CsZFP2,基因的克隆及其在烟草中的抗旱功能分析
时间：2022-12-09 12:35:03 来源：柠檬阅读网 本文已影响 人 
李婉雪，姚新转，张宝会，刘 洋
（1.贵州大学茶学院,贵州 贵阳 550025；
2.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室/山地生态与农业生物工程协同创新中心,贵州 贵阳 550025；
3.贵州大学烟草学院，贵州 贵阳 550025）
【研究意义】植物在生命周期中会受到如水涝、干旱、冷害等非生物胁迫，影响其生长发育。烟草是我国重要经济作物之一，良好的生态环境能让烟草正常生长发育，产出品质优良的烟叶，然而在烟草生长过程中会遭受多种逆境胁迫，影响其产量。在以往研究中发现锌指蛋白（zinc finger protein）属于III 型转录因子，它广泛分布于生物体内，是调控诸多生理生化反应的一类核酸蛋白，调控植物的生长发育和非生物胁迫响应。因此本研究克隆了茶树中CsZFP2 基因并对该蛋白的组织特异表达及干旱胁迫下的基因表达进行分析，为研究CsZFP2 基因对干旱响应及抗旱分子机理研究提供参考。【前人研究进展】类黄酮是植物体内重要的次生代谢物质，它作为重要的活性物质，具有抗氧化、心血管保护等作用，广泛应用于医疗、保健、食品等行业。在以往研究中发现，类黄酮3′,5′-羟化酶（flavonoid 3′,5′hydroxylase,F3′5′H）是茶树类黄酮生物的催化酶之一，以影响花色而出名，但B环的羟基化程度和部位与类黄酮结构稳定性、抗氧化功能有着密切关系[1]。所以类黄酮在植物的生长发育和抵御逆胁迫等方面发挥重要功能[2]。外界环境条件影响植物的生长和发育，植物为了适应外界的逆境条件，进化出了一系列生理及分子响应机制[3-5]，调节植物的生理生化、蛋白及基因等各方面。高温、高盐、干旱等非生物胁迫会影响烟草的正常生长发育，干旱胁迫使烟草叶片脱水变枯，严重影响其品质成分的积累，降低经济效益。而胁迫响应可以通过转录调控来实现，在干旱胁迫环境下，提高抗氧化系统活性，清除细胞内过量的自由基和过氧化物，抑制膜脂质过氧化和保护细胞细胞膜的完整性。对与F3′5′H 基因启动子区域互作的锌指蛋白进行生物信息学生物信息学分析和相关功能验证，预测可能参与了高温、高盐、干旱等逆境响应，将锌指蛋白转入烟草后增强烟草的耐旱性，有利于进一步阐明锌指蛋白基因表达模式，为培育抗逆性强的烟草奠定基础。锌指蛋白基因家族是植物最大的基因家族之一[6]，其特征为锌指域由半胱氨酸和组氨酸结合锌离子形成[7]。锌指蛋白（ZFPs）在生理和生物化学过程中具有重要的作用，其中就包括非生物胁迫[8]。在逆境胁迫方面已有一些报道，例如，刚毛怪柳（Tamarix hispida）中锌指蛋白ThZFP1 在拟南芥中过表达，增加了POD 和SOD 活性、脯氨酸含量，增加了相关基因如P5CS、SOD 和POD 的表达，最终增加了对盐胁迫和渗透胁迫的抗性[6]。水稻中转录因子ART1通过影响铝胁迫相关基因的表达增加水稻对铝胁迫的抗性[9]；
在干旱胁迫下，ZFP245 的过表达增强了SOD 和POD 的活性，表明ZFP245 可能通过激活植物体内的酶活活性，从而提高水稻的耐旱性[10]。【本研究切入点】有研究结果表明锌指蛋白能够调控植物的生长发育和应对非生物胁迫，然而关于茶树锌指蛋白的研究有待深入进行。【拟解决的关键问题】通过对CsZPF2 进行生物信息学分析，预测其潜在分子功能，利用农杆菌介导法将CsZPF2基因转入烟草，进行干旱胁迫下的功能验证，观察自然干旱后烟草的变化，进一步了解茶树锌指蛋白在烟草中的抗旱机理，为后续培育耐旱烟草新种质和进一步研究超量表达CsZPF2 烟草对干旱胁迫耐受机制提供参考。
1.1 试验材料
供试材料为烟草（Nicotiana tabacun"Xanthin"）。
1.2 基因克隆与载体构建
本实验室在前期工作中已通过酵母单杂筛选出一个与F3′5′H 基因启动子区域互作的锌指蛋白，首先利用Primer5.0 软件设计CsZPF2目的基因引物，以cDNA 的第一链为模板，克隆目的基因保守片段，获得扩增的目的基因后，以酶切PCR 产物为模板，质粒用SalI、SacI 双酶切，回收连接，将目的基因正向和反向整合到载体的启动子和终止子之间，构建超量表达载体（图1）。
图1 锌指蛋白转录因子的过表达载体Fig. 1 Overexpression vector of ZFP transcription factor
1.3 锌指蛋白cDNA 编码产物同源序列比对分析
在 NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索出不同物种的锌指蛋白，并与CsZFP2锌指蛋白序列排列比较（DNAMAN,MegAlign Program,Clustal W method）。利用DNAMAN 软件进行同源序列比对，构建系统进化树。
1.4 烟草遗传转化及分子鉴定
用农杆菌介导法遗传转化至烟草叶片，取实验室培养好的烟草无菌苗,切成方片，置于农杆菌溶液中侵染8～10 min，将侵染的叶片取出,用无菌滤纸将农杆菌菌液吸干,置于共培培养基中暗培养2 d 后接种在含有Kan 抗生素培养基上进行培养，再置于无菌培养室25 ℃光照培养,每2 周继代1 次,30 d 后观察茶树愈伤生长情况。
以实验室无菌苗作为外植体，通过农杆菌介导的共转化法[11]进行遗传转化。待移栽植株成活后剪取叶片进行β-葡糖苷酶（β-glucosidase,GUS）组织化学染色，利用CsZFP2 序列设计检测引物，初步鉴定完毕后再从植株叶片中提取基因组DNA 用于PCR鉴定。
1.5 qRT-PCR
提取自然干旱条件下胁迫处理前、后的转基因烟草和野生型烟草叶片总RNA，将反转后得到的cDNA 作为模板。根据CsZFP2基因序列，设计qRTPCR 扩增引物，通过qRT-PCR 分析相关基因的相对表达量。引物设计序列：
F：GGAGCCCTTCAGACATCAATTA；
R：CTGCACAAGAACTGCCAAAC。
内参对照为烟草 β -actin 基因，
F：5"-TGGTTAAGGCTGGATTTGCT-3"；
R：5"-TGCATCCTTTGACCCATAC-3"。
qRT-PCR 扩增体系及反应条件参考刘洋[12]，每个基因设置3 个重复。
1.6 烟草的干旱胁迫处理
选取5～6 叶期（炼苗移栽后15 d）、长势及大小一致的转基因及野生型植株为材料，进行自然干旱处理，分别于处理后的0、7、14、21、28 d 剪取烟草叶片，所有样品均放入液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱备用。
1.7 数据分析
所有试验数据各平均值差异性的统计学分析利用SPSS 22.0 软件包完成。
2.1 茶树ZPF 基因家族成员鉴定及理化性质预测
通过搜索比对，将候选基因提交到ExPASy、NCBI 等在线网站验证其保守域的结构，最终得到11 个物种的锌脂蛋白基因，进一步分析该基因编码蛋白质的理化性质（表1），结果显示：11 个物种的锌指蛋白基因有5 个可以定位在染色体上，其余6 个物种尚不清楚，他们的内含子数相似，最少11 个，最多14 个，其中大多数物种有13 个内含子数；
蛋白长度最短的物种为猕猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis）1 202 aa，最长为灰山杜鹃（Rhododendron griersonianum）、笋 瓜（Cucurbita maxima）、南瓜（Cucurbita moschata）1 256 aa，理论等电点(pI)介于5.62 猕猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis）～5.97 南瓜（Cucurbita moschata）之间，发现11 个物种的ZPF 基因Pi＜7，表明这11 个物种锌指蛋白富含酸性氨基酸。
表1 11 个物种锌指蛋白基因的特征Table 1 Characteristics of ZFP genes in 11 species
2.2 CsZPF2 编码蛋白质的二级结构与三级结构预测
预测CsZPF2 蛋白质的二级结构，结果显示CsZPF2编码蛋白质具有51.34% α-螺旋，37.39%无规则卷曲，7.95% 延伸链，3.33% β-转角，说明 螺旋为CsZPF2 编码蛋白质的主要二级结构（图2）。利用Phyre2 在线软件构建CsZPF2三级结构（图3），分析预测结果表明该蛋白为α-螺旋、β-转角组成无规则卷曲的三维空间结构。
图2 CsZPF2 编码蛋白质的二级结构预测Fig. 2 Predicted secondary structure of CsZPF protein
图3 茶树ZPF2 编码蛋白质的三级结构预测Fig. 3 Predicted tertiary structure of CsZPF protein
2.3 蛋白质亲疏水性分析和亚细胞定位预测
对CsZPF2 编码蛋白质的氨基酸序列进行亲水性分析（图4）。其中大于零部分多于50%为疏水性蛋白，小于零部分多于50%为亲水性蛋白，结果表明，CsZPF2 编码蛋白为亲水性蛋白。通过Cell-PLoc 2.0软件预测CsZPF 编码蛋白亚细胞定位在细胞核。
图4 CsZPF2 编码蛋白质序列的亲疏水性分析Fig. 4 Hydrophilicity and hydrophobicity of CsZPF2 protein sequence
2.4 CsZPF2 基因序列同源比对及进化树分析
将CsZPF2 的cDNA 序列进行Blastx 分析，结果显示，11 个不同物种植株中锌指蛋白都有很高的同源性，其中茶树（Camellia sinensis，XM_028257969.1）锌指蛋白的蛋白结构域与灰山杜鹃（Rhododendron griersonianum，KAG5536119.1）的锌指蛋白相似性为 85%，与猕猴桃（Actinidia chinensis var.Chinensis，PSR84926.1）的锌指蛋白相似性为82.82%，与甜樱桃（Prunus avium，XP_021810862.1）的锌指蛋白相似性为73.60%,与水蜜桃（Prunus persica，ONI09200.1）的锌指蛋白相似性为73.30%，杏花（Prunus armeniaca，CAB4311713.1）的锌指蛋白相似性为73.00%，与笋瓜（Cucurbita maxima，XP_023002699.1）的锌指蛋白相似性为71.20%，与烟草（Nicotiana tabacum，XP_016463943.1）的锌指蛋白相似性为68.57%。选取同源性比较高的物种氨基酸序列进行系统进化树分析，结果显示，在进化过程中锌指蛋白基因与猕猴桃和灰山杜鹃有较高的同源性（图5、6）。
图5 茶树锌指蛋白与其他物种的蛋白质序列同源比对Fig. 5 Homologous analysis on ZPF protein sequences of various species
2.5 干旱处理对转CsZPF2 基因烟草的影响
本研究对 5～6 叶期的烟草进行了自然干旱胁迫处理，将长势一致的野生烟草及转基因烟草移栽至室外，相同条件下自然干旱28 d 后，观察其表型。在干旱28 d 后，两组材料底部叶片均明显发黄，但野生型烟草底部叶片基本完全失绿，呈枯萎状态，而转基因烟草底部叶片呈轻度萎蔫状态，大部分仍然呈现绿色。结果表明，转基因烟草的耐旱性优于野生型烟草（图7）。
图6 茶树锌指蛋白与其他物种锌指蛋白基因的系统进化分析Fig. 6 Phylogenetic relationship between ZFP of C.sinensis and other species
图7 干旱胁迫对烟草植株生长的影响Fig. 7 Effect of drought stress on growth of tobacco plants
锌指蛋白普遍存在于植物中，在调节植物生长发育以及非生物应答等多种生命过程中有重要作用。在水稻中鉴定出一组A20/AN1 类型锌指蛋白，包括ZFP157 基因能够诱导低温、干旱及盐胁迫[13]。在烟草中过表达ZFP177 能够提高烟草对高温及低温的抗性[14]。在拟南芥中过表达AtSAP5 基因能够提高拟南芥的抗旱性[15]。植物在干旱的逆境胁迫中，SAP类锌指蛋白部分成员的抗旱功能在水稻及拟南芥等多个物种中得到了验证。本实验室在前期工作中通过酵母单杂筛选出一个与F3′5′H 基因启动子区域互作的锌指蛋白，从茶树中克隆到一个锌指蛋白基因，将命名为CsZPF2，该基因CDS 全长为4 269 bp，蛋白编码长度为1 233 aa，具有保守的A20 与N1 锌指蛋白结构域。锌指蛋白基因在猕猴桃和灰山杜鹃中具有相应同源基因且同源性较高，预测CsZPF2 编码蛋白是亲水性且为酸性蛋白，α 螺旋为蛋白主要二级结构，预测亚细胞定位于细胞核。茶树（Camellia sinensis）锌指蛋白的蛋白结构域与灰山杜鹃（Rhododendron griersonianum）的锌指蛋白进化关系最近，序列相似性为85%。烟草中过表达ZFP177基因烟草对干旱胁迫更敏感，表明ZFP177 可能提高烟草对干旱的抗性[16-20]。野生型烟草和转基因烟草在经过28 d 自然干旱胁迫处理后，转基因植株与野生型植株相比更具耐旱性，验证了该基因在烟草抗旱的生理过程中发挥功能。
本研究从茶树中克隆到一个CsZPF2 基因，其具有保守的 A20 与 N1 锌指蛋白结构域。CsZPF2 基因在多个物种中具有相应同源基因，在栽培烟草三星中CsZPF2 基因的过表达使转基因烟草呈现出抗旱表型，表明该基因参与烟草抗旱早期应答的调控过程且能够增强烟草抵抗干旱胁迫能力。目前,对于茶树锌指蛋白的研究尚处于基因克隆、结构鉴定与表达分析等层面上，本研究表明过表达CsZPF2 基因能够提高烟草的抗旱能力,并且从生物学功能方面验证了CsZPF2 基因在烟草抗旱方面的功能,对利用转录因子提高作物的抗逆性提供重要的参考价值，为作物逆境胁迫提供了重要候选基因,为培育抗旱烟草新品种提供参考。
猜你喜欢 抗旱茶树编码 坚持人民至上、生命至上 扎实做好防汛抗旱救灾工作江苏安全生产(2022年9期)2022-11-02HEVC对偶编码单元划分优化算法北京航空航天大学学报(2022年8期)2022-08-31茶树吸收营养物质的特性茶道(2022年3期)2022-04-27住院病案首页ICD编码质量在DRG付费中的应用中国典型病例大全(2022年7期)2022-04-22中国西南 茶树和中华茶文化的起源云南画报(2021年10期)2021-11-24茶的箴言延河·绿色文学(2016年8期)2016-05-14云南：抗旱保苗促春耕农产品市场周刊(2014年20期)2014-09-02美丽的山茶树小学生导刊(中年级)(2014年4期)2014-05-09倾力支持农民抗旱浇麦保丰收金融周刊(2014年4期)2014-04-16论纪录片影像中的组合编码运用电影新作(2014年2期)2014-02-27
