组分别是对照组的139.82%、145.01%、186.58%。结果表明20 mg/mL CMP 溶液与对照组相比能够有效抑制可溶性蛋白质的分解（P＜0.05），延缓可溶性蛋白质含量的下降速率。
2.4 不同质量浓度CMP 溶液对香菇还原糖和总糖含量的影响
还原性糖是采后呼吸作用的主要底物，随着贮藏时间的延长，机体呼吸作用不断消耗糖类物质，导致香菇的还原糖含量下降，这与腐烂程度也有一定关系［15］，同时也是香菇营养品质指标。由图2（b）可知，香菇还原糖含量随着贮藏期的延长呈下降趋势，处理组在贮藏中期（8~16 d）较对照组来说下降缓慢（P＜0.05），原因可能是香菇体内大分子化合物的分解，促进了小分子还原糖质量分数上升［20］，CMP 5 mg/mL 处理组下降趋势要小于其他处理组，贮藏期20 d 时，5，10，20 mg/mL CMP溶液处理组分别是对照组的220.39%，135.53%，128.25%。说明处理组的香菇与对照组相比能保持较高的还原糖含量，延缓香菇的品质下降。
图2 不同浓度CMP 溶液处理对香菇可溶性蛋白含量（a），还原糖含量（b），总糖含量（c），VC 含量（d），总酚含量（e）的影响Fig.2 Effects of different concentrations of CMP solutions on soluble protein content（a），reducing sugar content（b），total sugar content（c），VC content（d）and total phenol content（E）of L.edodes
总糖在香菇采后贮藏中是其代谢所需营养物质的重要来源，含量的下降是组织衰老的重要指标。贮藏期间总糖含量变化，由图2（c）可知，处理组香菇总糖含量变化呈现先下降后上升的趋势，对照组香菇总糖含量变化呈现下降趋势。处理组总糖含量后期均呈上升趋势，可能是由于喷施的外源多糖对香菇内源糖源产生的影响。贮藏期达到第20 d 时，5，10，20 mg/mL CMP 溶液处理组香菇总糖含量变化分别是对照组的157.36%，146.22%，166.37% 。结果表明，CMP 溶液处理香菇有利于保持较高的香菇总糖含量，提高了香菇的营养品质，其中20 mg/mL CMP 溶液效果最好（P＜0.05）。
2.5 不同质量浓度CMP 溶液处理对香菇VC 含量的影响
贮藏前期VC 含量下降可能与子实体后熟衰老和品质劣变有关［21］，香菇贮藏期间VC 含量变化，由图2（d）可知，处理组香菇VC 含量变化先下降后上升再维持在一定水平，与姜天甲［17］的研究结果一致，对照组VC 含量变化先下降后上升再下降。贮藏前4 d，对照组VC 含量急剧下降，处理组下降缓慢（P＜0.05），前4 d VC 含量急剧下降是由于香菇的呼吸作用及氧化作用的进行［17］，由于香菇后熟过程中伴随着维生素C 的合成代谢，在贮藏初期呈现上升的趋势［22］，随后香菇子实体的维生素C 由于分解代谢，以及抗氧化反应，含量下降［23］。贮藏后期（12 d 后）处理组维持在较高水平，延缓VC 的消耗，贮藏20 d 时，5，10，20 mg/mL CMP 溶液处理组分别是对照组的132%，170%，180%。结果表明：处理组具有延缓香菇中VC 含量效果。
2.6 不同质量浓度CMP 溶液处理对香菇总酚含量的影响
酚类物质许多是木质素合成的前体，食用菌中的酚类物质与其抗氧化活性有一定的关联性，酚类物质的氧化是香菇采后褐变的主要原因，严重影响香菇的商品价值和外观品质［24］。香菇贮藏期间总酚含量变化如图2（e）所示，香菇总酚含量均呈下降趋势，处理组数据高于对照组。贮藏期达到第12 d 时，5，10，20 mg/mL CMP 溶液处理组香菇总酚含量变化分别为是对照组的114.47%，116.46%，121.41%。贮藏期达到第20 d 时，5，10，20 mg/mL CMP 溶液处理组香菇总酚含量变化分别为是对照组的113.65%，95.45%，108.55%。结果表明，20 mg/mL CMP 溶液处理对延缓香菇总酚含量的下降，在贮藏前期具有一定效果（P＜0.05）。
本研究发现CMP 溶液对香菇多酚氧化酶体外酶活具有抑制效果IC50=4.41 mg/mL，IC90=13.42 mg/mL，随后采用CMP 溶液处理香菇，在低温贮藏期间对其营养物质和外观品质进行了测定。结果表明，CMP 溶液处理香菇可以不同程度地提高低温条件下香菇的贮藏品质，可溶性蛋白含量变化与苏倩倩等［18］的研究结果相似，随着贮藏时间的延长，呈现下降趋势。香菇还原糖含量呈下降趋势，是由于子实体呼吸作用不断消耗糖类物质。处理组维持了较高含量的还原糖最高提升了120.39%，说明CMP 溶液处理香菇可以不同程度的对其呼吸作用产生抑制效果，这与陶璐等［25］采用山楂果胶寡糖处理香菇结果一致。处理组总糖后期上升的原因，可能是喷洒的外源多糖对香菇内源糖源造成的影响。贮藏期间处理组香菇VC 含量变化先下降后上升再维持在一定水平，这与姜天甲［17］的结果一致。贮藏前期CMP 溶液处理延缓了香菇总酚含量的下降，说明CMP 溶液的抗氧化性及对香菇多酚氧化酶的抑制作用在香菇贮藏前期有效，后期效果不显著可能是由于香菇自身氧化大于抗氧化能力。CMP 溶液对香菇体内酶活活性的影响，还有待测定。
CMP 溶液对香菇PPO 体外活性具有抑制作用，CMP 溶液处理延缓香菇采后可溶性蛋白、还原糖等营养物质含量的下降，同时延缓香菇的感官评定指标的下降，贮藏前期对延缓总酚含量下降起到作用，从而提高香菇的贮藏品质，延长其货架期。其中20 mg/mL CMP 溶液处理的效果最好，为CMP 的应用发展提供了一条新途径和香菇采后保鲜提供了有效的基础理论与技术的支撑。
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