吸入氩气对脑缺血再灌注损伤的保护优于氢气的动物实验研究*
时间：2023-01-15 12:30:07 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
薛珂，折佟平，刘泳欣，何娟，张云峰，李霞*
(1 南通大学特种医学研究院，南通 226019；
2 南通大学附属医院神经内科)
脑缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion,CIR)损伤是急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者接受血管再通治疗(静脉或机械取栓术)后常见的临床病理生理现象，其发病机制涉及多个环节，导致在目前高度有效的血管内机械取栓治疗后，许多患者仍存在预后差、出血转化、脑水肿、甚至致死致残等不良转归[1-2]。神经保护剂可有效减少CIR 损伤后的梗死体积、脑水肿、出血转化等，发挥神经保护作用，包括钙离子通道阻滞剂、兴奋性氨基酸受体拮抗剂、抗氧化剂、抗炎免疫调节剂、凋亡抑制剂、突触后致密蛋白抑制剂等[3-4]。但是，大多数神经保护剂都止于临床前和临床研究，导致失败的原因很多，一个主要原因是药物无法透过血脑屏障。
气体神经保护剂，如惰性气体[氙气、氩气(argon,Ar)等]、挥发性麻醉剂、硫化氢、氢气(hydrogen,H2)等，因不受血流阻断和血脑屏障的局限，可以在缺血后的脑组织内自由扩散，作用于缺血核心区和半暗区，成为一类特殊的神经保护剂[5-7]。其中，吸入氩气(inhaled argon,iAr)和吸入氢气(inhaled hydrogen,iH2)的优势最为明显，它们来源充足，价格便宜，临床上容易操作并大量应用，被认为将成为AIS 急救中非常有前景的神经保护剂，但两者疗效相比是否存在差异，尚未见报道。
基于大鼠或小鼠的局灶性大脑中动脉栓塞(transit middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型是CIR 损伤最为常用的研究手段。本研究采用小鼠tMCAO 模型，通过比较再灌注前iAr 和iH2治疗对损伤后神经行为功能的影响[8]，结合2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色对皮层和皮层下脑梗死体积的观察，并进行小鼠体质量和死亡率的记录，为两种气体治疗急性脑梗死的临床转化提供直接的实验依据。
1.1 动物来源及材料 健康成年雄性ICR 小鼠，体质量20～22 g，8～12 周，由南通大学实验动物中心提供。实验前，对小鼠进行3 d 适应性饲养，恒温恒湿，日光灯照明(12 h 照明/12 h 黑暗)。随机将实验动物分为假手术组(Sham 组)、tMCAO 模型组(tMCAO 组)、iAr 治疗组(tMCAO-iAr 组)、iH2治疗组(tMCAO-iH2组)，每组7～20 只。
氩氧混合气(79%Ar/21%O2混合)购于南通天源气体有限公司；
氢氧混合气采用田阳绿谷健康科技有限公司提供的水素发生器(型号BYT-JP-H03)制备，电解纯水后H2∶O2为2∶1。麻醉用2,2,2-三溴乙醇(Avertin)、2-甲基-2-丁醇、TTC(货号T8877)均购于Sigma 公司；
异氟烷购于深圳瑞沃德生命科技有限公司；
其他常规试剂购于上海生工生物。造模用手术器械和线栓均购于美国Doccol 公司。
1.2 实验方法
1.2.1 小鼠tMCAO-再灌注模型 将小鼠经异氟烷麻醉后，取颈正中切口，钝性分离肌肉，暴露右侧颈总动脉(common carotid artery,CCA)、颈外动脉(exteral carotid artery,ECA)和颈内动脉(internal carotid artery,ICA)。用动脉夹暂时夹闭ICA，并系紧CCA 处的松结。离段ECA，使之与ICA 成一直线，在ECA 远心端插入线栓(602345PK5Re,Doccol,USA)。松开ICA动脉夹，将线栓推进至大脑中动脉(middle cerebral artery,MCA)。将线栓与ECA 一起结扎固定，缝合切口。缺血90 min 后，拔出线栓和CCA 上的线。
各组操作如下：Sham 组，离断ECA 后，仅结扎CCA，不插线栓，90 min 后去除CCA 上的线，恢复血流；
tMCAO 组，离断ECA 后，结扎CCA，将线栓从ECA 插入，经ICA 直至MCA，90 min 后拔出线栓及CCA 上的线，恢复血流；
tMCAO-iAr 组或tMCAOiH2组，缺血60 min 后(再灌注前30 min)，将模型小鼠放入密封的带有进气口和出气口的玻璃树脂箱内，通过气体流量控制进气速度(1 L/min)，箱内有O2浓度检测探头，缺血90 min 后将小鼠从箱中临时取出，快速拔出线栓后(≤3 min)，再放回箱中继续处理。tMCAO-iAr 组进气为79%Ar 和21%O2的混合气，tMCAO-iH2组为67%H2和33%O2的电解水混合气，两种气体处理总时长均为3 h。本研究经南通大学实验动物伦理委员会批准(S20190920-303)。
1.2.2 神经功能评分 造模后24 h 采用双盲法进行神经功能评分，从动物毛发、耳朵、眼睛、体位、自发运动、癫痫行为等6 个方面进行评定，最高28 分，评分越高表示神经功能缺损越严重[9]。
1.2.3 TTC 染色测定脑梗死体积 将小鼠麻醉，断头取脑。全脑速冻20 min 后，从前往后作冠状连续切片，厚度2 mm/片，再将脑切片浸泡于2%TTC 染色液中，37 ℃避光恒温水浴，30 min 后，弃去染色液。正常组织染成深红色，梗死区域为白色。将脑片浸泡于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中，4 ℃过夜固定后，脑片按顺序进行扫描。梗死体积占比=各脑片皮层或皮层下白色梗死面积之和/各切片面积之和×100%。
1.3 统计学方法 使用SPSS 25.0 软件进行统计分析。所有实验数据以表示，两组间比较采用独立样本t 检验或配对t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著差(LSD)法，以P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 两种气体治疗对tMCAO 小鼠神经功能评分的影响 与Sham 组相比，tMCAO 组小鼠在再灌注24 h的神经行为损伤严重(P＜0.001)，提示模型成功。与tMCAO 组相比，tMCAO-iAr 和tMCAO-iH2组治疗对神经损伤均有明显改善(均P＜0.001)。两种治疗组间相比，iAr 治疗后小鼠神经功能评分更低(P＜0.05)(图1)。
图1 各组小鼠tMCAO 再灌注后24 h 神经行为学评分比较
2.2 两种气体治疗对tMCAO 小鼠脑梗死体积的影响 TTC 染色法结果显示，Sham 组未见梗死区域，tMCAO 组皮层和皮层下脑梗死体积增加(P＜0.001)。与tMCAO 组相比，iAr 和iH2治疗均显著降低了缺血侧皮层和皮层下的脑梗死体积占比(图2A～C)。相比之下，在皮层，iAr 较iH2的梗死体积明显减少(图2B～E)。
图2 各组小鼠皮层和皮层下脑梗死体积比较
2.3 两种气体治疗对CIR 后小鼠体质量和存活率的影响 Sham 组小鼠术后24 h 体质量损失率很小，与其相比，tMCAO 组的小鼠体质量损失率显著增加，而iAr 和iH2治疗对tMCAO 小鼠的体质量损失显著改善(P＜0.001)；
两种气体治疗组间相比差异无统计学意义(图3A)。Sham 组小鼠全部存活，tMCAO 组小鼠的存活率为84.4%，tMCAO-iAr 组和tMCAOiH2组小鼠的存活率分别为93.4%和92.7%(图3B)。
图3 各组小鼠体质量损失和存活率的比较
本研究基于小鼠tMCAO 模型，结合神经功能评分、脑梗死体积占比和存活率等指标，对iAr 和iH2进行了神经保护作用的比较。不仅证实了高浓度iAr和iH2对CIR 损伤有一定的保护作用，还发现iAr 治疗对CIR 损伤后神经功能的改善和皮层梗死体积的减少均优于iH2，为两种气体，尤其是iAr 在AIS 治疗的临床推广和转化应用提供了重要的实验依据[10-11]。
目前AIS 临床治疗的关键是第一时间血管再通，包括静脉溶栓和血管内机械取栓[1]。但受时间窗的限制，再通后常伴发严重并发症。一直以来，CIR损伤的机制研究和神经保护剂开发都是领域内的研究热点。已有大量的神经保护剂在临床前试验阶段得到充分证实[3]，其中，气体神经保护剂因可在细胞间自由扩散，不受血流中断和血脑屏障的限制，相关报道越来越多，包括氙气、H2、Ar、一氧化氮、硫化氢、麻醉气体等[7]。其中，氙气已在欧美国家用于麻醉、放射、新生儿科，但因气源稀缺昂贵，在我国未得到推广[12]。近十几年来，国内众多研究机构对H2开展了大量的医学相关研究，然而，安全性问题依然是H2临床推广的瓶颈问题。相比而言，Ar 作为空气中占比第三的组分，提取工艺非常成熟，来源充足且价格低廉，作为惰性气体之一，更安全，在包括脑外伤、视网膜缺血、出血性和缺血性脑梗死等在内的多种神经损伤模型中均有显著的神经保护作用[13-14]。此外，iAr 在常压下无麻醉特性，高浓度iAr 不会抑制静脉溶栓药物的溶栓效果，可与临床常用的血管再通策略联合使用，现被认为是一种很有前景的气体神经保护剂[13,15]。
但在现有的报道[6,16]中，多种吸入性气体作为神经保护剂的疗效与其开始使用的时机密切相关。研究[9,17-19]表明，iH2在再灌注前使用比再灌注后治疗产生更好的治疗效果，氙气、一氧化氮等也有类似的报道。本课题组之前的研究[9]表明，血管再通前开始iAr处理比再灌注时进行治疗有更好的保护作用。基于这一点考虑，本研究选择再通前30 min 开始吸入气体的治疗方案进行两种气体保护作用的比较。
iH2神经保护的机制主要包括抗氧化、抗炎、抗凋亡、调节自噬、保护线粒体功能和血脑屏障完整性[11]，而关于iAr 的神经保护机制尚不明确。最近的研究[20]发现，iAr 治疗能促进小胶质细胞/巨噬细胞向抗炎性M2 型极化，减轻脑缺血再灌注损伤后神经炎症，发挥神经保护作用。但脑内固有免疫细胞小胶质细胞M1 型/M2 型的极化随脑缺血再灌注损伤会发生动态变化，单纯促进向M2 型极化或者抑制其向M1型极化并不能起到神经保护作用，正如一些神经炎症的抑制剂对AIS 的保护作用以失败告终一样。因此，iAr 对炎性细胞极化的调控机制也不能简单地归结于调控其向某一种表型的转化，对M1 和M2 极化平衡的影响以及随时间变化的规律值得关注。除了小胶质细胞，iAr 也可能直接作用于神经元，对神经元缺血缺氧后的兴奋性毒性、细胞凋亡、焦亡等发挥保护作用，都未见研究报道。对以上这些问题的深入研究，对于理解iAr 优于iH2的细胞学机制会有很大的帮助。
然而，本研究只观察了两种气体在CIR 损伤后24 h 这一时间点的神经保护作用，并没有对两种气体的中长期效果进行比较，下一步可以考虑采用磁共振对脑梗死的体积进行长期的监测。此外，本研究采用的是小鼠tMCAO 模型，还可以考虑在大动物模型上，比如比格犬、小香猪、灵长类动物等，开展临床前的疗效观察和机制研究。尽管存在这些局限性，但本研究明确指出了在AIS 的急性期，再灌注前iAr在神经功能改善和皮层脑区梗死占比两方面，确实表现出比iH2更好的神经保护效果。本研究不仅加深了对iAr 神经保护作用的认识和理解，也为iAr 未来在临床进行转化，并应用于AIS 急救提供了重要的实验依据。
猜你喜欢 保护剂皮层神经功能 视皮层神经元结构可塑性研究进展中华实验眼科杂志(2022年6期)2022-11-15综合康复护理干预对脑卒中患者抑郁及神经功能康复的疗效中国典型病例大全(2022年10期)2022-05-10老年精神分裂症患者采用利培酮结合银杏叶胶囊治疗对神经功能的改善效果中国典型病例大全(2022年9期)2022-04-19导电油墨中保护剂与银表面相互作用机理包装工程(2022年3期)2022-02-22DJB-823保护剂对典型航空电连接器 腐蚀行为的影响装备环境工程(2021年2期)2021-03-08集束化康复护理对脑梗死患者神经功能和日常生活能力的影响中华养生保健(2021年18期)2021-02-13逐瘀祛痰法中西医结合治疗对脑梗塞患者神经功能的影响医学概论(2021年18期)2021-01-21浅谈涂覆溶剂型保护剂对金属表面外观的影响因素中国电气工程学报(2020年5期)2020-10-27D2DR影响运动疲劳后皮层信息输出的作用机制首都体育学院学报(2019年5期)2019-10-18辛伐他汀对高胆固醇血症大鼠APP、BACE蛋白表达的影响中国当代医药(2017年17期)2017-07-25
