人工神经红蛋白的亚硝酸盐还原酶活性研究
时间：2023-01-15 11:50:08 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
董 硕,董 钥,孔祥君,林英武,杜可杰
(南华大学 化学化工学院,湖南 衡阳 421001)
一氧化氮(NO)在哺乳动物各种生理和病理过程中起着关键作用，这些过程大多涉及细胞间信号传导和细胞-母体响应[1-2]。在体内主要由NO合成酶进行合成[3]。对于哺乳动物来说，在缺氧条件下，NO合成酶活性下降，则依赖亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,NIR)将亚硝酸盐还原为一氧化氮(NO)[4-7]。NIR广泛存在自然界中，天然的NIR主要分为铜类亚硝酸盐还原酶(CuNIR)和血红素类亚硝酸盐还原酶(cd1NIR)两大类[8-9]，其中，血红素类蛋白中血红蛋白(Haemoglobin)、肌红蛋白(Myoglobin)、细胞色素c(Cytochromec)、细胞色素bc1(Cytochromebc1)以及线粒体电子传递链的细胞色素c氧化酶(Cytochromecoxidase)等都有相关亚硝酸盐还原酶活性的报道[10-11]。例如在人体中，通过血红蛋白的亚硝酸盐还原来调节血压、缺氧血管舒张、血小板活化和细胞对缺氧状态的适应等[12-13]。
人的神经红蛋白(neuroglobin,Ngb)是本世纪初由德国科学家T.Burmester等人[14]发现，作为一种典型的血红素蛋白，近年来其体外生物活性研究得到广泛关注[4,15]。该蛋白拥有六配位b型血红素，轴向配位为His64/His96，其中His64可以被NO、O2等小分子取代，因此展现一些如亚硝酸盐等生物活性。M.T.Gladwin等人[10]发现Ngb血红素配位情况的改变会调控NIR活性，蛋白中心血红素位点空腔的变化会直接关系到NIR活性强弱，通过对46位点和55位点的人工设计形成稳定的五配位血红素中心，其NIR活性比野生型六配位活性中心的神经红蛋白要快近2 000倍。随后，该课题组对神经红蛋白突变体进一步研究发现[12]，将64位点进行突变为丙氨酸，得到具有更大活性空腔的五配位血红素中心的Ngb，其NIR活性远远高于之前报道过的Ngb。因此，Ngb的血红素中心的配位构型及其活性空腔对其生物活性起了较大的影响。通过理性设计将Ngb的64位点的组氨酸(His64)突变为甲硫氨酸(Met64)得到五配位Ngb[16]，同时为了减少Ngb分子间的二聚，将120位点突变为半胱氨酸(Cys)，最终突变得到H64M/C120S Ngb，并对其亚硝酸盐还原活性进行了研究。结果表明，突变体H64M/C120SNgb在低氧条件下同样表现出比WT Ngb更优秀的NIR活性。
1.1 试剂和仪器
试剂：BL21(DE3)大肠杆菌、XL10 Gold菌质粒提取试剂盒(QIAGEN，德国)、连二亚硫酸钠(阿拉丁，上海)、亚硝酸钠(阿拉丁，上海)。实验所用试剂均为分析纯。
仪器：紫外-可见分光光度计(UV-Vis，Aglient 8453)、液相色谱-质谱联用仪(LC-MS，Waters Xevo G2-XS QTof)、电子顺磁共振波谱仪(EPR，Bruker A300)等。
1.2 蛋白的表达与纯化
野生型神经红蛋白(WT Ngb)通过将包含Ngb基因的pET3a质粒导入到BL21(DE3)大肠杆菌中表达获得。其突变体H64M/C120S Ngb蛋白表达过程与前面过程一致。蛋白表达和纯化步骤参照之前的实验方法[16]，并作出适当调整，蛋白浓度通过吸光度计算得到，WT Ngb和H64M/C120 Ngb摩尔消光系数分别为ε413=129 L/(mmol·cm)、ε405=150 L/(mmol·cm)。
1.3 质谱表征
突变体蛋白质谱数据在电喷雾电离质谱仪上测得。将H64M/C120S Ngb样品脱盐处理后，与1%的甲酸(体积比为水∶甲酸=99∶1)混合，蛋白混合溶液转移到样品室，在正离子模式测量。使用软件MaxEnt1将多电荷峰处理得到蛋白质分子量。
1.4 NIR活性研究
通过紫外-可见分光光度计检测在定量蛋白酶(10 μmol/L)存在并加入还原剂后的亚硝酸盐光谱变化，来表征蛋白酶的亚硝酸盐活性。该反应体系在常温(25 ℃)无氧条件下进行，缓冲体系采用磷酸盐缓冲液(pH=7.4, 100 mmol/L)，所有溶液使用前均充分除氧，并充入高纯N2进行保护备用。将Ngb加入密封比色皿中除氧，用密封注射器依次添加2.5 mmol/L连二亚硫酸钠和适当浓度梯度的亚硝酸钠溶液，立即监测亚硝酸盐还原前后的光谱变化。表观速率常数(kobs，s-1)由脱氧神经红蛋白Q带的吸光度和时间拟合得到式(1)。
y=y0+ae-kt
(1)
亚硝酸盐还原的分子速率常数(knitrite,L/(mol·s))由表观速率常数和亚硝酸盐浓度线性拟合得到。
1.5 电子顺磁共振波谱研究
还原态下WT Ngb及其突变体H64M/C120S Ngb波谱通过Bruker A300电子顺磁共振(electron paramagnetic resonance,EPR)波谱仪进行检测。该反应在专用石英EPR管中进行，将WT Ngb或H64M/C120S Ngb(0.15 mmol/L)与连二亚硫酸钠(30 mmol/L)混合，彻底除氧后通入高纯N2，再加入除氧NaNO2(15 mmol/L)，在90 K下检测其电子顺磁共振波谱图。
2.1 突变体蛋白纯化及表征
为了对突变体蛋白H64M/C120S Ngb进行明确的表征，对其纯化后的样品进行了质谱测试。结果显示其分子量为16 909.5 Da(图1)，与脱辅基蛋白计算值相吻合，可以确定纯化所得蛋白即为目标蛋白，同时也说明采用的纯化方法适用于本突变体蛋白的纯化。在之前我们组的研究中发现，H64M/C120S Ngb突变体蛋白相较于WT Ngb和Cyt c，64位点组氨酸(His)被蛋氨酸(Met)取代后自氧化形成SO-Met，并进一步自氧化生产SO2-Met[16]。不同于野生型神经红蛋白的六配位情况，H64M/C120S Ngb由于Met的引入，形成五配位结构，该五配位结构形成了一定的蛋白空腔，并且为蛋白活性中心的血红素铁中心结合外源氧化还原试剂或底物提供了条件。
图1 H64M/C120S Ngb质谱图
2.2 亚硝酸盐还原酶活性研究
和其他血红素蛋白一样，神经红蛋白在厌氧条件下具有一定的亚硝酸盐还原酶活性。为了研究突变体蛋白H64M/C120S Ngb构象的改变对其亚硝酸盐还原酶活性的影响，在准一阶条件下测定了不同浓度NaNO2下的蛋白NIR活性研究。在过量Na2S2O3存在下，在加入NaNO2后，蛋白将亚硝酸盐还原，产生的NO结合到血红素铁中心，即还原状态的Ngb紫外-可见光谱由脱氧形式转变为NO结合状态。紫外-可见光谱图显示，无论是WT Ngb还是H64M/C120S Ngb在557 nm处均出现不同程度的降低(见图2(a)，(c))，WT Ngb蛋白在557 nm处出现明显的下降。H64M/C120S Ngb由于亚硝酸盐活性过快，因此，加入NaNO2测定立即测定，其在557 nm处的紫外吸收峰已经大幅度降低，这与J.Tejero等人之前的研究结果一致[12]。这说明六配位活性中心WT Ngb的活性依赖His的解离速率，而五配位H64M/C120S Ngb的不存在配位中心的解离，大大的提高了其亚硝酸盐还原速率。其亚硝酸盐的还原可以通过方程来表示：
(1)
(2)
通过对表观速率常数kobs和NaNO2浓度进行线性拟合得到该蛋白还原亚硝酸盐的二级速率常数knitrite。计算结果显示，突变体蛋白H64M/C120S Ngb的knitrite达到了487 L/(mol·s)，远远高于天然神经红蛋白(WT Ngb)所显示的活性(0.44 L/(mol·s))，与文献中报道的数据(0.52 L/(mol·s))非常接近。结果显示通过对神经红蛋白血红素活性中心构象的改变，使NIR活性提高了超过1 000倍(见图2(b)，(d))。对目前报道的类似蛋白及其突变体的亚硝酸盐还原二级速率常数knitrite以进行横向对比(见表1)，通过对比发现，双突变体H64M/C120S Ngb具有较高的活性，这说明五配位结构及64位的蛋氨酸的引入，能够显著增强其亚硝酸盐还原酶活性，但是由于反应太快，导致NaNO2加入后紫外-可见光谱的迅速变化，而且所有的反应是在无氧密闭的条件下进行，对反应紫外检测的速率提出来较大的挑战，目前快速停留分析光谱仪器不能进行无氧操作，如何精准测量无氧条件下的紫外-可见光谱变化是今后需要解决的重要问题。
表1 各血红素蛋白亚硝酸盐还原酶活性的kNitrite比较
图2 WT Ngb和H64M/C120S Ngb的亚硝酸钠反应紫外-可见光谱图以及表观速率常数与亚硝酸盐浓度的线性拟合图
2.3 EPR研究
为了进一步提供Ngb及其突变体的亚硝酸盐还原的信息，对蛋白结合NO的复合物进行EPR研究。电子顺磁共振波谱图可以证明顺磁性物质亚硝酰基血红素铁的存在(见图3)。低温条件下(90 K)，H64M/C120S Ngb在还原亚硝酸盐时，形成了亚铁血红素结合NO独特的超精细的峰。H64M/C120S Ngb-NO(g⊥=2.037，g∥=1.981)和WT Ngb(g⊥=2.034，g∥=1.980)均是A型裂分峰信号，即NO与蛋白中心Fe的键合方向是与卟啉分子平面垂直的。这与M.Tiso等人[18]观察到的人的神经红蛋白亚硝酰基血红素铁EPR峰形一致。研究结果说明在还原条件下，H64M/C120S Ngb中心铁原子可以与NO进行较好的结合。
图3 0.15 mmol/L还原态下的WT Ngb和H64M/C120S Ngb与15 mmol/L NaNO2反应得到的电子顺磁共振波谱图
本实验以人的Ngb为模型，在其轴向配位引入一个Met，构建得到突变体蛋白H64M/C120S Ngb，结果显示其亚硝酸盐还原速率常数knitrite为(487±23) L/(mol·s)，比WT Ngb提高了近1 000倍。EPR结果显示，NO与血红素中心Fe以垂直于卟啉分子的方向进行结合，同时表明五配位血红素中心相对于六配位活性中心的血红素蛋白，在亚硝酸盐还原酶活性表达过程中，不需要经历配位点的解离，有利于亚硝酸盐还原酶的活性提高。
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