土壤中抗生素产生菌的分离、鉴定及抗菌活性分析
时间：2023-01-15 16:25:06 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
王淑娟 高翠娟 刘晶晶
（临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276000）
植物病害不仅会影响农作物的产量，降低农作物的品质，还不利于农产品的贮藏、加工和运输，给农民带来巨大损失，严重威胁我国粮食安全［1］。虽然目前应用化学农药是防治植物病害的一种有效方法，但长期、大量使用化学农药不仅会影响植物生长，还会在使用过程中对环境造成污染。随着生活水平的提高，人们越来越重视食品安全和环境保护，对绿色食品要求越来越高，需求量越来越大。而相对于化学农药，农用抗生素具有低毒、高效、无污染、选择性强和安全性高等优势，显然更符合未来植物病害防治的药物应用要求［2-3］。此外，抗生素在药品的开发与应用方面同样具有广阔的前景。人类发展至今从未摆脱过疾病的困扰，且近年来随着环境的恶化和药品的滥用，部分致病菌的耐药性日益增强，新型感染性疾病不断产生与传播，人类面临的疾病威胁越来越多，因此，加快新型高效抗生素的开发十分重要［4］。
土壤中含有丰富的微生物资源。相关研究表明，每克土壤含微生物106～109个，其中细菌数量最多，放线菌的数量仅次于细菌［5］。土壤中部分微生物能产生抗生素、抗真菌剂和免疫抑制剂等多种有用的次生代谢物，如放线菌群和少部分丝状真菌［6］。放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，因其能产生大量抗生素的特性，近年来在微生物及抗菌领域广受关注。放线菌种类很多，常见的主要有两类：一类是其结构组成中没有大量菌丝体，如诺卡氏放线菌；
另一类是由大量菌丝体组成的链霉菌属［7］。因为链霉菌在日常生活中较为常见，其数量占已发现菌种的25%以上，所以也被称为常见放线菌。虽然当前被利用的抗生素大多是由放线菌产生的，但被分离出来的放线菌却很少，仅有0.1%～0.5%，还有很多抗生素产生菌未被发现或分离出来［8-11］。
此次研究从校园土壤中分离抗生素产生菌，对分离出的抗生素产生菌进行菌种鉴定，并通过抑菌试验分析从土壤中分离出的抗生素产生菌对细菌和真菌的抑菌作用，以期进一步探索抗生素产生菌的抑菌作用，为抗生素产生菌的研究提供更多的理论依据。
1.1 供试土壤
供试土壤取自山东省临沂市临沂大学校园内。
1.2 指示菌
指示菌为研究团队所在的膜蛋白与药物工程实验室保存的副溶血球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门氏菌、酿酒酵母、粪链球菌和蜡样芽孢杆菌。
1.3 培养基
高氏1号培养基：可溶性淀粉20.00 g/L、硝酸钾1.00 g/L、氯化钠0.50 g/L、磷酸氢二钾0.50 g/L、硫酸镁0.50 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、琼脂15.00 g/L，pH值7.1～7.5。LB固体培养基：蛋白胨10.00 g/L、肉提取物3.00 g/L、乳糖5.00 g/L、溴麝香草酚蓝0.024 g/L，pH值为6.8～7.2。YPD培养基：酵母膏10.00 g/L、葡萄糖20.00 g/L、蛋白胨20.00 g/L、琼脂15.00 g/L。
1.4 抗生素产生菌的分离纯化
1.4.1 土壤取样。采用五点交叉取样法在营养丰富的土壤中取样。去除表层约2 cm厚的土壤，然后挖取深度在2～10 cm处的土壤，除去杂物（如砾石、残根等），将土样装入烧杯中。土样取回后立即进行后续试验。
1.4.2 制备悬液及梯度稀释。用电子天平称取1.00 g土壤样品，倒入锥形瓶中，加入99 mL无菌水，轻轻摇晃锥形瓶10～20 min，使菌体分布均匀，将锥形瓶标记为10-2g/mL质量浓度的菌悬液，静置0.5 min。再准备4支无菌试管，并在试管上贴上标签纸，对其编号，标签的编号依次为10-3、10-4、10-5、10-6g/mL。在标签为10-3g/mL的试管中，加入4.5 mL无菌水，再加入0.5 mL浓度为10-2g/mL的土壤菌悬液，并用吹吸管吹吸三四次，使菌悬液充分混匀，即得到质量浓度为10-3g/mL的土壤稀释液。10-4、10-5、10-6g/mL质量浓度的土壤稀释液也按此方法配制。需要注意的是，操作过程应严格，防止受到杂菌的污染。
1.4.3 稀释倒平板法分离土壤中目的菌株。分别 取 10-3、10-4、10-5g/mL菌 悬 液1 mL注 入 平 板培养皿内，每个梯度两个平板。取出已配制好的高氏1号培养基，在微波炉中加热使其融化，待其温度冷却至45～50 ℃后倒入培养皿内，微微晃动，使菌落分散均匀；
待其凝固后，将平板倒扣在恒温箱中，28 ℃培养7 d，观察菌落产生情况，并做好记录。
1.4.4 目的菌株菌落的纯化。挑取培养皿上质地紧密、表面呈绒状的菌落或干燥、褶皱、较小的单菌落，接种于高氏1号培养基上进行分离纯化，在培养箱内28 ℃培养7 d，观察菌落表面的形态特征。
1.5 抗菌谱测定
将配制好的LB固体培养基在微波炉中进行加热，待其冷却至室温后倒入培养皿内。待培养基冷却凝固后，用涂布棒将指示菌涂布在培养基上。挖取适量已纯化的目的菌株置于培养基分区的中央，培养1 d后，观察抑菌圈形成情况。
1.6 菌株16S rDNA和18S rDNA序列测定和分析
用细菌引物和真菌引物分别对7种菌株进行PCR扩增，然后进行序列分析。
1.6.1 基因组DNA的提取。采用基因组DNA抽提试剂盒（Ezup柱式）分别提取目的菌株基因组。
1.6.2 PCR扩增。菌种鉴定所用引物如表1所示。PCR反应体系如表2所示。PCR反应程序如表3所示，共进行30个循环。
表1 菌种鉴定所用引物及其序列
表2 PCR反应体系
表3 PCR反应程序
1.6.3 序列测定和分析。将扩增产物用DNA胶回收试剂盒（SanPrep柱式）进行纯化，纯化后的目的片段立即送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将得到的序列用GenBank数据库的BLAST程序进行序列比较分析。
2.1 土壤中抗生素产生菌菌株的分离纯化
挑选从土壤中筛选出的单菌落，以蜡样芽孢杆菌或大肠杆菌为指示菌进行初筛，共筛选出25株抑菌效果明显的菌株。通过分离纯化和分析菌丝形态，发现25株菌株属于7种不同类型菌种，分别编号为S1～S7（见图1）。
图1 土壤中筛选出的7种抗生素产生菌
2.2 16S rDNA与18S rDNA的扩增与菌种鉴定
提取7种菌株的基因组DNA，分别使用16S rDNA、18S rDNA引物进行PCR扩增，PCR结果如图2所示，菌株S1和S2为真菌，S3～S7为细菌。
图2 菌株S1～S7的16S rDNA、18S rDNA扩增结果
将纯化后的目的片段进行测序，得到的DNA序列用BLAST程序进行比较分析，结果如表4所示，7种菌株的形态特征与相关文献描述相符。
表4 7种菌株的鉴定结果
2.3 抗生素产生菌抑菌性分析
为检测7种菌株的抑菌效果，以实验室保存的8种菌株作为指示菌进行抑菌活性分析，结果如表5所示。
表5 7种菌株抑菌活性测定结果
由表5可知，S1、S4、S5、S6、S7菌株对金黄色葡萄球菌生长有较强抑制作用；
蜡样芽孢杆菌可被除S2以外的其余菌株抑制；
S2、S6菌株对大肠杆菌生长有抑制作用；
S3、S4、S6、S7菌株对粪链球菌生长有抑制作用；
S4、S7对酿酒酵母生长有抑制作用；
菌株S1～S7对绿脓杆菌、沙门氏菌和副溶血球菌的生长均没有明显的抑制作用。
土壤中的微生物既存在互惠互利关系，也有敌对关系。土壤中能够产生抗生素的抗性微生物，不仅可抑制病原微生物的生长繁殖，还能防止和减少病原微生物对农作物造成的侵害。通过研究筛选出了7种能产生不同抗生素的菌株，为下一步研究抗生素产生菌的生产性能和新药剂的开发创造了条件。此外，目前关于部分菌株如产红青霉、山丘链霉菌、墨西哥链霉菌和华丽黄链霉菌的报道还较少。研究发现，产红青霉、山丘链霉菌、墨西哥链霉菌和华丽黄链霉菌能抑制多种细菌或真菌生长，这为抗生素产生菌的研究提供了新的方向。
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